Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco
October 20th, 2022
L'analisi dei cambiamenti nella funzione contrattile e nell'integrità cellulare dei cardiomiociti umani derivati da iPSC è di immensa importanza per lo sviluppo di farmaci non clinici. Un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti affronta entrambi i parametri in tempo reale e in modo fisiologico per risultati affidabili e rilevanti per l'uomo, necessari per una transizione sicura nelle fasi cliniche.
Il metodo può aiutare a rispondere alle domande relative alla sicurezza cardiaca preclinica e alla tossicità utilizzando dati reali basati sull'uomo per una transizione sicura di nuovi farmaci candidati alle fasi cliniche. Invece di utilizzare una serie di diverse tecniche in vitro e in vivo, il principale vantaggio di questo sistema ibrido è la valutazione simultanea dei cardiomiociti derivati da iPC, dei parametri elettrofisiologici e di vitalità umani e l'analisi delle proprietà contrattili in condizioni fisiologiche. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci in quanto copre i cambiamenti elettrofisiologici, strutturali e contrattili dei cardiomiociti e un sistema a più alto rendimento che consente il test di 69 pozzetti contemporaneamente.
Per iniziare il rivestimento della piastra, lasciare il fondo della piastra di contrazione coperto dalla protezione della membrana fornita in aggiunta fino alla misurazione nel modulo di contrattilità. Per la semina dei cardiomiociti, preparare una soluzione di rivestimento in gel EHS diluita trasferendo 2,75 millilitri di gel EHS soluzione pronta all'uso e 8,25 millilitri di DPBS con calcio e magnesio in una provetta da centrifuga sterile. Quindi mescolare la soluzione.
Rimuovere la protezione della membrana dalla piastra di contrazione. Trasferire la soluzione di rivestimento preparata in un serbatoio di reagente sterile nel robot di automazione di laboratorio. Utilizzare il programma, aggiungere 100 microlitri con il robot di automazione di laboratorio e aggiungere 100 microlitri della soluzione di rivestimento per pozzetto.
Quindi riposizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver scongelato e contato le celle, regolare le celle nel mezzo di placcatura raccomandato secondo le istruzioni del produttore della cella, ottenendo 11 volte 10 alla sesta cella per 11 millilitri per seminare un'intera piastra da 96 pozzetti. Utilizzare il programma per rimuovere 100 microlitri per rimuovere la soluzione di gel EHS dai pozzetti con il robot di automazione di laboratorio.
Successivamente, trasferire gli 11 millilitri di sospensione cellulare in un serbatoio di reagente sterile collocato nel robot di automazione di laboratorio e seminare le cellule con 100 microlitri di sospensione per pozzetto. Utilizzando il programma, le celle aggiungono 100 microlitri. Immediatamente dopo la semina cellulare, trasferire la piastra flessibile a 96 pozzetti nell'incubatore a umidità controllata a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, e lasciare che le cellule si depositino durante la notte.
Riscaldare 22 millilitri di terreno di mantenimento dei cardiomiociti da aggiungere a ciascuna piastra a 37 gradi Celsius in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Da 18 a 24 ore dopo aver seminato le piastre, trasferire il terreno fresco in un serbatoio di reagente sterile e lasciarlo accanto al robot di automazione di laboratorio. Quindi eseguire la rimozione media con il programma, rimuovere 100 microlitri.
Quindi posizionare il serbatoio del reagente contenente il mezzo fresco nel robot di automazione di laboratorio e erogare 200 microlitri del mezzo fresco per pozzetto con il programma, aggiungere 100 microlitri. Eseguire questo passaggio due volte per raggiungere 200 microlitri per pozzetto. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo, trasferire la piastra nell'incubatore.
Eseguire uno scambio medio a giorni alterni fino all'aggiunta del composto. Da quattro a sei ore prima dell'aggiunta del composto, eseguire un cambiamento finale del mezzo trasferendo 22 millilitri di tampone di analisi fresco e caldo in un serbatoio di reagente sterile e lasciandolo accanto al robot di automazione di laboratorio. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo trasferire nuovamente la piastra flessibile nell'incubatore.
Un'ora prima della misurazione di base trasferire la piastra al rispettivo dispositivo di misurazione. Nel software di controllo aprire Edit Protocol e selezionare la rispettiva modalità di misurazione, Flex Site o Impedenza EFP. Definire la durata o la lunghezza di una misurazione a 30 secondi e un intervallo di ripetizione a 10 minuti prima di salvare il numero di protocollo.
Quindi selezionare Avvia protocollo e continuare a compilare i campi richiesti. Quando i parametri sono impostati, selezionare Avvia misurazione. Eseguire un minimo di tre misurazioni di base a intervalli di cinque minuti poco prima dell'aggiunta del composto.
Rimuovere 50 microlitri del tampone di analisi da ciascun pozzetto senza rimuovere la piastra flessibile a 96 pozzetti dal dispositivo di misurazione, seguita dall'aggiunta di 50 microlitri della soluzione composta concentrata quattro volte in ciascun pozzetto della piastra secondo il piano di misurazione. Dopo l'aggiunta del composto, selezionare Aggiungi marcatore reagente per definire la disposizione della piastra composta e il volume della soluzione composta. Quindi selezionare Procedi con la misurazione standard o procedere con le serie di misurazioni in base al piano sperimentale.
L'analisi rappresentativa mostra gli effetti dell'inibitore della chinasi Erlotinib sulla contrattilità dei cardiomiociti umani derivati da iPSC. Alla concentrazione più bassa, Erlotinib ha indotto una diminuzione statisticamente insignificante dell'ampiezza, mentre le concentrazioni micromolari di Erlotinib hanno mostrato effetti cardiotossici tempo-dipendenti e dose-dipendenti. L'insorgenza dell'effetto è stata osservata a partire da 96 ore con un micromolare Erlotinib, mentre il trattamento con 10 micromolari Erlotinib ha determinato una diminuzione significativa 24 ore dopo l'aggiunta di composto.
Dopo l'applicazione di 10 micromolari di epirubicina, le cellule hanno cessato di battere entro 24 ore. Con l'applicazione di un'epirubicina micromolare, una drastica diminuzione dell'ampiezza dopo 24 ore è stata seguita dalla completa cessazione del battito fino a 48 ore. A 100 nanomolari, è stata osservata una diminuzione dipendente dal tempo dell'ampiezza del battito.
Alla concentrazione più bassa di 10 nanomolari, l'ampiezza fluttuava costantemente, confermando che l'effetto dell'epirubicina era solo dose-dipendente. Il trattamento con Doxorubicina e Nifedipina per 24 ore riduce la vitalità cellulare in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo. Dopo l'applicazione dell'aumento delle concentrazioni di Nifedipina, le registrazioni del potenziale di campo sulle cellule rivelano un accorciamento dipendente dalla concentrazione della durata del campo normalizzata.
La valutazione della nifedipina per quanto riguarda la contrattilità cardiaca ha anche mostrato una significativa diminuzione dell'ampiezza dipendente dalla concentrazione dopo la misurazione acuta con concentrazioni di 10 nanomolari e 13 nanomolari. È importante ricordare che le cellule sono generalmente sensibili ai parametri ambientali come le variazioni di temperatura e pH, nonché la simulazione meccanica che è particolarmente supportata sulle piastre di contrazione.
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Panoramica
Questo studio presenta un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti per valutare la funzione contrattile e l'integrità cellulare dei cardiomiociti derivati da iPSC umane. Il metodo offre dati in tempo reale, rilevanti per l'uomo, cruciali per lo sviluppo non clinico di farmaci e per transizioni cliniche sicure.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Analisi dei cardiomiociti
- Sviluppo di farmaci
- Elettrofisiologia
Contesto
- I cardiomiociti derivati da iPSC umane sono vitali per le valutazioni di sicurezza cardiaca.
- I metodi tradizionali spesso mancano di rilevanza fisiologica.
- La valutazione simultanea di più parametri migliora l'affidabilità dei dati.
- Questo sistema ibrido migliora il throughput e l'efficienza nei test sui farmaci.
Obiettivo dello studio
- Valutare la sicurezza cardiaca e la tossicità utilizzando dati basati sull'uomo.
- Semplificare la valutazione delle proprietà dei cardiomiociti.
- Facilitare la transizione dei candidati farmacologici nelle fasi cliniche.
Metodi utilizzati
- Valutazione simultanea di parametri elettrofisiologici e di vitalità.
- Analisi delle proprietà contrattili in condizioni fisiologiche.
- Test ad alto rendimento con un formato a 96 pozzetti.
- Preparazione della soluzione di rivestimento in gel EHS per l'innesto dei cardiomiociti.
Principali risultati
- Il sistema ibrido consente il monitoraggio in tempo reale della funzione dei cardiomiociti.
- I dati supportano valutazioni di sicurezza del farmaco migliorate.
- Il throughput migliorato consente il test simultaneo di più candidati farmacologici.
- I risultati dimostrano la rilevanza fisiologica del metodo.
Conclusioni
- Il sistema ibrido a 96 pozzetti è efficace per le valutazioni di sicurezza cardiaca.
- Fornisce dati affidabili e rilevanti per l'uomo per lo sviluppo di farmaci.
- Questo approccio potrebbe portare a studi clinici più sicuri per nuovi candidati farmacologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Preclinical cardiac risk evaluation is a critical inflection point in drug discovery, where predictive confidence in human-relevant models directly impacts portfolio advancement decisions. The hybrid cell analysis system leverages hiPSC-derived cardiomyocytes to deliver real-time, multiparametric data on contractility and electrophysiology, addressing the translational gap between in vitro assays and clinical outcomes. This platform enables enterprise R&D teams to de-risk cardiac liabilities early, supporting safer and more efficient candidate progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of compound-induced effects on human cardiac cell structure and function.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying contractile and electrophysiological changes in a human-relevant system.
- Facilitates functional target validation for cardiac safety endpoints.
Screening & Assay Development
- Prepares validated hiPSC-CM assays for high-throughput compound screening in a 96-well format.
- Delivers standardized, reproducible contractility and impedance readouts for robust assay development.
- Enables quantitative assessment of beat rate, contraction force, and cell viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical cardiac risk assessment with human physiology through bio-compliant membrane culture.
- Provides translational continuity by modeling adult-like contractile responses to pharmacological agents.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on multiparametric cardiac safety data.
Pipeline & Workflow Integration
This hybrid system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early safety screening and translational cardiac risk assessment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cardiac safety liabilities using real-time, human-based data.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as contraction amplitude, beat duration, and impedance for comparative analysis.
- Translational Research: Models disease-relevant cardiac responses, supporting biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for ongoing cardiac safety and efficacy profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cardiac safety by integrating structural, functional, and electrophysiological data.
- Operational Value: Standardizes multiparametric cardiac assays for reproducibility and scalability in a 96-well format.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions and reduces late-stage attrition due to cardiac liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of drug candidates with improved cardiac safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hiPSC-CM culture and multiparametric assay operation.
- Needs access to hybrid contractility and impedance/EFP instrumentation and analytical software.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different compound classes or disease models.
- Environmental sensitivity of hiPSC-CMs to temperature, pH, and mechanical stimulation must be managed.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Plate Coating
1:58
Seeding of Human iPSC‐Derived Cardiomyocytes into Flexible 96‐Well Plates (Day 0)
2:56
Medium Exchange of Flexible 96‐Well Plates (Day 1)
3:53
Final Medium Exchange Before Compound Addition (Day 5–7)
4:21
Compound Addition and Data Recording (Day 5–7)
5:47
Results: Contractility Assessment, Base Impedance, and EFP Recordings of Human iPSC‐Derived Cardiomyocytes After Drug Treatment
7:35
Conclusion
