Name: Condizioni sperimentali modificate per la perdita delludito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri un protocollo dettagliato per indurre perdita dell'udito da rumore nei topi C57BL/6J utilizzando esposizione sonora calibrata e misurazione ABR. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi del danno alle cellule ciliate esterne e valutare le soglie uditive.

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Ringraziamo le sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) del governo di Taiwan (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) e le borse di ricerca intramurali del Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali del Mackay Medical College. Topi maschi C57BL / 6J di otto settimane sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (New Taipei City, Taiwan). Tutti i topi sono stati allevati e alloggiati in conformità con il protocollo standard sugli animali.
1. Induzione della NIHL nei topi
<ol><li>Preparare la gabbia per i topi sperimentali<ol><li>Per fare ciò, utilizzare una gabbia trappola per topi con dimensioni di 14 cm × 17 cm × 24 cm. Tagliare quattro pezzi di pannelli di plastica ondulata in dimensioni appropriate, facendoli entrare nella gabbia (13 cm × 23 cm e 13 cm × 16 cm).</li>
		<li>Per evitare che i topi vengano tagliati con i piedi dalla griglia della rete, posizionare due dei pezzi rispettivamente sul lato inferiore e sul lato posteriore. Posizionare gli altri due pezzi perpendicolarmente incastrati tra loro, per dividere lo spazio all'interno della gabbia in quarti.</li>
	</ol></li>
	<li>Esegui questo studio in una scatola insonorizzata. Posizionare un altoparlante di 8,5 cm davanti alla gabbia e posizionare sia l'altoparlante che la gabbia in una scatola insonorizzata.</li>
	<li>Aprire il software applicativo CLIO</li>
	<li>Spostare il cursore sull'icona dell'altoparlante, quindi fare clic su TwoSin. Immettere e modificare il valore di Freq 1 a 1000 Hz, Freq 2 a 6000 Hz e fare clic su OK per avviare la riproduzione del suono.</li>
	<li>Nella scheda Leq, modificare dBV in dBSPL. Dopo aver impostato l'ora sull'interfaccia del software, fare clic sul pulsante triangolo verde per riprodurre il suono.</li>
	<li>Posizionare un microfono davanti all'altoparlante a una distanza di 8,5 cm per calibrare il livello di rumore (vedere File supplementare 1). Regolare il livello di rumore a 125 dB SPL-A e monitorare continuamente per non meno di 3 minuti per garantire che il livello di rumore sia sufficientemente stabile. Utilizzare un generatore, un analizzatore e un amplificatore per creare e controllare il rumore. (Figura 1) NOTA: Eseguire questo passaggio in una scatola insonorizzata per evitare danni all'udito dell'operatore.</li>
	<li>Posizionare quattro topi maschi C57BL / 6J nella gabbia (uno per ogni trimestre) per l'esposizione al rumore. Assegna in modo casuale i topi in ogni trimestre durante l'esposizione al rumore. Posizionare un microfono sulla parte superiore della gabbia per monitorare il livello di rumore durante l'esposizione al rumore (Figura 2). NOTA: Eseguire questo passaggio in una scatola insonorizzata per evitare danni all'udito dell'operatore.</li>
	<li>Esporre i mouse al rumore a frequenze di 1 kHz e 6 kHz continuamente per 6 ore al giorno, per 5 giorni consecutivi.</li>
	<li>Misurare le soglie uditive dei topi 1 giorno dopo l'esposizione al rumore (cioè il 6 ° giorno) misurando l'ABR. Ripetere nuovamente queste misurazioni ABR 1 settimana dopo l'esposizione al rumore (cioè il 13° giorno). Dopo le misurazioni ABR, sacrificare tutti i topi coinvolti e raccogliere le loro coclee (Figura 3).</li>
</ol>2. Valutazione della soglia uditiva basata sulla risposta del tronco encefalico (ABR)
<ol><li>Utilizzare un sistema di test ABR commerciale specificamente progettato per animali di piccola taglia10.</li>
	<li>Iniettare per via intraperitoneale una miscela di tiletamina e zolazepam (40 mg/kg) e xilazina (9,3 mg/kg) nei topi per l'anestesia generale. NOTA: la valutazione ABR richiede ~ 2 ore. Assicurati di fornire supporto termico tramite una piastra riscaldante e applica un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza mentre il mouse è sotto anestesia.</li>
	<li>Misurare l'ABR nel topo in anestesia generale. Posizionare elettrodi ad ago sottocutanei (12 mm) al vertice, dietro il padiglione auricolare sinistro e indietro vicino alla coda per misurare la soglia uditiva.</li>
	<li>Presentare stimoli acustici utilizzando un altoparlante posto a 1 cm dall'orecchio sinistro dell'animale.</li>
	<li>Utilizzare un oscilloscopio per controllare gli stimoli acustici. Scegli Onda sinusoidale per gli stimoli e 10 k per la scala della finestra. Ruotare la manopola Frequenza per ottenere la frequenza desiderata degli stimoli acustici.</li>
	<li>Regolare l'intensità dello stimolo ruotando la manopola AMLP sul generatore di funzioni. Ottenere l'intensità dello stimolo desiderata ruotando la manopola AMLP su una tensione adeguata, calcolata dalla calibrazione.</li>
	<li>Raccogli le misurazioni ABR sotto una serie di intensità di stimolo, da 10 dB SPL a 100 dB SPL, con una dimensione del passo di 10 dB. NOTA: Misurare la soglia uditiva in una scatola insonorizzata. Il livello minimo di intensità dello stimolo che potrebbe dare origine a un'onda V visibile nel segnale raccolto è stato assunto come la soglia ABR10,11 (Figura 4). Dopo la valutazione ABR, monitorare l'animale fino a quando non si riprende dall'anestesia (~1 h).</li>
</ol>3. Esame microscopico
<ol><li>Fissaggio del tessuto raccolto<ol><li>Dopo le misurazioni ABR, sacrificare il topo iniettando per via intraperitoneale una miscela di tiletamina e zolazepam (100 mg/kg) e xilazina (23,25 mg/kg) per l'esame microscopico.</li>
		<li>Raccogliere le coclee dal topo e immergerle immediatamente in formaldeide (FA) al 10% per la fissazione (due coclee/ml) per almeno 8 ore a 4 °C.</li>
		<li>Dopo la fissazione, sostituire la soluzione di FA con una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) al 10% per la decalcificazione per 3-4 giorni a 4 °C. Quindi, controllare ogni coclea con una pinzetta per confermare che le coclee siano sufficientemente ammorbidite.</li>
		<li>Posizionare le coclee in una capsula di Petri riempita con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tagliare l'organo a forma di spirale di Corti (OC) (ogni coclea decalcificata) in tre sezioni - la svolta basale, la svolta centrale e la svolta apicale - per la colorazione dei tessuti.</li>
		<li>Al microscopio da dissezione (ingrandimento: 8x-35x), rimuovere le strutture ossee (scala vestiboli, scala tympani e modiolus) delle coclee decalcificate e ottenere i tessuti molli, compreso l'OC (spessore: circa 40 μm).</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione con immunofluorescenza coclea<ol><li>Preparazione del tampone bloccante: preparare il 2% di sieroalbumina bovina (BSA) e lo 0,2% di soluzioni di Triton X-100 in PBS.</li>
		<li>Trasferire il tessuto da colorare dalla capsula di Petri in una provetta per microcentrifuga e immergere il tessuto in 0,1 ml del tampone bloccante per 2 ore a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Preparazione del tampone anticorpale primario Myo7A: diluire l'anticorpo primario Myo7A nel tampone bloccante con un rapporto di volume di 1:200.</li>
		<li>Trattare il tessuto nella provetta della microcentrifuga con 100 μL di tampone anticorpale primario Myo7A per 2 ore a RT.</li>
		<li>Risciacquare il tessuto tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.</li>
		<li>Preparazione dell'anticorpo secondario Myo7A (Myo7A-Rb-488) e dell'anticorpo falloidina (falloidina-594): diluire l'anticorpo secondario Myo7A (1:400) e l'anticorpo falloidina (1:200) nel tampone bloccante.</li>
		<li>Trattare il tessuto con 100 μL di anticorpo secondario Myo7A e tampone anticorpale falloidina per 2 ore a RT.</li>
		<li>Dopo il trattamento con anticorpi anticorpo + falloidina, sciacquare il tessuto in PBS tre volte, per 5 minuti ciascuna.</li>
		<li>Trasferire il tessuto risciacquato dalla provetta della microcentrifuga a una capsula di Petri riempita con PBS utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica da 1 mL con punta tagliata.</li>
		<li>Per prepararsi all'esame microscopico, aprire il tessuto, posizionarlo su un vetrino e aggiungere 15 μL di mezzo 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) fluoromount sul tessuto per coprirlo completamente. Posizionare delicatamente un coprivetro sul tessuto. Lasciare lo scivolo durante la notte a RT prima di sigillarlo con lo smalto.</li>
	</ol></li>
	<li>Acquisizione di immagini<ol><li>Acquisisci immagini 2D utilizzando un microscopio a fluorescenza verticale e un software di acquisizione delle immagini.</li>
		<li>Prima di eseguire l'esame microscopico, centrare il tessuto nel campo visivo e regolare la sensibilità a ISO 100. Regolare inizialmente il tempo di esposizione facendo clic sul pulsante Modalità automatica del software, quindi regolare manualmente facendo clic sul pulsante Regola per ottimizzare il rapporto segnale-rumore.</li>
		<li>Regolare la lunghezza d'onda della luce incidente per eccitare i fluorofori ruotando il cubo di fluorescenza. Pseudo colori sono stati utilizzati per contrassegnare l'emissione da diverse etichette fluorescenti (luce blu: DAPI; luce verde: Myo7A; luce rossa: falloidina).</li>
		<li>Scansionando il campione di tessuto, generare e raccogliere i dati di imaging come file di immagine .tif e .jpg.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi da divulgare.

La NIHL può essere suddivisa in due tipi: NIHL temporanea, che mostra uno spostamento temporale della soglia uditiva, e NIHL permanente, che è caratterizzata da uno spostamento permanente della soglia uditiva. Si ritiene che la perdita dell'udito che abbiamo osservato il 6° giorno (1 giorno dopo l'esposizione al rumore) sia una combinazione di questi due tipi. In questo caso, la soglia uditiva mostrerebbe un recupero graduale nel tempo a causa della componente temporale della perdita dell'udito. Nei nostri stu...

Circa 1,3 miliardi di persone in tutto il mondo soffrono di perdita dell'udito a causa dell'esposizione al rumore1. In questo studio, abbiamo mirato a stabilire un chiaro processo passo-passo per indurre e confermare la perdita dell'udito indotta dal rumore (NIHL). La NIHL deriva da una degenerazione/distruzione delle cellule ciliate (HC) e dei neuroni gangliari spiralati (SGN), danni alle stereociglia HC e/o perdita di sinapsi tra gli HC interni cocleari e gli SGN. Tali anomalie possono anche causare acufene e alterata percezione del linguaggio (specialmente in un ambiente acustico complesso) oltre alla NIHL. Le funzioni sociali, psicologiche e cognitive possono essere sequenzialmente influenzate da queste carenze fisiologiche 2,3,4,5,6.
Negli studi preclinici correlati alla NIHL basati sui topi, i ceppi murini più popolari sono CBA/CaJ 2,3,6,7 e C57BL/6 4,5,8. I topi maschi 3,4,7, inoltre, sono più comunemente usati di quelli femminili, poiché gli estrogeni hanno un effetto protettivo sull'udito. Pertanto, abbiamo usato solo topi maschi in questo studio9. Dopo aver fatto riferimento alla letteratura, abbiamo scelto 1 kHz e 6 kHz come frequenze del rumore applicato. L'intensità del rumore applicato era di 115 dB SPL-A (che circonda la gabbia) a 125 dB SPL-A (al centro della gabbia). Dopo aver esposto i topi sperimentali al rumore continuamente per 6 ore al giorno, per 5 giorni consecutivi, un aumento ottimale della soglia uditiva ha indicato che è stata generata un'estensione ottimale di NIHL nei topi sperimentali. Le operazioni per la manipolazione degli animali, la costruzione della configurazione sperimentale e l'induzione del rumore sono tutte chiaramente descritte passo dopo passo nel protocollo fornito.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Set di microfoni standard CCP da 1/4" in campo libero</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>Per l'esposizione al rumore</td></tr><tr><td>Modulo di ingresso amplificatore, AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>Bioamplificatore, BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>Colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Software Cellsens</td><td>Olympus life science</td><td></td><td>Acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Plastica</td><td></td><td></td><td></td>ondulata</tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>Colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore di risposta evocata</td> per decalcificazione, ERS100C <td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta</td></tr> <tr><td>uditiva del tronco encefalicoFormaldeide</td><td>APLHA</td><td>F030410</td> Fissazione del sistema di acquisizione dati ad alte prestazioni <td>cocleare</td></tr><tr><td>, MP160</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>Cavo di prolunga modulare, MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>Anticorpo primario Myo7A</td><td>Proteus</td><td>25-6790</td><td>Anticorpo secondario Myo7A con colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td></td><td>Jackson immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Elettrodo ad ago con colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>, unipolare 12 mmTp, EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>anticorpo falloidina</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td> Soluzione salina tamponata con <td>fosfato con colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia</td><td></td><td></td> per trappole per topi <td>14 cm x 17 cm x 24 cm</td></tr><tr><td>ROMPUN- iniezione di xilazina, soluzione&nbsp;</td><td>Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore audio, MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>Per l'esposizione al rumore</td></tr><tr><td>Generatore/analizzatore/varie, FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>Per l'esposizione al rumore</td></tr><tr><td>Camera insonorizzata</td><td>Tecnologia</td><td></td> elettroacustica IEA <td>Per l'esposizione al rumore e</td></tr><tr><td>l'altoparlante ABR&nbsp;</td>Tecnologia <td></td><td>elettroacustica IEA</td><td>Per l'esposizione al rumore</td></tr><tr><td>Modulo stimolatore, STM100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td>Set di citofoni con colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>, OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Per la risposta uditiva del tronco encefalico</td></tr><tr><td>Microscopio verticale, BX53</td><td>Olympus</td><td></td><td>Acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

condizioni sperimentali modificate per la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

Un modello animale di perdita dell'udito indotta dal rumore (NIHL) è utile per patologi, terapisti, farmacologi e ricercatori dell'udito per comprendere a fondo il meccanismo della NIHL e successivamente ottimizzare le strategie di trattamento corrispondenti. Questo studio mira a creare un protocollo migliorato per lo sviluppo di un modello murino di NIHL. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J. I topi non anestetizzati sono stati esposti a rumori forti (1 e 6 kHz, presentati simultaneamente a 115-125 dB SPL-A) continuamente per 6 ore al giorno per 5 giorni consecutivi. La funzione uditiva è stata valutata 1 giorno e 1 settimana dopo l'esposizione al rumore, utilizzando la risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR). Dopo la misurazione ABR, i topi sono stati sacrificati e i loro organi di Corti sono stati raccolti per la colorazione con immunofluorescenza. Dalle misurazioni della risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR), è stata osservata una significativa perdita dell'udito 1 giorno dopo l'esposizione al rumore. Dopo 1 settimana, le soglie uditive dei topi sperimentali sono diminuite a ~ 80 dB SPL, che era ancora un livello significativamente più alto rispetto ai topi di controllo (~ 40 dB SPL). Dai risultati dell'imaging a immunofluorescenza, le cellule ciliate esterne (OHC) hanno dimostrato di essere danneggiate. In sintesi, abbiamo creato un modello di NIHL utilizzando topi maschi C57BL / 6J. Un nuovo e semplice dispositivo per generare e fornire rumore a tono puro è stato sviluppato e poi impiegato. Le misurazioni quantitative delle soglie uditive e la conferma morfologica del danno OHC hanno entrambe dimostrato che il rumore applicato ha indotto con successo una perdita uditiva attesa.

Uno spostamento della soglia uditiva ABR La soglia uditiva dei topi è stata misurata utilizzando ABR tone-burst 1 giorno o 1 settimana dopo l'esposizione al rumore. È stato osservato un aumento significativo della soglia uditiva a tutte e tre le frequenze testate (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL) 1 giorno dopo l'esposizione al rumore (cioè il 6° giorno). Il recupero parziale dell'udito si è verificato 1 settimana dopo l'esposizione al ru...

Qui, presentiamo un protocollo per un modello murino di perdita dell'udito indotta dal rumore (NIHL). Per indurre NIHL, abbiamo sviluppato un nuovo e semplice dispositivo utilizzando plastica ondulata, una gabbia trappola per topi e un altoparlante. La risposta uditiva del tronco cerebrale e l'imaging immunofluorescenza sono stati impiegati per valutare rispettivamente la funzione uditiva e il danno esterno delle cellule ciliate.

Condizioni sperimentali modificate per la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

Sebbene ci siano stati studi sulla perdita dell'udito indotta dal rumore, nessuno ha registrato il metodo in modo così dettagliato, rendendo questa una procedura importante. Questo metodo ha effettivamente causato la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e osserva i cambiamenti effettivi nella soglia uditiva da parte di ABR. Un modello animale di perdita dell'udito indotta dal rumore è utile per gli scienziati per comprendere a fondo il meccanismo della perdita dell'udito indotta dal rumore e successivamente ottimizzare le strategie di trattamento corrispondenti.A dimostrare la procedura sarà Dian-Shiue Lee, uno studente di grande talento del mio laboratorio. Per preparare la gabbia per i topi sperimentali, utilizzare una gabbia trappola per topi e tagliare quattro pezzi di pannelli di plastica ondulata in dimensioni appropriate, facendoli entrare nella gabbia. Per evitare che i topi vengano tagliati con i piedi dalla griglia della rete, posizionare due dei pezzi rispettivamente sul lato inferiore e sul lato posteriore.Posizionare gli altri due pezzi perpendicolarmente interconnessi tra loro, per dividere lo spazio all'interno della gabbia in quarti Aprire il software applicativo CLIO. Spostare il cursore sull'icona dell'altoparlante e fare clic su TwoSin. Immettere e modificare il valore di Frequenza da 1 a 1.000 hertz, Frequenza da 2 a 6.000 hertz, quindi fare clic su OK per avviare la riproduzione del suono.Nella scheda Leq, modificare dBV in dBSPL. Dopo aver impostato l'ora sull'interfaccia del software, fare clic sul pulsante triangolo verde per riprodurre il suono. Posizionare un microfono davanti all'altoparlante a una distanza di 8,5 centimetri per calibrare il livello di rumore.Regolare il livello di rumore a 125 decibel SPL-A e monitorare continuamente per almeno tre minuti per assicurarsi che il livello di rumore sia sufficientemente stabilizzato. Utilizzare un generatore, un analizzatore e un amplificatore per creare e controllare il rumore. Metti quattro topi maschi C57 neri 6J nella gabbia, uno per ogni trimestre, per l'esposizione al rumore.Assegna in modo casuale i topi a ciascun trimestre durante l'esposizione al rumore. Posizionare un microfono sulla parte superiore della gabbia per monitorare il livello di rumore durante l'esposizione al rumore. Posiziona la gabbia davanti all'altoparlante all'interno di una scatola insonorizzata, assicurandoti che l'altoparlante sia posizionato a 8,5 centimetri di distanza dalla gabbia.Esporre i topi al rumore a frequenze di un kilohertz e sei kilohertz continuamente per sei ore al giorno, per cinque giorni consecutivi. Misurare le soglie uditive dei topi al 6 ° e 13 ° giorno misurando l'ABR. Utilizzare un sistema di test ABR commerciale, specificamente progettato per piccoli animali per le misurazioni ABR, e mantenere l'animale in anestesia generale.Posizionare elettrodi per ago subdermici da 12 millimetri sul vertice dietro il padiglione auricolare sinistro e indietro vicino alla coda, per misurare la soglia uditiva. Dopo aver posizionato l'altoparlante a un centimetro di distanza dall'orecchio sinistro dell'animale, presenta stimoli acustici utilizzando l'altoparlante. Scegli Onda sinusoidale per gli stimoli e 10 k per la scala della finestra.Ruotare la manopola della frequenza per ottenere la frequenza desiderata degli stimoli acustici. Regolare l'intensità dello stimolo ruotando la manopola AMLP sul generatore di funzioni. Ottenere l'intensità dello stimolo desiderata ruotando la manopola AMLP su una tensione appropriata calcolata dalla calibrazione.Raccogli le misurazioni ABR sotto una serie di intensità di stimolo da 10 a 100 decibel SPL, con una dimensione del passo di 10 decibel. Contrassegnare il livello minimo di intensità dello stimolo che potrebbe dare origine a un'onda V riconoscibile come soglia ABR. Sacrifica i topi dopo le misurazioni ABR e raccogli le coclee dai topi eutanasiati.Subito dopo aver raccolto i tessuti, immergerli in formaldeide al 10% per la fissazione e lasciarli riposare per almeno otto ore a quattro gradi Celsius. Utilizzare EDTA per la decalcificazione, come descritto nel testo. Posizionare le coclee in una capsula di Petri piena di PBS.Per la colorazione dei tessuti, tagliare l'organo a forma di spirale di Corti, o OC, in tre sezioni: la svolta basale, la svolta centrale e la svolta apicale. Sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento da 8x a 35x, rimuovere le strutture ossee che includono vestiboli di scala, timpani di scala e modiolo delle coclee decalcificate e ottenere i tessuti molli, incluso l'OC. Un aumento significativo della soglia uditiva è stato osservato a 12 kilohertz, 24 kilohertz e 32 kilohertz un giorno dopo l'esposizione al rumore. Il recupero parziale dell'udito si è verificato una settimana dopo l'esposizione al rumore, ma le soglie uditive erano ancora elevate di oltre 30 decibel a tutte le frequenze rispetto ai gruppi di controllo.In questo studio, l'udito era più danneggiato alle alte frequenze. Una differenza significativa è stata osservata nella soglia uditiva tra il gruppo di controllo e il gruppo sperimentale sia al 6 ° che al 13 ° giorno, a 12 kilohertz e 32 kilohertz. Una perdita di cellule ciliate esterne è stata costantemente osservata nelle immagini microscopiche acquisite dai topi NIHL, rispetto a quelle dei topi di controllo.Mentre le cellule ciliate interne sono rimaste intatte in tutte le immagini, le cellule ciliate esterne nei giri basali e medi dell'OC sono state gravemente danneggiate. Al contrario, le cellule ciliate esterne nella curva apicale erano quasi intatte. Il passo più importante in questo protocollo include l'esposizione al rumore, la misurazione ABI, la raccolta della coclea.Questa procedura può essere applicata per studiare l'effetto dell'esposizione al rumore a diverse frequenze sulla perdita dell'udito utilizzando vari tipi di suono.

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Fonte: Lee, D., et. al. Condizioni sperimentali modificate per la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno alle cellule ciliate esterne. J. Vis. Exp. (2023)Questo video mostra la misurazione della risposta uditiva del tronco encefalico (ABR) in un topo. Gli elettrodi sono posizionati sulla testa, dietro l'orecchio e vicino alla coda di un topo anestetizzato. Vengono erogati stimoli acustici a varie intensità e i segnali elettrici generati...

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Condizioni sperimentali modificate per la perdita delludito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate (Video) | JoVE Journal

Condizioni sperimentali modificate per la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate

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