Trasfezione efficiente di mRNA trascritto in vitro in cellule in coltura utilizzando nanoparticelle peptide-poloxamina

Le nanoparticelle peptide-poloxamina sono uno dei potenziali sistemi di rilascio di mRNA polmonare. Il nostro protocollo rende le nanoparticelle peptide-poloxamina con maggiore produttività ed efficienza, che facilita lo sviluppo del vaccino mRNA della mucosa. I materiali richiesti dalla tecnica sono a basso costo e il protocollo può essere completato in breve tempo.

Le nanoparticelle peptide-poloxamina hanno la capacità di mediare un'efficiente trasfezione dell'mRNA. Le nanoparticelle peptide-poloxamina hanno mostrato una trasfezione di mRNA di successo nelle cellule epiteliali bronchiali umane, che implica ulteriori applicazioni per i vaccini COVID-19 della mucosa, il trattamento dei tumori polmonari e la terapia genica della fibrosi cistica. Mi aspetto che l'individuo abbia alcune conoscenze di base in un campo correlato e con il protocollo e molte delle tecniche, prima di iniziare a eseguire gli esperimenti.

Dopo aver sintetizzato il frame di lettura aperto di Metridia luciferasi e clonato nel vettore pUC57, preparare un modello di DNA linearizzato usando BamHI e KpnI a 37 gradi Celsius per un'ora. Preparare una reazione di 20 microlitri di volume per la sintesi dell'mRNA usando un kit di trascrizione T7 e pseudouridina come descritto nel manoscritto. Mescolare accuratamente i componenti e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore.

Quindi, rimuovere la struttura secondaria di 50 microgrammi di mRNA IVT senza cappuccio riscaldandolo a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare il sistema di tappatura Cap 1 per il capping dell'mRNA IVT e preparare Cap 1 modificando la struttura del cappuccio 7-metilguanosina utilizzando S-adenosilmetionina e 2'O-metiltransferasi a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Misurare la concentrazione di mRNA IVT limitato con uno spettrofotometro UV-visibile.

Utilizzando un marcatore di RNA, analizzare la dimensione molecolare dell'mRNA IVT rivestito in un gel di agarosio denaturante all'1% di formaldeide contenente il 18% di formaldeide. Preparare 10 milligrammi per millilitro di soluzione madre di poloxamina 704 solubilizzando il T704 in acqua priva di nucleasi. Preparare 2 milligrammi per millilitro di soluzione madre del peptide solubilizzando il peptide in acqua priva di nucleasi.

Conservare la soluzione preparata a 4 gradi Celsius. Scongelare l'mRNA IVT sul ghiaccio. Prima di aprire il tubo, centrifugare il tubo a 300 volte G per tre secondi a temperatura ambiente e diluire la soluzione di mRNA IVT con acqua priva di nucleasi.

Preparare T704 e la soluzione di miscela di peptidi sintetici diluendo la soluzione di T704 a otto microgrammi per concentrazione di microlitro e la soluzione peptidica sintetica a 0,555 microgrammi per concentrazione di microlitro, rispettivamente con acqua priva di nucleasi. Incubare la soluzione miscelata per 15 minuti a temperatura ambiente prima di un ulteriore utilizzo. Aspirare la soluzione di mRNA IVT in una siringa da un millilitro, evitando vuoti d'aria o bolle nella punta della siringa.

Caricare la siringa in un lato della cartuccia accanto al blocco rotante. Quindi, riempire una siringa da un millilitro con T704 e soluzione di miscela di peptidi sintetici e rimuovere eventuali bolle o vuoti d'aria sulla punta della siringa. Posizionare la siringa nell'altro ingresso della pompa e impostare la pompa con una portata totale da 4 a 10 millilitri al minuto.

Posizionare un tubo conico privo di RNasi da dieci millilitri per raccogliere la soluzione mista di mRNA/PP-sNp IVT alla fine del percorso di flusso del dispositivo di miscelazione. Far funzionare la pompa per avviare la miscelazione, assicurandosi che i parametri siano inseriti correttamente. Dopo aver fatto funzionare la pompa per sei secondi, raccogliere il campione di mRNA/PP-sNp IVT dal tubo conico.

Placcare le cellule epiteliali bronchiali umane e una linea cellulare dendritica in piastre a 96 pozzetti 24 ore prima della trasfezione. Coltivare le cellule in un terreno di coltura integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore e l'1% di streptomicina penicillina. Dopo aver rimosso il mezzo di crescita, lavare le celle placcate con 0,2 millilitri per pozzetto PBS.

Aggiungere 170 microlitri di terreno di coltura senza siero a ciascun pozzetto contenente le colture cellulari placcate. Quindi, aggiungere 30 microlitri di formulazione di mRNA / PP-sNp IVT contenente 0,4 microgrammi di mRNA di Metridia luciferasi goccia saggiamente in ciascun pozzetto. Incubare le cellule con la formulazione IVT mRNA/PP-sNp in un'atmosfera umidificata arricchita di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Aspirare il mezzo di trasfezione e aggiungere 0,2 millilitri di terreno di coltura fresco integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore e l'1% di streptomicina penicillina. Incubare le cellule trasfettate per 24 ore come dimostrato in precedenza e raccogliere i surnatanti da rilevare da ciascun pozzetto. Preparare una nuova soluzione di dosaggio aggiungendo PBS al substrato della celenterazina.

Mescolare accuratamente la soluzione vorticando per 10 secondi. Aggiungere 50 microlitri del surnatante raccolto a una piastra da 96 pozzetti. Impostare il lettore di micropiastre con un tempo di lettura di 1.000 millisecondi e aggiungere 30 microlitri di soluzione di celenterazina a ciascun pozzetto manualmente o mediante iniezione automatica.

Immediatamente dopo aver aggiunto la soluzione di celenterazina al surnatante, fare clic su Start per misurare il segnale di luminescenza. Il plasmide ricombinante è stato isolato e digerito per produrre il modello di DNA linearizzato. La trascrizione in vitro ha prodotto mRNA MetLuc upcapped e capped.

Le cellule trasfettate con mRNA/PP-sNp di Metridia luciferasi hanno mostrato un'espressione significativamente più elevata di luciferasi rispetto a quelle trasfettate con reagente di trasfezione a base lipidica disponibile in commercio, mRNA nudo di Metridia luciferasi, PBS o peptidi sintetici T7044, soluzione mista in cellule epiteliali bronchiali umane, 16 HBE e linea cellulare dendritica DC2.4 Metridia luciferasi mRNA/PP-sNp ha mostrato un'espressione di luciferasi più elevata rispetto a LP.suggerendo che il sistema di rilascio di PP-sNp è importante per proteggere l'mRNA MetLuc dalla degradazione e promuovere l'efficienza di trasfezione dell'mRNA esogeno della Metridia luciferasi. Assicurati che la struttura sintetica del Met-mRNA senza cappuccio sia stata rimossa con successo. Calcola e scarica attentamente il Met-mRNA T704 e il composto peptidico per preparare e compattare le nanoparticelle di poloxamina.

La microscopia elettronica a trasmissione può essere eseguita per osservare la morfologia delle nanoparticelle peptide-poloxamina. Questa tecnica aiuta i ricercatori a sviluppare vaccini mRNA della mucosa e consentire lo screening ad alto rendimento delle formulazioni di terapia genica per ogni cellula correlata.