Name: Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Scopri l'ibridazione fluorescente in situ e la marcatura EdU per visualizzare le cellule staminali in Cladonema pacificum. Questo metodo permette di distinguere cellule staminali proliferanti e quiescenti nella medusa idrozoica.

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Questo lavoro è stato supportato da AMED con il numero di sovvenzione JP22gm6110025 (a Y.N.) e dal JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (a Y.N.).

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.
1. Sintesi della sonda
<ol><li>Estrazione dell'RNA<ol><li>Posizionare tre meduse di Cladonema vive coltivate in acqua di mare artificiale (ASW) in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 ml con la punta tagliata e rimuovere quanto più ASW possibile. NOTA: ASW si prepara sciogliendo una miscela di sali minerali in acqua di rubinetto con neutralizzatore di cloro; il peso specifico finale (S.G.) è 1,018 o le parti per mille (ppt) sono ~27.</li>
		<li>Congelare i tubi da 1,5 mL in azoto liquido per inibire l'attività della RNasi. Aggiungere 30 μL di tampone di lisi dal kit di isolamento dell'RNA totale in cui è stato aggiunto 2-mercaptoetanolo (1 μL/100 μL di tampone di lisi) e omogeneizzare i campioni nel tampone di lisi usando un omogeneizzatore. NOTA: Per evitare il trabocco del tampone e del campione dalle provette, si raccomanda l'omogeneizzazione con una piccola quantità di tampone di lisi.</li>
		<li>Aggiungere 570 μL di tampone di lisi ed estrarre l'RNA totale seguendo il protocollo del kit di isolamento dell'RNA totale (Figura 1).</li>
		<li>Misurare la concentrazione dell'RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro e conservare a -80 °C fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del cDNA<ol><li>Utilizzando un kit, sintetizzare il cDNA usando l'RNA totale estratto dalle meduse come modello (Figura 1 e Tabella 1).</li>
		<li>Incubare a 65 °C per 5 min.</li>
		<li>Raffreddare rapidamente sul ghiaccio.</li>
		<li>Eseguire la sintesi del cDNA con la miscela del punto 1.2.1 (Tabella 1). Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare a 42 °C per 60 minuti.</li>
		<li>Incubare a 95 °C per 5 min.</li>
		<li>Raffreddare rapidamente sul ghiaccio.</li>
		<li>Misurare la concentrazione del cDNA sintetizzato utilizzando uno spettrofotometro e conservare a -20 °C o al di sotto di -20 °C fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del prodotto PCR<ol><li>Per creare un modello PCR, progettare il primer specifico utilizzando Primer-BLAST. Ricavare la sequenza di riferimento dai dati NCBI o dai dati RNA-seq. NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i primer utilizzati in questo protocollo.</li>
		<li>Per amplificare la sequenza target, eseguire la clonazione TA, che non richiede l'uso di enzimi di restrizione. Per ottenere un prodotto PCR in cui viene aggiunta un'adenina all'estremità 3', utilizzare le seguenti impostazioni: 98 °C per 2 min; 35 cicli di 98 °C per 10 s, 55-60 °C per 30 s, 72 °C per 1 min. Utilizzare Taq DNA polimerasi per le reazioni (Tabella 1). NOTA: Per determinare le condizioni della PCR, seguire il protocollo che accompagna la DNA polimerasi da utilizzare, che generalmente fornisce una temperatura di ricottura raccomandata e un tempo di estensione.</li>
		<li>Eseguire il prodotto PCR attraverso un gel di agarosio all'1% e tagliare la banda di interesse. Estrarre i prodotti PCR dai gel tagliati utilizzando un kit di estrazione del gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Legatura<ol><li>Legare il prodotto PCR al vettore con sporgenze di timina 3' mescolando i reagenti (Tabella 1) e incubando a 37 °C per 30 minuti (Figura 1). NOTA: Il rapporto molecolare di vector:PCR dovrebbe essere 1:>3. La dimensione del vettore pTA2 è di circa 3 kb. Se il prodotto PCR (inserto) è A (kb) e B (ng/μL), il volume dell'inserto (X nella tabella 1) da prelevare può essere calcolato da ([50 ng di vettore × A kb di inserto])/(3 kb di × vettoriale [ 1/3]) = 50· Un ng di inserto. Se la concentrazione dell'inserto è B ng/μL, il volume prelevato è 50· A/B μL dell'inserto.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasformazione e placcatura<ol><li>Per la trasformazione, scongelare le cellule competenti sul ghiaccio e distribuirle in aliquote da 20 μL ciascuna. Aggiungere 1 μL dei plasmidi contenenti il prodotto PCR (meno del 5% del volume cellulare competente) e vortice per 1 s. Incubare su ghiaccio per 5 minuti, quindi incubare a 42 °C per 45 s e vortice per 1 s.</li>
		<li>Aggiungere 180 μL di brodo Super Optimal con terreno di repressione dei cataboliti (SOC) (un terreno di coltura batterica ricco di nutrizione) alle cellule competenti e incubare a 37 °C per 30 minuti. Dopo 30 minuti, distribuire le cellule competenti su una piastra di agar contenente ampicillina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galatto-piranoside (X-gal) e isopropil-β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare a 37 °C per 12-16 ore (Figura 1). NOTA: X-gal e IPTG vengono utilizzati per selezionare colonie blu e bianche.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltura liquida<ol><li>Scegli una colonia bianca tra le colonie bianche e blu sul piatto. Aggiungere a 3-5 ml di terreno LB con ampicillina e incubare su un agitatore per 12-16 ore a 37 °C (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Miniprep<ol><li>Estrarre il plasmide dal mezzo LB utilizzando un miniprep plasmidico (Figura 1).</li>
		<li>Quantificare la concentrazione del plasmide utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	</ol></li>
	<li>Leggi la sequenza.<ol><li>Per leggere la sequenza di DNA del plasmide, inviare il plasmide per il sequenziamento Sanger e quindi utilizzare un software per allinearlo con la sequenza genoma / trascrittoma per confermare se la sequenza target è sintetizzata correttamente e valutare in quale direzione la sequenza target è inserita nel plasmide (da 5' a 3' o da 3' a 5'). NOTA: Se la sequenza bersaglio viene inserita nel plasmide nella direzione da 5' a 3' dal sito di legame della RNA polimerasi vicino all'estremità 3', una sonda antisenso può essere generata mediante trascrizione in vitro . Se la sequenza target viene inserita nella direzione inversa da 3' a 5', è possibile generare una sonda di rilevamento (controllo negativo). Se si utilizzano vettori come pTA2, è possibile utilizzare due siti di legame di trascrizione a seconda dello scopo.</li>
	</ol></li>
	<li>Trascrizione in vitro <ol><li>Preparare il modello di DNA dal plasmide creato eseguendo la PCR utilizzando primer al di fuori del sito di legame della RNA polimerasi (ad esempio, siti di legame T7 / T3) nel plasmide (Figura 1). NOTA: I primer universali come il primer forward M13-20 e il primer inverso M13 possono essere utilizzati per preparare un modello di DNA che include siti di legame della RNA polimerasi.</li>
		<li>Purificare la dima dopo l'amplificazione PCR utilizzando un kit di estrazione gel/PCR.</li>
		<li>Mescolare i reagenti mostrati di seguito ed eseguire la reazione di trascrizione a 37 °C per 3 ore (Figura 1 e Tabella 1).</li>
		<li>Aggiungere 1,5 μL di DNasi e incubare a 37 °C per 30 min.</li>
		<li>Aggiungere 10 μL di acqua priva di RNasi e purificare la sonda dalla soluzione della reazione di trascrizione utilizzando una colonna di pulizia.</li>
		<li>Controllare la dimensione dell'RNA sintetizzato caricando 1 μL su un gel di agarosio all'1% e determinare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro. NOTA: Le sonde di RNA sintetizzato devono avere una concentrazione di almeno 100 ng/μL.</li>
		<li>Aggiungere 30 μL di formammide per conservarla a una temperatura pari o inferiore a -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Incorporazione e fissazione di EdU
<ol><li>Introdurre Cladonema medusae (5-10 animali per tubo) in provette da 1,5 mL utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,5 mL e aggiungere ASW fino ad un volume totale di 500 μL. Aggiungere 7,5 μL di soluzione madre EdU da 10 mM e incubare i campioni per 1 ora a 22 °C (Figura 2). La concentrazione finale di EdU è di 150 μM. NOTA: Utilizzare meduse di 5-7 giorni per monitorare la formazione del terzo ramo (Figura 3A). Il giorno in cui le meduse si staccano dal polipo viene conteggiato come giorno 1, e il giorno 5, le meduse iniziano tipicamente a mostrare un terzo ramo sui loro tentacoli principali.</li>
	<li>Dopo 1 ora, rimuovere il più possibile ASW contenente EdU.</li>
	<li>Per anestetizzare le meduse, aggiungere il 7% di MgCl 2 in H2 O e incubare per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il 7% di MgCl 2 in H 2 Oe fissare le meduse durante la notte (O.N.) a 4 °C con paraformaldeide (PFA) al 4% in ASW (Figura 2). NOTA: Quando si esegue FISH senza incorporazione di EdU, i campioni possono essere fissati in modo simile a quelli trattati con EdU dopo l'anestetizzazione (fasi 2.3-2.4).</li>
</ol>3. Ibridazione fluorescente in situ
<ol><li>Trattamento con proteinasi e post fissazione<ol><li>Rimuovere il PFA e lavare i campioni con PBS contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBST) per 3 x 10 minuti. Utilizzare 300-500 μL di PBST per lavaggio. NOTA: Da questa fase alla fine dell'ibridazione, l'esperimento deve essere eseguito in un ambiente privo di RNasi, indossando guanti e una maschera. Il PBS 1x in questa fase deve essere realizzato con acqua trattata con DEPC. Dopo l'ibridazione, è possibile utilizzare 1x PBS realizzato con acqua senza trattamento DEPC. Alcuni protocolli ISH e FISH disidratano i campioni utilizzando passaggi di metanolo, il che consente di salvare i campioni fissi a -20 °C fino all'uso. Per evitare lavori superflui, il processo di disidratazione viene omesso da questo protocollo, in particolare perché i campioni possono essere conservati in PBST per un massimo di alcuni giorni.</li>
		<li>Dopo la fissazione, porre il campione in provette da 1,5 mL su uno shaker, ad eccezione della fase di incubazione dell'anticorpo O.N. anti-DIG-POD (fase 3.4.2). Dopo il lavaggio, aggiungere 10 mg/mL di soluzione madre di proteinasi K in PBST e incubare le meduse con proteinasi K (concentrazione finale: 10 μg/ml) a 37 °C per 10 minuti.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di proteinasi K e lavare i campioni per 2 x 1 minuto con PBST.</li>
		<li>Per postfissare le meduse, aggiungere il 4% di PFA in 1x PBS e incubare a 37 °C per 15 minuti.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di PFA e lavare i campioni per 2 x 10 minuti con PBST. NOTA: Se il gene bersaglio è altamente espresso con un segnale di fondo basso, i passaggi 3.1.2-3.1.5 possono essere saltati.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione<ol><li>Rimuovere il PBST e aggiungere il buffer di ibridazione (buffer HB, tabella 1). Incubare i campioni in HB Buffer per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Utilizzare 300-400 μL di tampone HB, che fornisce un volume sufficiente per un'ibridazione di successo. NOTA: HB Buffer, Wash Buffer 1 e Wash Buffer 2 sono preparati con 20x SSC stock. HB Buffer è conservato a una temperatura pari o inferiore a -20 °C e deve essere portato a RT prima dell'uso.</li>
		<li>Rimuovere il buffer HB e aggiungere un nuovo buffer HB. Preibridare a 55 °C per almeno 2 ore in un incubatore di ibridazione.</li>
		<li>Rimuovere il tampone HB e incubare con il tampone HB contenente le sonde memorizzate nella fase 1.9.7 (concentrazione finale della sonda: 0,5-1 ng/μL nel tampone HB). Ibridare a 55 °C per 18-24 ore (Figura 2) in un incubatore di ibridazione. NOTA: L'intensità e la specificità del segnale FISH possono variare a causa dell'espressione genica bersaglio, nonché della lunghezza e della specificità della sonda. Per aumentare l'intensità, è possibile regolare parametri come la durata dell'ibridazione (18-72 h) e la temperatura (50-65 °C) e testare diverse sonde. Per evitare segnali non specifici, il trattamento con proteinasi K (concentrazione e durata) può essere modificato19.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimozione della sonda<ol><li>Rimuovere il buffer HB contenente le sonde, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 1 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 1 per 2 x 15 minuti a 55 °C. Utilizzare 300-400 μL di tampone di lavaggio. NOTA: HB Buffer contenente sonde può essere utilizzato ripetutamente, fino a circa dieci volte. Invece di scartare, conservare il buffer HB usato contenente sonde a una temperatura pari o inferiore a -20 °C. Preriscaldare il tampone di lavaggio 1, il tampone di lavaggio 2, 2x SSC e PBST a 55 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Rimuovere il buffer di lavaggio 1, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 2 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 2 per 2 x 15 minuti a 55 °C.</li>
		<li>Rimuovere Wash Buffer 2, quindi aggiungere 2x SSC. Lavare i campioni con 2x SSC per 2 x 15 minuti a 55 °C.</li>
		<li>Rimuovere 2x SSC, quindi aggiungere PBST preriscaldato. Lavare i campioni per 1 x 15 minuti con PBST a RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubazione di anticorpi anti-DIG<ol><li>Rimuovere PBST e quindi aggiungere il buffer di blocco all'1%. Incubare i campioni per almeno 1 ora a RT agitando lentamente su un rocker. NOTA: preparare un tampone bloccante all'1% diluendo il 5% di tampone bloccante (Tabella 1). Controllare i campioni prima della successiva reazione anticorpale perché il campione tende ad attaccarsi alla parte posteriore del coperchio o alla parete a causa dell'agitazione.</li>
		<li>Dopo il blocco, rimuovere il buffer bloccante all'1%, aggiungere la soluzione anti-DIG-POD (1:500, in tampone bloccante all'1%) e incubare i campioni O.N. a 4 °C (Figura 2). NOTA: Fare attenzione a mantenere il tempo di incubazione entro 12-16 h per evitare il rilevamento di segnali non specifici.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento di sonda marcata DIG<ol><li>Rimuovere la soluzione anti-DIG-POD, quindi aggiungere Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, Tabella 1). Lavare i campioni con TNT per 3 x 10 minuti a RT. NOTA: L'uso della tecnica di amplificazione del segnale del tiramido (TSA) fornisce un'immagine a migliore risoluzione contro i reagenti marcati con perossidasi di rafano (ad esempio, anti-DIG-POD).</li>
		<li>Soluzione madre diluita di tiramide fluorescente coniugata con colorante (Cy5-tiramide) (1:50) nel tampone diluente di amplificazione per ottenere la soluzione attiva di Cy5-tyramide (Figura 2).</li>
		<li>Rimuovere quanto più TNT possibile, quindi aggiungere la soluzione attiva di Cy5-tyramide. Incubare i campioni per 10 minuti al buio.</li>
		<li>Lavare i campioni con PBST per 3 x 10 minuti al buio.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento di EdU NOTA: Il kit EdU rileva EdU incorporati come segnali fluorescenti (Figura 2).<ol><li>Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti come mostrato nella Tabella 1. Utilizzare 100 μL di cocktail di rilevazione EdU per ogni campione. NOTA: Preparare 1x additivo tampone di reazione diluendo l'additivo tampone di reazione 10x con acqua ultrapura.</li>
		<li>Rimuovere PBST, quindi aggiungere il cocktail di rilevamento EdU. Incubare al buio per 30 min.</li>
		<li>Lavare con PBST per 3 x 10 minuti al buio.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione del DNA<ol><li>Diluire Hoechst 33342 (1:500) in PBST per preparare la soluzione di Hoechst. Rimuovere la PBST e quindi aggiungere la soluzione di Hoechst. Incubare i campioni per 30 minuti al buio (Figura 2).</li>
		<li>Lavare i campioni con PBST per 3-4 x 10 minuti al buio.</li>
	</ol></li>
	<li>Montante<ol><li>Fare una banca sul vetrino per evitare che il campione venga schiacciato. Applicare del nastro adesivo sul vetrino e svuotare il centro.</li>
		<li>Trasferire le meduse sulla banca sul vetro vetrino utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 mL con la punta tagliata. NOTA: Fare attenzione a non lasciare che i tentacoli si sovrappongano.</li>
		<li>Rimuovere qualsiasi PBST con una pipetta P200, quindi aggiungere lentamente il 70% di glicerolo come mezzo di montaggio (Figura 2). NOTA: invece del 70% di glicerolo, è possibile utilizzare un mezzo di montaggio anti-sbiadimento per evitare che la fluorescenza si affievolisca.</li>
		<li>Posizionare delicatamente una copertina sulle meduse con una pinza e sigillare il lato della copertina con smalto trasparente.</li>
		<li>Mantenere i vetrini a 4 °C al buio se non si esegue immediatamente l'osservazione al microscopio.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging<ol><li>Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per acquisire immagini. Per una risoluzione a cella singola, utilizzare una lente dell'olio 40x o una lente per un ingrandimento maggiore.</li>
		<li>Dopo l'acquisizione delle immagini, aprire le immagini utilizzando il software ImageJ/FIJI e contare le celle positive per EdU+ e/o Nanos1+ dallo strumento multipunto20.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Le cellule proliferanti e le cellule staminali sono importanti fonti cellulari in vari processi come la morfogenesi, la crescita e la rigenerazione21,22. Questo articolo descrive un metodo per co-colorare il marcatore di cellule staminali Nanos1 mediante marcatura FISH e EdU in Cladonema medusae. Lavori precedenti che utilizzano l'etichettatura EdU o BrdU hanno suggerito che le cellule proliferative si localizzano nei bulbi tentacolari<sup class...

Cnidaria è considerato un phylum metazoico basalmente ramificato contenente animali con nervi e muscoli, ponendoli in una posizione unica per comprendere l'evoluzione dello sviluppo animale e della fisiologia 1,2. Gli Cnidari sono classificati in due gruppi principali: gli antozoi (ad esempio, anemoni di mare e coralli) possiedono solo larve di planula e stadi di polipo sessili, mentre i Medusozoi (membri di Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) assumono tipicamente la forma di meduse che nuotano liberamente, o meduse, così come larve di planula e polipi. Gli Cnidari mostrano comunemente un'elevata capacità rigenerativa e i loro meccanismi cellulari sottostanti, in particolare il possesso di cellule staminali adulte e cellule proliferative, hanno attirato molta attenzione 3,4. Inizialmente identificate in Hydra, le cellule staminali idrozoiche si trovano negli spazi interstiziali tra le cellule epiteliali ectodermiche e sono comunemente indicate come cellule interstiziali o cellulei-3.
Le cellule i-idrozoiche condividono caratteristiche comuni che includono la multipotenza, l'espressione di marcatori di cellule staminali ampiamente conservati (ad esempio, Nanos, Piwi, Vasa) e il potenziale di migrazione 3,5,6,7,8. Come cellule staminali funzionali, le cellule i-sono ampiamente coinvolte nello sviluppo, nella fisiologia e nelle risposte ambientali degli animali idrozoi, il che attesta la loro elevata capacità rigenerativa e plasticità3. Mentre le cellule staminali, simili alle cellule i, non sono state identificate al di fuori degli idrozoi, anche nella specie modello stabilita Nematostella, le cellule proliferative sono ancora coinvolte nel mantenimento e nella rigenerazione del tessuto somatico, così come la linea germinale9. Poiché gli studi sullo sviluppo e la rigenerazione cnidariana sono stati condotti prevalentemente su animali di tipo polipo come Hydra, Hydractinia e Nematostella, la dinamica cellulare e le funzioni delle cellule staminali nelle specie di meduse rimangono in gran parte non affrontate.
La medusa idrozoica Clytia hemisphaerica , una specie di medusa cosmopolita con diversi habitat in tutto il mondo, tra cui il Mar Mediterraneo e il Nord America, è stata utilizzata come animale modello sperimentale in diversi studi evolutivi e sullo sviluppo10. Con le sue piccole dimensioni, la facilità d'uso e le uova di grandi dimensioni, Clytia è adatto per la manutenzione in laboratorio, nonché per l'introduzione di strumenti genetici come i metodi di transgenesi e knockout recentemente stabiliti11, aprendo l'opportunità di un'analisi dettagliata dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della biologia delle meduse. Nel tentacolo di Clytia medusa, le cellule I sono localizzate nella regione prossimale, chiamata bulbo, e i progenitori come i nematoblasti migrano verso la punta distale differenziandosi in tipi cellulari distinti, compresi i nematociti12.
Durante la rigenerazione del Clytia manubrium, l'organo orale delle meduse, le cellule Nanos1+ i-che sono presenti nelle gonadi migrano nella regione in cui il manubrio viene perso in risposta al danno e partecipano alla rigenerazione del manubrio7. Questi risultati supportano l'idea che le cellule i-in Clytia si comportano anche come cellule staminali funzionali coinvolte nella morfogenesi e nella rigenerazione. Tuttavia, dato che le proprietà delle cellule i-differiscono tra animali rappresentativi di tipo polipo come Hydra e Hydractinia3, è possibile che le caratteristiche e le funzioni delle cellule staminali siano diversificate tra le specie di meduse. Inoltre, con l'eccezione di Clytia, le tecniche sperimentali sono state limitate per altre meduse, e la dinamica dettagliata delle cellule proliferative e delle cellule staminali è sconosciuta13.
La medusa idrozoica Cladonema pacificum è un organismo modello emergente che può essere conservato in un ambiente di laboratorio senza pompa dell'acqua o sistema di filtrazione. Il Cladonema medusa ha tentacoli ramificati, una caratteristica comune nella famiglia Cladonematidae, e un organo fotorecettore chiamato ocello sullo strato ectodermico vicino al bulbo14. Il processo di ramificazione dei tentacoli si verifica in un nuovo sito di ramificazione che appare lungo il lato adassiale del tentacolo. Nel corso del tempo, i tentacoli continuano ad allungarsi e ramificarsi, con i rami più vecchi spinti verso la punta15. Inoltre, i tentacoli Cladonema possono rigenerarsi entro pochi giorni dall'amputazione. Studi recenti hanno suggerito il ruolo delle cellule proliferanti e delle cellule staminali nella ramificazione e rigenerazione dei tentacoli in Cladonema16,17. Tuttavia, mentre l'ibridazione convenzionale in situ (ISH) è stata utilizzata per visualizzare l'espressione genica in Cladonema, a causa della sua bassa risoluzione, è attualmente difficile osservare in dettaglio la dinamica delle cellule staminali a livello cellulare.
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare cellule staminali simili a Cladonema mediante FISH e co-colorazione con EdU, un marker di proliferazione cellulare18. Visualizziamo il pattern di espressione di Nanos1, un marcatore di cellule staminali 5,17, di FISH, che consente l'identificazione della distribuzione delle cellule staminali a livello di singola cellula. Inoltre, la co-colorazione dell'espressione di Nanos1 con l'etichettatura EdU consente di distinguere le cellule staminali che proliferano attivamente. Questo metodo per monitorare sia le cellule staminali che le cellule proliferative può essere applicato a una vasta gamma di aree di indagine, tra cui la ramificazione dei tentacoli, l'omeostasi dei tessuti e la rigenerazione degli organi in Cladonema, e un approccio simile può essere applicato ad altre specie di meduse.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Wako</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento da 3,1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galattopiranoside (X-Gal)</td><td>Wako</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG-POD</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 primer</td><td></td><td></td> diretto <td>5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 innesco</td><td></td><td></td> inverso <td>5'-CGACGTCCAATTTTACGTGCT -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi primer</td><td></td><td></td> in avanti <td>5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi innesco</td><td></td><td></td> inverso <td>5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3'</td></tr><tr><td>Kit di proliferazione cellulare Click-iT EdU per imaging, colorante Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10337</td><td>Kit EdU</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. ltd</td><td>Neutralizzatore di cloro</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento dell'acido nucleico DIG Reagente bloccante</td><td>Roche</td><td>11175041910</td><td>tampone bloccante&nbsp;</td></tr><tr><td>Miscela di marcatura dell'RNA DIG&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>ECOS cella competente DH5&alpha;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>cellula competente</td></tr><tr><td>Kit di estrazione Gel / PCR genico</td><td>veloce Gene veloce</td><td>FG-91302</td><td>kit di estrazione su gel</td></tr><tr><td>Mini kit di plasmidi genici veloci</td><td>Gene veloce</td><td>FG-90502</td><td>miniprep plasmidico</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Wako&nbsp;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico di eparina da suino</td><td>SIGMA-ALDRICH&nbsp;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-beta;-D(-)-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Wako</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>piastra di agar</td></tr><tr><td>LB Brodo Base</td><td>Invitrogen</td><td>12780-052</td><td>LB medio</td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Wako</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>mini colonne di RNA a rotazione rapida</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>colonna di pulizia</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako&nbsp;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis a microvolume NanoDrop OneC con Wi-Fi</td><td>Thermo Scientific</td><td>Spettrofotometro</td><td>ND-ONEC-W</td></tr><tr><td>Poliossietilene (20) Monolaurato di sorbitano (Tween-20)</td><td>Wako&nbsp;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>PowerMasher 2</td><td>nippi&nbsp;</td><td>891300</td><td>omogeneizzatore</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Nacarai Tesque&nbsp;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74004</td><td>kit di isolamento dell'RNA totale</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase senza RNasi</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina Citrato di sodio Tampone 20x polvere (20x SSC)</td><td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A miscela</td><td>di sali minerali</td></tr><tr><td>T3 RNA polimerasi&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>Ibridatore</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq DNA polimerasi</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1st filamento cDNA Kit di sintesi</td><td>TaKaRa</td><td>6210A</td><td></td></tr><tr><td>cDNA Clone</td> bersaglio <td>TOYOBO&nbsp;</td><td>TAK101</td><td>pTA2 Vettore</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine 5</td><td>AKOYA Biosciences</td><td>NEL745001KT</td><td>tecnica di amplificazione del segnale di tiramide (TSA)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>microscopio confocale a scansione laser</td></tr></tbody></table>

ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica cladonema pacificum

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Gli cnidiari, tra cui anemoni di mare, coralli e meduse, mostrano morfologie e stili di vita diversi che si manifestano in polipi sessili e meduse che nuotano liberamente. Come esemplificato in modelli consolidati come Hydra e Nematostella, le cellule staminali e/o le cellule proliferative contribuiscono allo sviluppo e alla rigenerazione dei polipi cnidariani. Tuttavia, i meccanismi cellulari sottostanti nella maggior parte delle meduse, in particolare allo stadio di medusa, sono in gran parte poco chiari e, quindi, lo sviluppo di un metodo robusto per identificare specifici tipi di cellule è fondamentale. Questo articolo descrive un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum. Cladonema medusae possiede tentacoli ramificati che crescono continuamente e mantengono la capacità rigenerativa durante la loro fase adulta, fornendo una piattaforma unica con cui studiare i meccanismi cellulari orchestrati da cellule proliferanti e / o staminali. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero (FISH) che utilizza un marcatore di cellule staminali consente la rilevazione di cellule staminali, mentre la marcatura a impulsi con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un marcatore di fase S, consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Combinando sia l'etichettatura FISH che EdU, possiamo rilevare cellule staminali che proliferano attivamente su animali fissi e questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri animali, comprese le specie di meduse non modello.

I tentacoli Cladonema sono stati usati come modello per studiare i processi cellulari di morfogenesi e rigenerazione15,16,17. La struttura del tentacolo è composta da un tubo epiteliale in cui le cellule staminali, o i-cellule, si trovano nella regione prossimale, chiamata bulbo tentacolare, e nuovi rami vengono aggiunti sequenzialmente alla parte posteriore della regione distale del bulbo lungo il lato assiale (<strong...

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa Cladonema. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero con un marcatore di cellule staminali consente il rilevamento di cellule staminali e la marcatura con 5-etinil-2'-deossiuridina consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Insieme, possono essere rilevate cellule staminali che proliferano attivamente.

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

La co-colorazione dell'espressione di Nanos1 con l'etichettatura EdU consente di distinguere le cellule staminali che proliferano attivamente. Possiamo identificare la distribuzione delle cellule staminali a livello di singola cellula nella medusa Cladonema. Possiamo visualizzare cellule staminali e cellule proliferanti nello stesso campione di meduse, che consente la rilevazione di cellule staminali proliferanti e non proliferanti, portando alla comprensione dell'eterogeneità delle cellule staminali.Studi di biologia dello sviluppo e rigenerazione utilizzando modelli animali che includono cellule staminali. La medusa idrozoica Cladonema pacificum è un organismo modello emergente che può essere tenuto in un ambiente di laboratorio senza alcun sistema specializzato. Cladonema medusae hanno tentacoli ramificati.La ramificazione si verifica in un nuovo sito lungo il lato adassiale del tentacolo. Nel corso del tempo, i tentacoli continuano ad allungarsi e ramificarsi, con i rami più vecchi spinti verso la punta. I tentacoli possono anche rigenerarsi entro pochi giorni dall'amputazione.Le piccole dimensioni, la facilità d'uso e la presenza di cellule staminali adulte o cellule staminali rendono Cladonema un buon sistema per studiare il ruolo delle cellule staminali in diversi processi. Per iniziare, posizionare Cladonema medusae in tubi da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,5 millilitri e aggiungere ASW fino a un volume totale di 500 microlitri. Aggiungere 7,5 microlitri di soluzione madre EdU da 10 millimolari e incubare i campioni per un'ora a 22 gradi Celsius.Attendere un'ora e rimuovere il più possibile ASW contenente EdU. Dopo aver anestetizzato le meduse, incubare per cinque minuti. Fissare le meduse durante la notte a quattro gradi Celsius con il 4% di paraformaldeide in ASW.Per il trattamento con proteinasi e post-fissazione, rimuovere la paraformaldeide e lavare i campioni con PBS contenente 0,1% Tween 20 tre volte per 10 minuti ciascuno. Rimuovere il PBST e aggiungere il buffer di ibridazione. Incubare i campioni nel tampone di ibridazione per 15 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il buffer di ibridazione e aggiungere il nuovo buffer di ibridazione. Pre-ibridare a 55 gradi Celsius per almeno due ore in un incubatore di ibridazione. Rimuovere il buffer di ibridazione e incubare con il buffer di ibridazione contenente le sonde.Ibridare a 55 gradi Celsius per 18-24 ore in un incubatore di ibridazione. Quindi, procedere con la rimozione della sonda. Iniziare rimuovendo il buffer di ibridazione contenente le sonde e quindi aggiungere il buffer di lavaggio.Lavare i campioni con tampone di lavaggio due volte per 15 minuti a 55 gradi Celsius. Rimuovere il tampone di lavaggio uno e aggiungere il tampone di lavaggio due. Lavare i campioni con tampone di lavaggio due volte per 15 minuti a 55 gradi Celsius.Rimuovere il tampone di lavaggio due e quindi aggiungere 2X SSC. Lavare i campioni con 2X SSC due volte per 15 minuti a 55 gradi Celsius. Rimuovere 2X SSC e quindi aggiungere PBST preriscaldato.Lavare i campioni per 15 minuti con PBST a temperatura ambiente. Per l'incubazione di anticorpi anti-DIG, iniziare rimuovendo PBST e quindi aggiungere l'1% di tampone di blocco. Incubare i campioni per almeno un'ora a temperatura ambiente agitando lentamente su un bilanciere.Dopo il blocco, rimuovere il buffer di blocco dell'1%. Aggiungere la soluzione anti-DIG-POD e incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius. Per rilevare la sonda marcata DIG, rimuovere la soluzione anti-DIG-POD e aggiungere il tampone Tween tris cloruro di sodio.Lavare i campioni con tampone tris sodium chloride Tween tre volte per 10 minuti a temperatura ambiente. Diluire la soluzione madre di tiramide coniugata con colorante fluorescente nel tampone diluente di amplificazione per ottenere la soluzione attiva di tiramide Cy5. Rimuovere il più possibile il tampone tris cloruro di sodio Tween e quindi aggiungere la soluzione attiva di tiramide Cy5.Incubare i campioni per 10 minuti al buio. Lavare i campioni con PBST tre volte per 10 minuti al buio. Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti.Rimuovere PBST e quindi aggiungere il cocktail di rilevamento EdU. Incubare il campione al buio per 30 minuti. Lavare con PBST tre volte per 10 minuti al buio.Per la colorazione del DNA, diluire Hoechst in PBST per preparare la soluzione di Hoechst. Rimuovere il PBST e aggiungere la soluzione di Hoechst. Incubare i campioni per 30 minuti al buio.Lavare i campioni con PBST tre o quattro volte per 10 minuti al buio. Successivamente per il montaggio, trasferire le meduse sulla banca sul vetro da vetrino usando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata. Posizionare delicatamente una copertina sulle meduse con una pinza e sigillare il lato della copertina con smalto trasparente.La co-etichettatura dell'espressione di Nanos1 e delle cellule EdU positive ha rivelato il modello spaziale delle cellule staminali e delle cellule proliferative nel tentacolo. Le cellule EdU positive erano più ampiamente distribuite in tutto il bulbo tentacolare, mentre le cellule Nanos1 positive si sono accumulate più localmente nel bulbo tentacolare e nel nuovo sito di ramificazione, suggeriscono che vengono rilevate distribuzioni distinte di cellule staminali e cellule proliferanti a seconda dei tempi di sviluppo e delle diverse fasi. La co-etichettatura di EdU e Nanos1 è stata osservata nel 19,79% delle cellule, suggerendo che queste cellule sono una popolazione di cellule staminali attivamente proliferante.Curiosamente, il 14,46% delle cellule è risultato essere Nanos1 positivo EdU negativo nel mezzo del bulbo e nel nuovo sito di ramificazione, suggerendo la presenza di cellule proliferative non staminali. Al contrario, il 26,32% delle cellule è stato osservato come Nanos1 EdU negativo positivo alla base del bulbo e nel nuovo sito di ramificazione, indicando la presenza di una popolazione di cellule staminali che è a ciclo lento o quiescente, nessuna delle quali viene rilevata dalla marcatura a impulsi EdU. La marcatura a impulsi EdU con breve tempo di incubazione consente di rilevare solo cellule proliferative tra cellule staminali e cellule non staminali.Quando si cambia il tempo di incubazione per EdU e si combinano esperimenti di inseguimento a lungo termine, è possibile contrassegnare cellule staminali a ciclo lento o altri tipi di cellule, tra cui la progenie e le cellule differenziate.

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

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Biologia dello sviluppo

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

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Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

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Descriviamo una procedura multi-target cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) in embrioni di Drosophila intatte che permettono il rilevamento simultaneo e specifico di tre diversi modelli di distribuzione mRNA da contrastanti precipitati di colore.

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Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

L'obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Scopri l'ibridazione fluorescente in situ e la marcatura EdU per visualizzare le cellule staminali in Cladonema pacificum. Questo metodo permette di distinguere cellule staminali proliferanti e quiescenti nella medusa idrozoica.

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum (Video) | JoVE Journal

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

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