Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

In questo protocollo, è stato costruito il sale di solfonio che potrebbe agire come una nuova mano che ha reagito con la proteina cisteina sulla speciale vicinanza. Il vantaggio di questa tecnica era che questa reazione era veloce ed efficiente, e Met-catalyst libero e sviluppato un metodo semplice ed efficiente per stabilizzare i peptidi. Per iniziare, preparare la soluzione di deprotezione N-terminale 9-fluorinil-metilossicarbonile di 20% piperidina o 50% morfolina e DMF in un becher o pallone da 500 millilitri.

Quindi, aggiungere 10 millilitri della soluzione di deprotezione alla colonna e l'azoto bollente nella soluzione per 30 minuti o due volte per cinque minuti. Scolare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza per cinque volte con diclorometano e N, N-dimetilformammide. Per rilevare la resina come una soluzione di colore giallo scuro, aggiungere un millilitro di N, N-dimetilformammide a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 microlitri di 5% di ninidrina a un tubo di vetro.

Riscaldarlo a 130 gradi Celsius per tre minuti per valutare i cambiamenti nel colore della resina. Per l'accoppiamento dei peptidi, preparare una soluzione di miscela come descritto nel manoscritto in un tubo di polipropilene e scioglierla in tre millilitri di N, N-dimetilformammide. Quindi, aggiungere 173 microlitri di N, N-diisopropiletilammina o 154 microlitri di N, N'diisopropilcarbodiimide alla soluzione per inattivare l'amminoacido.

Quindi, aggiungere la miscela alla colonna con resina e bollire con azoto per due ore. Dopo l'accoppiamento, aggiungere un millilitro di N, N-dimetilformammide a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 microlitri di 5% di ninidrina in un tubo di vetro. Riscaldarlo a 130 gradi Celsius per tre minuti mentre la resina è cambiata in incolore che conferma l'assenza di un gruppo amminico libero prima della fase di deprotezione.

Dopo aver drenato la soluzione, lavare la resina come dimostrato in precedenza e aggiungere 10 millilitri della soluzione di deprotezione alla colonna. Quindi, bolle con azoto per 30 minuti o due volte per cinque minuti. E ancora, aggiungi una nuova soluzione.

Aggiungere 10 millilitri di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con azoto per l'uso successivo. Pesare 100 milligrammi di resina in una colonna e lavare la resina con diclorometano e N, N-dimetilformammide prima della fase di accoppiamento. Preparare una soluzione per rimuovere il gruppo di protezione tritil-L-cisteina aggiungendo acido trifluoroacetico, triisopropilsilano, e miscela di diclorometano in un becher da 100 millilitri o pallone per rimuovere il gruppo protettivo.

Aggiungere da cinque a 10 millilitri della soluzione preparata alla colonna per rimuovere il gruppo di protezione per 10 minuti. Ripeti sei volte con gorgogliamento di azoto fino a quando il colore giallo scompare completamente. Dopo aver scaricato la soluzione con una pompa per vuoto, lavare la resina come dimostrato in precedenza.

Quindi, preparare una soluzione per reagire con cisteina deprotetta aggiungendo linker dialogenato e N, N-diisopropiletilammina in un becher da 50 millilitri o in un matraccio con N, N-dimetilformammide. Aggiungere da cinque a 10 millilitri della soluzione di reazione alla colonna per reagire con cisteina protetta per almeno tre ore con gorgogliamento di azoto. Anche in questo caso, scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza come dimostrato in precedenza.

Per preparare la soluzione di ciclizzazione del peptide, aggiungere la miscela di acido trifluoroacetico in un becher da 20 millilitri o in un pallone nella cappa aspirante per la ciclizzazione del peptide. Quindi, aggiungere da cinque a 10 millilitri della soluzione di miscela al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail di acido trifluoroacetico per tre ore. Dopo aver disidratato e lavato la resina prima che la fase di accoppiamento sia dimostrata in precedenza, preparare una soluzione acquosa di acido formico all'1% e un bromuro di propargil millimolare e aggiungere alla soluzione di peptide di metionina.

Quindi, agitare la reazione di accoppiamento di metionina e propargil bromuro a temperatura ambiente per 12 ore. Dopo la reazione, sciogliere il prodotto in un tubo di polipropilene e acetonitrile e filtrarlo attraverso una membrana filtrante da 0,22 micrometri. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.

I peptidi ciclici sintetizzati utilizzando bis-alchilazione tra cisteina e metionina sono stati caratterizzati dallo spettro HPLC e LCMS, il che dimostra che gli epimeri mostravano tempi di ritenzione distinti e pesi molecolari identici. Le tracce HPLC degli epimeri e del suo prodotto coniugato hanno dimostrato la conversione dipendente dal tempo tra il peptide ciclico e il suo prodotto. Il peso molecolare dei peptidi ciclici sintetizzati utilizzando una reazione di tipo tiolo-yne è stato determinato mediante LCMS e il peptide è stato isolato e purificato mediante HPLC.

I peptidi sono stati ulteriormente caratterizzati da NMR protonica e singoli spettri coerenti quantistici eteronucleari, rivelando lo spostamento chimico. Gli spettri NMR protonici della conversione dipendente dal tempo tra peptide ciclico e ditiotreitolo e ossido di deuterio sono stati ottenuti per esplorare la stabilità del peptide dovuta all'apertura dell'anello solfonico. I risultati hanno mostrato che non si sono formati prodotti di aggiunta o apertura dell'anello dopo 24 ore.

Questa procedura ha stabilito una strategia efficace per sintetizzare peptidi ciclici. La reazione afferma che la selettività è anche migliorata formando una conferma che stabilizza il peptide di ciclizzazione, indicando che i peptidi ciclici erano promettenti catalizzatori di farmaci.