Name: Analisi dellautofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Scopri come indurre l'autofagia nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster mediante deplezione di aminoacidi e analizzare i cloni mutanti. Questo metodo permette di studiare la risposta cellulare alla disponibilità nutrizionale.

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Siamo grati a THFC e BDSC per aver fornito le varietà di mosche. Il Dr. Tong Chao è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) e dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali. Ringraziamo la struttura principale del Life Sciences Institute (LSI) per la fornitura di servizi.

1. Incrocio della Drosophila e deposizione delle uova
<ol><li>Introdurre 3 moscerini adulti maschi (genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) e 15 femmine (genotipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) in un flaconcino di coltura (con farina di mais/melassa/agar Drosophila media standard a 25 °C) per l'accoppiamento. NOTA: Devono essere installati più flaconcini di coltura della stessa croce per garantire un numero sufficiente di larve per ulteriori esperimenti. Il ceppo di mosca maschio con genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a trasporta un sito FRT sul cromosoma X vicino al centromero (FRT19A). Esprime anche FLP in caso di shock termico a 37 °C. Un transgene con espressione RFP ubiquitaria viene inserito sul cromosoma X. GFP-Atg8a è espresso sotto il controllo di cgGal4 nel corpo grasso larvale22. Il ceppo di mosca femmina con genotipo y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP porta una mutazione letale (Mu) e FRT19A sul cromosoma X. Lo schema di attraversamento dettagliato è mostrato nella figura 1.</li>
	<li>Per la deposizione delle uova, trasferire le mosche in una nuova fiala di coltura. A 48 ore dall'introduzione, picchiettare la fiala "accoppiamento" fino a quando le mosche non sono stordite e cadere sul supporto alla base della fiala.<ol><li>Scollegare il flaconcino di "accoppiamento" e coprirne la bocca con un flaconcino invertito scollegato con supporti freschi (flaconcino di coltura fresca). Quindi, trasferire le mosche nella fiala di coltura fresca capovolgendo e picchiettando le fiale.</li>
		<li>Collegare il flaconcino di coltura fresca (con le mosche trasferite) e gettare il vecchio flaconcino di coltura. Porre questo flaconcino di coltura fresca in un'incubatrice a 25 °C per la deposizione delle uova sul terreno fresco. NOTA: Il preriscaldamento delle fiale di coltura fresca a 25 °C per 15 minuti prima del processo di trasferimento delle mosche aiuterà le mosche ad adattarsi rapidamente al nuovo ambiente e ad accelerare la deposizione delle uova.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere le mosche dopo 6 ore di deposizione delle uova. Se gli esperimenti devono essere ripetuti, trasferire questi moscerini in un'altra fiala di coltura (come descritto al punto 1.2). Altrimenti, scartare le mosche gettandole in un matraccio contenente il 75% di etanolo).<ol><li>Incubare il flaconcino con embrioni a bagnomaria a 37 °C per 1 ora per indurre l'espressione di FLP. Successivamente, metterli in un incubatore a 25 °C e consentire agli embrioni di continuare a svilupparsi. NOTA: La riuscita formazione di cloni mutanti può essere confermata successivamente attraverso l'imaging. L'assenza di segnali RFP segna i cloni mutanti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. La fame di aminoacidi induce l'autofagia
<ol><li>Utilizzando una spatola da laboratorio, raccogliere i terreni contenenti le larve in via di sviluppo in una capsula di Petri 75 ore dopo la deposizione delle uova. Aggiungere 3 ml di 1x PBS al piatto e separare delicatamente i terreni di coltura e le larve usando una pinza lunga. Seleziona da 10 a 15 larve all'inizio del terzo stadio. NOTA: Le larve del terzo stadio devono essere scelte con attenzione. La fase di sviluppo delle larve è fondamentale per il successo di questo protocollo. A causa della limitata durata della deposizione delle uova, la maggior parte delle larve nella fiala di coltura dovrebbe essere nella fase iniziale del terzo stadio entro 75 ore di incubazione. Tuttavia, diverse ricette di terreni di coltura possono portare a variazioni nei tempi di sviluppo delle larve. I criteri per distinguere le larve del terzo stadio precoce sono la lunghezza del corpo, la presenza di spiracoli anteriori e posteriori, nonché i ganci mandibolari dell'apparato boccale23.</li>
	<li>Riempire i pozzetti di una piastra spot di depressione di vetro a 9 pozzetti (vedi Tabella dei materiali) con 1x PBS. Posizionare le larve separate del terzo stadio nei pozzetti usando una pinza lunga e lavare accuratamente le larve per rimuovere tutti i residui di media.</li>
	<li>Prendere 5 ml di soluzione di saccarosio al 20% (in 1x PBS) in una fiala vuota e posizionare le larve pulite del terzo stadio in questa soluzione usando una pinza lunga. Incubare questo flaconcino in un incubatore a 25 °C per 6 ore prima di raccoglierli per la dissezione. NOTA: La soluzione di saccarosio al 20% (in 1x PBS) funge da mezzo di fame carente di aminoacidi.</li>
</ol>3. Dissezione delle larve del terzo stadio e trattamento del tessuto del campione
<ol><li>Affilare due paia di pinze #5 (vedi Tabella dei materiali) uniformemente su entrambi i lati con una pietra affilante.</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di 1x PBS in ciascun pozzetto della piastra spot di depressione di vetro a 9 pozzetti e trasferire le larve nei pozzetti con una pinza lunga. Metti una larva in un pozzo con il lato dorsale (il lato con la trachea) rivolto verso l'alto.<ol><li>Afferrare la cuticola della larva con due pinze #5 nel mezzo del tronco larvale e strappare delicatamente le cuticole. I corpi grassi esposti, insieme ad altri tessuti larvali interni, saranno ancora attaccati alla carcassa della larva. Tirare abbastanza per esporre gli organi interni il più possibile. Ripeti questo passaggio per tutte le larve. NOTA: Ogni larva ha due grandi pezzi di corpo grasso lungo il tronco del corpo. Il tessuto corporeo grasso è un monostrato bianco, opaco e piatto che può essere facilmente distinto al microscopio a dissezione24.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire la carcassa larvale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 500 μL di paraformaldeide (PFA) al 4%. Incubare per 30 minuti a 25 °C senza agitare i tubi. ATTENZIONE: il 4% di PFA è tossico. Indossare guanti e maschere per la protezione. NOTA: si consiglia di preparare il 4% di PFA in 1x tampone PBS. La polvere di PFA non si dissolve istantaneamente in 1x PBS. Pertanto, la miscela deve essere incubata a 65 °C in un incubatore per una notte o agitata a intermittenza per 45 minuti a 25 °C.</li>
	<li>Dopo 30 minuti di incubazione della carcassa con PFA al 4%, pipettare la soluzione di PFA, aggiungere 500 μL di 1x PBS nel tubo e agitare delicatamente il tubo su un rotatore piatto per 10 minuti prima di scartare la soluzione 1x PBS (ripetere 3x).</li>
	<li>Usando una pinza lunga, trasferire la carcassa larvale fissa e lavata in un pozzo nella piastra spot a 9 depressioni riempita con 1x PBS. Utilizzando una pinza # 5, rimuovere tutti i tessuti del corpo non grassi.</li>
	<li>Utilizzare una pinza #5 per montare i pezzi del corpo grasso su un vetrino da microscopio usando l'80% di glicerolo come mezzo di montaggio e posare un coprislip sulla parte superiore. NOTA: Prima di montare, controllare il pH del glicerolo all'80% (utilizzando carte pH, pH = 7 è ottimale) per proteggere il segnale GFP. I supporti di montaggio (vedi Tabella dei materiali) con DAPI in glicerolo all'80% aiuteranno nell'imaging dei nuclei delle cellule del corpo adiposo. Questi vetrini sono stabili per 1 settimana se conservati al buio a 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+Molecular+machinery+for+self-eating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li>
<li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%3A+Management+of+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li>
<li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eaten+alive%3A+A+history+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li>
<li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagosome%3A+Origins+unknown%2C+biogenesis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosomes%2C+phagosomes%2C+autolysosomes%2C+phagolysosomes%2C+autophagolysosomes...Wait%2CI%27mconfused%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li>
<li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li>
<li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li>
<li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li>
<li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Atg5%2FAtg7-independent+alternative+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li>
<li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li>
<li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li>
<li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li>
<li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila%3A+It%27s+more+than+just+a+garbage+chute%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li>
<li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li>
<li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F%2FDp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753(2021).</li>
<li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemerec%2C+M+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).</li>
<li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+fat+body+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li>
<li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li>
<li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li>
<li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180(2021).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il presente protocollo descrive i metodi per (1) generare mosche che trasportano cloni mutanti nei corpi grassi larvali, (2) indurre l'autofagia attraverso la fame di aminoacidi e (3) sezionare i corpi grassi larvali. Per generare cloni con successo nei corpi grassi larvali, i seguenti passaggi critici devono essere eseguiti diligentemente. (1) La tempistica accurata dello shock termico è fondamentale perché la ricombinazione mitotica avviene solo quando il tessuto è sottoposto a mitosi e (2) sia la temperatura che la du...

L'autofagia è un processo di "auto-alimentazione" indotto da vari stress, tra cui la fame di aminoacidi1. La macroautofagia (di seguito denominata autofagia) è il tipo più studiato di autofagia e svolge un ruolo insostituibile nel mantenimento dell'omeostasi cellulare2. Il malfunzionamento dell'autofagia è associato a diverse malattie umane3. Inoltre, alcuni geni correlati all'autofagia sono potenziali bersagli per il trattamento di varie malattie4. 
L'autofagia è regolata in modo altamente sofisticato5. Dopo la fame, le membrane di isolamento sequestrano materiali citoplasmatici per formare autofagosomi a doppia membrana6. Gli autofagosomi si fondono quindi con endosomi e lisosomi per formare anfisomi e autolisosomi. Con l'aiuto degli enzimi idrolitici lisosomiali, il contenuto citoplasmatico inghiottito viene degradato e i nutrienti vengono riciclati7. 
L'autofagia è un processo evolutivamente conservato8. Drosophila melanogaster è un ottimo modello per studiare il processo di autofagia in vivo. La fame di aminoacidi induce facilmente l'autofagia nel tessuto corporeo grasso della mosca, un analogo del fegato umano e del tessuto adiposo9. I difetti nell'autofagia interrompono i distinti schemi di punteggiatura di diverse proteine correlate all'autofagia, come Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 e p62, tra gli altri10. Pertanto, l'analisi dei modelli di questi marcatori di autofagia aiuterà a discernere il verificarsi di difetti di autofagia e la fase di autofagia difettosa. Ad esempio, la proteina simile all'ubiquitina Atg8 è il marcatore di autofagia11 più comunemente usato. In Drosophila melanogaster, sono stati sviluppati con successo ceppi transgenici con una proteina fluorescente verde (GFP) Atg8a12. GFP-Atg8a è diffuso nel citosol e nei nuclei delle cellule alimentate. Dopo la fame, GFP-Atg8a viene elaborato e modificato dalla fosfatidiletanolammina (PE) e forma puncta, che etichetta le membrane di isolamento e gli autofagosomi completamente sviluppati13,14. Attraverso la microscopia a fluorescenza diretta, l'induzione dell'autofagia può essere facilmente osservata come un aumento della formazione di GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta non si formerebbe in risposta alla fame in presenza di un difetto di iniziazione dell'autofagia. Poiché GFP-Atg8a può essere estinto e digerito dal basso pH negli autolisosomi, GFP-Atg8a puncta può aumentare di numero se l'autofagia viene bloccata nelle fasi avanzate16.
Poiché l'autofagia è altamente sensibile alla disponibilità nutrizionale17, lievi differenze nelle condizioni di coltura spesso portano a variazioni nei fenotipi. Pertanto, l'analisi clonale, un metodo che analizza le cellule mutanti rispetto alle cellule di controllo wild-type nello stesso tessuto, ha un grande vantaggio nel sezionare i difetti dell'autofagia18. Sfruttando la ricombinazione sito-specifica mediata da flippasi/flippasi (FLP/FRT) tra cromosomi omologhi, i moscerini che trasportano tessuti a mosaico sono prontamente realizzati 19,20. Le cellule wild-type che circondano le cellule mutanti formano un perfetto controllo interno per evitare differenze individuali21.
Il presente studio descrive come indurre l'autofagia per fame di aminoacidi e generare tessuti del grasso corporeo a mosaico che esprimono GFP-Atg8a. Questi protocolli possono essere utilizzati per analizzare le differenze nell'autofagia tra i cloni mutanti.

<table><tbody><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>9 medicazioni Piastra spot</td><td>PYREX</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100854-0100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610440-0500</td><td>Composizione di 1x soluzione PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600445-0500</td><td>Composizione di 1x soluzione PBS</td></tr><tr><td>Spatola</td><td>da laboratorio Fisher</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza lunga</td><td>R' DEER</td><td>RST-14</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio</td><td>CITOTEST</td><td>80340-1130</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>Composizione di 1x soluzione PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>Composizione di 1x soluzione PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Standard farina di mais/melassa/agar cibo per mosche</td><td></td><td></td><td>Tong Lab-made Stereomicroscopio</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento Vectashield con DAPI</td><td>Vectorlabratory</td><td>H-1200-10</td><td>Mezzo</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> di montaggio consigliato<tr><td>Fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y'w* Iso FRT19A</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr></tbody></table>

analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di drosophila melanogaster

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

L'autofagia è un processo di autodigestione cellulare. Trasporta il carico ai lisosomi per la degradazione in risposta a vari stress, tra cui la fame. Il malfunzionamento dell'autofagia è associato all'invecchiamento e a molteplici malattie umane. Il macchinario dell'autofagia è altamente conservato, dal lievito all'uomo. Il corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster, un analogo per il fegato dei vertebrati e il tessuto adiposo, fornisce un modello unico per il monitoraggio dell'autofagia in vivo. L'autofagia può essere facilmente indotta dalla fame di nutrienti nel corpo grasso larvale. La maggior parte dei geni correlati all'autofagia sono conservati in Drosophila. Sono stati sviluppati molti ceppi di mosche transgeniche che esprimono marcatori autofagici marcati, il che facilita il monitoraggio di diverse fasi del processo di autofagia. L'analisi clonale consente un confronto ravvicinato dei marcatori di autofagia in cellule con genotipi diversi nello stesso pezzo di tessuto. L'attuale protocollo descrive le procedure per (1) generare cloni somatici nel corpo grasso larvale, (2) indurre l'autofagia attraverso la fame di aminoacidi e (3) sezionare il corpo grasso larvale, con l'obiettivo di creare un modello per analizzare le differenze nell'autofagia utilizzando un marcatore autofagosomico (GFP-Atg8a) e l'analisi clonale.

In condizioni di alimentazione, la proteina ubiquitina-simile marcata con GFP, GFP-Atg8a, è diffusa all'interno delle cellule. Alla fame, forma puncta verde ed etichetta autofagosomi. Una volta che gli autofagosomi si fondono con i lisosomi, la GFP viene spenta negli autolisosomi acidi e la puncta verde scompare. Se l'autofagia non viene indotta o la maturazione dell'autofagosoma viene accelerata, il numero di GFP puncta dovrebbe essere basso. Tuttavia, se la fusione tra autofagosomi e lisosomi è bloccata o il pH dell'au...

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'autofagia nel corpo grasso larvale della Drosophila melanogaster attraverso l'esaurimento dei nutrienti e analizza i cambiamenti nell'autofagia utilizzando ceppi di mosca transgenici.

Analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Questo protocollo descrive come indurre l'autofagia nel corpo grasso larvale della Drosophila melanogaster attraverso l'esaurimento degli aminoacidi e come analizzare le differenze nell'autofagia tra i cloni mutanti. Poiché l'autofagia è altamente sensibile alla disponibilità di nutrizione in condizioni di coltura, l'analisi clonale, un metodo che analizza le cellule mutanti rispetto alle cellule di tipo selvatico nello stesso tessuto, ha un vantaggio nel sezionare i difetti dell'autofagia. Inizia introducendo tre maschi e 15 mosche adulte femmine in una fiala di coltura con farina di mais standard o melassa o agar Drosophila media a 25 gradi Celsius per l'accoppiamento.A 48 ore dall'induzione, picchiettare la fiala di accoppiamento fino a quando le mosche non sono stordite e cadere sul supporto alla base del flaconcino. Scollegare il flaconcino di accoppiamento e coprirne la bocca con un flaconcino di coltura invertito scollegato con un terreno fresco. Quindi capovolgere e picchiettare le fiale per trasferire le mosche nella fiala di coltura fresca.Collegare il flaconcino di coltura fresca ed eliminare il vecchio flaconcino. Posizionare la fiala di coltura fresca in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per la deposizione delle uova sui terreni freschi. Rimuovere le mosche dopo sei ore di deposizione delle uova e scartare le mosche gettandole in un pallone contenente il 75% di etanolo.Incubare la fiala con embrioni a bagnomaria a 37 gradi Celsius per un'ora per indurre l'espressione di flippasi. Successivamente, metterli in un incubatore a 25 gradi Celsius e consentire agli embrioni di continuare a svilupparsi. Utilizzando una spatola da laboratorio, raccogliere i terreni contenenti le larve in via di sviluppo in una capsula di Petri 75 ore dopo la deposizione delle uova.Aggiungere 1X PBS al piatto e separare delicatamente i terreni di coltura e le larve usando una pinza lunga. Quindi selezionare da 10 a 15 larve di terzo stadio precoce. Riempire i pozzetti di una piastra spot di depressione di vetro a nove pozzetti con 1X PBS e posizionare le larve di terza stella separate nei pozzetti usando una pinza lunga.Lavare accuratamente le larve per rimuovere tutti i residui di media. Prendi cinque millilitri di soluzione di saccarosio al 20% in una fiala vuota e metti le larve pulite del terzo stadio in questa soluzione usando una pinza lunga. Incubare questa fiala in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per sei ore prima di raccoglierle per la dissezione.Aggiungere 1X PBS in ciascun pozzetto della piastra spot di depressione di vetro a nove pozzetti e trasferire le larve nei pozzetti con una pinza lunga. Metti una larva in un pozzo con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Afferrare la cuticola della larva con due pinze da 5 nel mezzo del tronco larvale e strappare delicatamente le cuticole.I corpi grassi esposti, insieme ad altri tessuti larvali interni, saranno ancora attaccati alla carcassa della larva. Tirare abbastanza per esporre gli organi interni il più possibile. Ripeti questo passaggio per tutte le larve.Trasferire la carcassa larvale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di 4% di PFA e incubare per 30 minuti a 25 gradi Celsius senza agitare i tubi. Dopo 30 minuti, pipettare la soluzione PFA. Aggiungere 500 microlitri di 1X PBS nel tubo.Agitare delicatamente il tubo su un rotatore piatto per 10 minuti, quindi gettare la soluzione 1X PBS. Ripeti questa operazione tre volte. Usando una pinza lunga, trasferire la carcassa larvale fissa e lavata in un pozzo nella piastra spot a nove depressioni riempita con 1X PBS.Rimuovere tutti i tessuti del corpo non grassi con 5 pinze. Infine, montare i pezzi del corpo grasso su un vetrino da microscopio usando l'80% di glicerolo come mezzo di montaggio e appoggiare un coprivetrino sulla parte superiore. Il mutante uno e il mutante due sono due mutanti letali indipendenti sul cromosoma X e le mosche FRT 19A bianche gialle isogeneizzate fungono da controllo qui.I modelli GFP-Atg8a sono stati analizzati nei corpi grassi larvali di controllo, mutanti o mutanti due mosaici, e i cloni mutanti o cloni di controllo sono stati contrassegnati negativamente da RFP. Nei cloni di controllo, i pattern di GFP-Atg8a Puncta erano simili a quelli delle cellule RFP positive circostanti. Nei cloni mutanti di uno mutante, i Puncta GFP-Atg8a erano notevolmente ridotti.E in due cloni mutanti, il numero e le dimensioni di GFP-Atg8a Puncta sono stati aumentati. La fase di sviluppo delle larve è critica qui. Il tempo per lo sviluppo e la durata della fame devono essere modificati in base alle ricette del terreno di coltura di ciascun laboratorio.Questa procedura può essere applicata per esplorare l'autofagia selettiva. Ad esempio, la mitofagia può essere monitorata nei corpi grassi di mosca attaccando una proteina fluorescente a una sequenza di targeting mitocondriale.

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