Name: Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Scopri la sintesi di peptidi ciclici mediante bisalchilazione tra cisteina e metionina con centro solfonio on-tether. Questo metodo efficiente non richiede catalizzatore Met e stabilizza rapidamente i peptidi per applicazioni biochimiche.

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Riconosciamo il sostegno finanziario del National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); le sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (21778009 e 21977010); la Fondazione per le scienze naturali della provincia del Guangdong (2022A1515010996 e 2020A1515010521): il Comitato per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 e JCYJ20200109140406047); e la sovvenzione Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Gli autori riconoscono il supporto della rivista Chemical Science , The Royal Society of Chemistry per il riferimento 30 e The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, per il riferimento 31.

1. Preparazione dell'attrezzatura
ATTENZIONE: Morfolina, N, N-dimetilformammide (DMF), diclorometano (DCM), N, N-diisopropiletilammina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, etere etilico e metanolo sono tossici, volatili e corrosivi. Questi reagenti possono danneggiare il corpo umano attraverso l'inalazione, l'ingestione o il contatto con la pelle. Per tutti gli esperimenti chimici, utilizzare dispositivi di protezione, inclusi guanti monouso, cappotti sperimentali e occhiali protettivi.
<ol><li>Costruire tutti i substrati peptidici sulla resina Rink-amide 4-metilbenzidrilammina (MBHA) mediante sintesi peptidica in fase solida (SPPS)29 manuale standard, come mostrato nella Figura 1.</li>
	<li>Utilizzare una delle due opzioni per la costruzione di peptidi lineari: uno, sintetizzare il peptide utilizzando l'agente condensante 2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU) e un reagente di DIPEA; o due, sintetizzare utilizzando 1-idrossibenzotriazolo (HOBT) e N,N'-diisopropilcarbodiimide (DIC) come reagente di condensazione ammidica. Selezionare un protocollo appropriato per la sintesi del peptide in base alla sequenza del peptide.</li>
	<li>Per stabilire un dispositivo manuale di sintesi peptidica, installare un'apparecchiatura di estrazione in fase solida sottovuoto modificata in una cappa aspirante e collegarla con un rubinetto a tre vie. Quindi, posizionare una cartuccia filtrante in polipropilene o un reattore di vetro sull'apparecchiatura mentre è collegata al gas di azoto (N2). NOTA: Per modificare l'apparecchiatura di estrazione in fase solida sotto vuoto, rimuovere il tubo di estrazione e mantenere il sistema sigillato sottovuoto.</li>
	<li>Caricare la resina MBHA nelle colonne riempite di resina e scioglierla in DMF. Regolare l'interruttore dei rubinetti di arresto a tre vie per il gorgogliamento di N2 , quindi rimuovere il solvente nella colonna utilizzando una pompa funzionante collegata a un sistema di vuoto. Calcolare la quantità di aminoacido o agente condensante necessaria utilizzando la seguente formula: Amminoacido (g) e agente condensante (g) = scaglie di resina (g) × capacità di carico della resina (mM/g) × equivalente (5 eq) × peso molecolare (g/M) NOTA: Scegliere la quantità di resina caricata in base alla lunghezza del peptide di accoppiamento. Più equivalenti (eq) di amminoacidi sono usati per reagire più pienamente. I solventi liquidi devono essere convertiti in volume in base alla densità. Il 5 eq mostra che la quantità di input del composto calcolato è amplificata di un fattore cinque.</li>
</ol>2. Preparazione della resina
NOTA: Scegliere la quantità di resina caricata in base alla lunghezza del peptide di accoppiamento.
<ol><li>Pesare 302 mg di resina MBHA Rink-ammide (0,331 mM/g caricati) in una colonna (serbatoio da 20 ml). Aggiungere 5-10 ml di DCM o DMF nella colonna per gonfiare la resina sotto N2 gorgogliando per 30 minuti.</li>
	<li>Quindi, chiudere l'interruttore N2 , quindi accendere l'interruttore di aspirazione della pompa per vuoto per rimuovere il solvente. Quindi, lavare le resine in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.</li>
</ol>3. Deprotezione Fmoc N-terminale
NOTA: La deprotezione con morfolina richiede 30 minuti e la deprotezione con piperidina richiede 5 minuti.
<ol><li>Preparare la soluzione di deprotezione N-terminale 9-fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc): preparare un volume sufficiente (500 ml) di piperidina al 20% (v/v) o al 50% (v/v) di morfolina in DMF in un contenitore di vetro per la deprotezione del gruppo Fmoc.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml della soluzione di deprotezione alla colonna, bolla N2 nella soluzione per 30 minuti o 5 minuti 2x e ripetere le procedure di deprotezione 2x.</li>
	<li>Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Rilevare la resina come soluzione di colore giallo scuro al 5% di ninidrina (test Kaiser) dopo ogni deprotezione per confermare l'assenza del gruppo Fmoc prima della fase di accoppiamento. In dettaglio, aggiungere 1 mL di DMF a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 μL di ninidrina al 5% in un tubo di vetro riscaldato a 130 °C per 3 minuti per valutare le variazioni del colore della resina.</li>
	<li>Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.</li>
</ol>4. Accoppiamento del peptide lineare (Figura 2)
NOTA: Quando le sequenze peptidiche sintetiche contengono due o più unità ripetute, la procedura di accoppiamento può essere eseguita direttamente selezionando il tipo di amminoacido, come Fmoc-AA-OH o Fmoc-AAA-OH e così via. Alcuni amminoacidi speciali con impedimento sterico e peptidi con sequenze aminoacidiche più lunghe sono necessari per estendere correttamente il tempo di reazione per l'accoppiamento.
<ol><li>Per una singola fase di accoppiamento, prendere come esempio l'accoppiamento del residuo di Cys (sintetizzare scaglie di resina da 300 mg). Preparare una soluzione di miscela comprendente Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HATU (5 eq, 206 mg) o Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HOBT (5 eq, 106 mg) in un tubo di polipropilene e scioglierla in 3 mL di DMF.</li>
	<li>Aggiungere 173 μL di DIPEA (10 eq) o 154 μL di DIC (10 eq) alla soluzione di Cys per attivare l'amminoacido. Lasciare che la miscela si pre-attivi per 1 minuto. Aggiungere la miscela alla colonna con resina e bollire con N 2 per2 ore. NOTA: Il tempo di reazione specifico richiesto deve essere standardizzato per rilevare il 5% di ninidrina.</li>
	<li>Dopo l'accoppiamento, aggiungere 1 mL di DMF a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 μL di ninidrina al 5% in un tubo di vetro riscaldato a 130 °C per 3 minuti. Osservare la resina cambiare in incolore per confermare l'assenza di un gruppo amminico libero prima della fase di deprotezione.</li>
	<li>Scolare la soluzione utilizzando una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml della soluzione di deprotezione alla colonna, bollire con N2 per 30 minuti o 5 minuti 2x, aggiungere soluzione fresca e ripetere le procedure di deprotezione 2x.</li>
	<li>Ripetere i seguenti passaggi: deprotezione del gruppo Fmoc; rilevare la deprotezione della resina; lavare la resina; accoppiamento dell'amminoacido; rilevare la reazione di accoppiamento. Ripetere la fase di accoppiamento fino a quando tutti i peptidi sono sintetizzati. NOTA: Utilizzare il test Kaiser per monitorare se ogni fase della deprotezione è completa o se ogni fase dell'accoppiamento degli amminoacidi è completa. In alternativa, una piccola quantità di peptide può essere scissa dalla resina e controllata da LC-MS per un accoppiamento di successo.</li>
</ol>5. Bisalchilazione tra Met e Cys (Figura 3)
<ol><li>Costruire un peptide lineare con Met e Cys ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con N2 per l'uso successivo (ripetere 2x) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.</li>
	<li>Pesare 100 mg della resina ottenuta nella fase precedente in una colonna (serbatoio da 20 ml) e lavare la resina con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) prima della fase di accoppiamento.</li>
	<li>Preparare una soluzione per rimuovere il gruppo protezione Cys trt(tritile). Preparare un volume sufficiente (100 ml) di miscela TFA/TIS/DCM (3:5:92) in un contenitore di vetro per rimuovere il gruppo protectiove.</li>
	<li>Aggiungere 5-10 mL della soluzione di TFA/TIS/DCM (3:5:92) alla colonna per rimuovere il gruppo di protezione per 10 minuti. Ripeti sei volte con N2 gorgogliando fino a quando il colore giallo scompare completamente.</li>
	<li>Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Preparare una soluzione per reagire con Cys non protetto. Preparare un volume sufficiente (50 ml) di soluzione di miscela (DMF) compreso il linker dialogenato (2 eq) e DIPEA (4 eq) per reagire con Cys deprotetto.</li>
	<li>Aggiungere 5-10 mL della soluzione di reazione alla colonna per reagire con Cys deprotetto per almeno 3 ore con gorgogliamento di N2 . Disidratare con metanolo anidro e asciugare con N2 per l'uso successivo.</li>
	<li>Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Preparare una soluzione per la ciclizzazione dei peptidi: preparare un volume sufficiente (20 ml) di miscela TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:2.5) in un contenitore di vetro nella cappa aspirante per la ciclizzazione dei peptidi.</li>
	<li>Aggiungere 5-10 ml della soluzione di miscela TFA al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail TFA per 3 ore. ATTENZIONE: il TFA è altamente corrosivo e irritante; Il processo di scissione del peptide deve essere eseguito in una cappa aspirante.</li>
	<li>Eseguire i passaggi 7.1-7.5 per ottenere una soluzione peptidica lineare mediante purificazione in fase liquida in fase inversa (HPLC). Liofilizzare la soluzione per il prossimo utilizzo.</li>
</ol>6. Ciclizzazione del sale di propargil solfonio (Figura 4)
<ol><li>Costruire un peptide lineare con Met e Cys ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con la resina per disidratare e asciugare con N2 per l'uso successivo (ripetere due volte) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.</li>
	<li>Pesare 100 mg della resina ottenuta nella fase precedente in una colonna (serbatoio da 20 ml) e lavare la resina con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) prima della fase di accoppiamento.</li>
	<li>Eseguire i passaggi 7.1-7.5 per ottenere una soluzione peptidica lineare mediante HPLC e liofilizzare il campione, come detto, per il prossimo utilizzo.</li>
	<li>Preparare una soluzione acquosa HCOOH all'1% (in volume) e 1,0 mM di bromuro di propargile (5 eq) e aggiungere alla soluzione peptidica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 mL di MeCN/H2O [1:1, v/v]).</li>
	<li>Quindi, agitare la reazione di accoppiamento di Met e propargil bromuro a temperatura ambiente per 12 ore.</li>
	<li>Dopo la reazione, sciogliere il prodotto in un tubo di polipropilene in acetonitrile e filtrarlo attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.</li>
	<li>Nell'ultima fase, aggiungere il peptide con bromuro di propargil in un tubo di polipropilene, mantenere il pH della soluzione di reazione a 8,0 aggiungendo la soluzione di (NH4)2CO3 e agitare la miscela di reazione a 37 °C per 12 ore. Questo passaggio ottiene il peptide ciclico del sale propargil sulfinfo.</li>
	<li>Raccogliere l'ultima miscela di reazione: scioglierla in un tubo di polipropilene in acetonitrile e filtrarla attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.</li>
</ol>7. Purificazione dei peptidi ciclici
<ol><li>Costruire substrati peptidici lineari su resina MBHA Rink-ammide ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con N2 per l'uso successivo (ripetere due volte) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.</li>
	<li>Preparare un volume sufficiente di cocktail di scissione (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) nella cappa aspirante. Aggiungere 1-5 ml di soluzione di miscela TFA al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail TFA per 3 ore.</li>
	<li>Quindi, asciugare sequenzialmente la resina sotto un vapore di N2 nella colonna. In alternativa, utilizzare un dispositivo filtrante per filtrare la resina e raccogliere la soluzione peptidica. Quindi, aggiungere 20 ml di etere alla soluzione peptidica per precipitare il peptide, centrifugare a 3.500 x g per 5 minuti e ripetere due volte. Raccogliere il precipitato peptidico grezzo e asciugarlo sotto un flusso di N2 per il passaggio successivo.</li>
	<li>Sciogliere 200 mg di peptide grezzo in un tubo di polipropilene in 4 ml di soluzione acetonitrile-acqua e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm. Trasferire il peptide in un inserto di flaconcino HPLC. Inserire l'inserto nell'autocampionatore di un sistema HPLC semi-preparativo a fase inversa dotato di una colonna C18 da 5 μm, 4,6 mm x 250 mm e un circuito di iniezione da 1 ml.</li>
	<li>Purificare e isolare il peptide utilizzando un programma gradiente del 5% -95% di acetonitrile in acqua con 0,1% di TFA per 30 minuti mentre si monitorano gli spettri HPLC utilizzando UV a 254 nm. Confermare il peso molecolare del peptide mediante LC-MS, raccogliere la soluzione del peptide e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'approccio sintetico descritto in questo articolo fornisce un metodo per sintetizzare peptidi ciclici utilizzando Cys e Met nella sequenza peptidica, in cui i peptidi lineari di base sono costruiti con tecniche comuni di sintesi peptidica in fase solida. Per la bisalchilazione di peptidi ciclici tra Cys e Met, l'intera via sintetica può essere suddivisa in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l'accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell'acido tri...

Le interazioni proteina-proteina (PPI)1 svolgono un ruolo fondamentale nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. La costruzione di peptidi stabilizzati con una conformazione fissa con mezzi chimici è uno dei metodi più importanti per lo sviluppo di motivi mimetici di PPI2. Ad oggi, diversi peptidi ciclici che prendono di mira i PPI sono stati sviluppati per uso clinico3. La maggior parte dei peptidi sono vincolati a una conformazione a α-elica per diminuire l'entropia conformazionale e migliorare la stabilità metabolica, l'affinità di legame del bersaglio e la permeabilità cellulare 4,5. Negli ultimi 2 decenni, le catene laterali di Cys 6,7, lisina8,9, triptofano 10, arginina 11 e Met12,13 sono state inserite in amminoacidi innaturali per fissare il peptide in una conformazione ciclica. Tali peptidi ciclici possono colpire uno spazio chimico unico o siti speciali, innescando così una reazione covalente per formare un legame covalente proteina-peptide14,15,16,17. In un recente rapporto di Yu et al., una cloroacetammide è stata ancorata al dominio dei ligandi peptidici, garantendo una reazione di coniugazione covalente con un'eccellente specificità proteica18. Inoltre, testate elettrofile, come l'acrilammide e il fluoruro di arilsulfonile (ArSO2F), sono state ulteriormente incorporate nei peptidi da Walensky et al.19 per formare inibitori covalenti peptidici stabilizzati e migliorare l'effetto antitumorale degli inibitori peptidici. Pertanto, è molto importante introdurre un ulteriore gruppo funzionale per modificare covalentemente i ligandi proteina-peptide20. Questi gruppi non solo reagiscono con le proteine sulla catena laterale, ma stabilizzano anche la struttura secondaria del peptide21. Tuttavia, l'applicazione di proteine modificate covalentemente indotta da ligandi peptidici è limitata a causa della complicata via sintetica e del legame non specifico dei gruppi chimici22,23. Sono quindi urgentemente necessarie strategie efficaci per la sintesi di peptidi ciclici.
Ispirato alle molteplici strategie dei peptidi ciclici 2,24,25,26, questo protocollo tenta di sviluppare un metodo semplice ed efficace per stabilizzare i peptidi. Inoltre, abbiamo notato che il gruppo della catena laterale di un peptide stabile potrebbe reagire covalentemente con una proteina bersaglio quando era spazialmente vicino ai ligandi peptidici. La mancanza di Met chimicamente modificato è stata colmata dal gruppo Deming nel 2013 sviluppando un nuovo metodo per produrre metionina27 peptidica selettivamente modificata. Sulla base di questo background, Shi et al. si sono concentrati sullo sviluppo della chiusura ad anello delle catene laterali per formare un centro di sali di sulfone. Quando il ligando peptidico si combina con la proteina bersaglio, il gruppo salino solfonico reagisce covalentemente con la proteina Cys spazialmente vicina. Negli ultimi anni, Shi et al. hanno progettato un nuovo metodo per stabilizzare il peptide ciclico28. Il sale di solfonio sul peptide ciclico è stato ridotto da un agente riducente con un gruppo sulfidrilico che è stato ridotto reversibilmente a Met. Tuttavia, la reazione ha avuto una bassa efficienza, che è stata dannosa per i successivi studi di applicazione biologica. Nel presente studio, è stata progettata una reazione di chiusura dell'anello Met-Cys e propargyl bromuro-Cys, con un singolo sale di solfonio che rimane sulla catena laterale del peptide ciclico. Il sale di solfonio agiva come una nuova testata che reagiva covalentemente con la proteina Cys nelle vicinanze spaziali. In breve, un peptide mutato Cys e Met è stato ciclizzato mediante alchilazione intramolecolare, con conseguente generazione di un centro di solfonio on-tether. In questo processo, la formazione di un ponte a catena laterale era fondamentale per i peptidi ciclici. Nel complesso, questo protocollo descrive una ciclizzazione dettagliata del peptide a base di solfonio che si ottiene utilizzando semplici condizioni e operazioni di reazione. L'obiettivo è quello di sviluppare un metodo potenziale per ulteriori applicazioni biologiche di ampia portata.

<table><tbody><tr><td>1,3-bis(bromometil)-benzene</td><td>Energia</td><td>D0215</td><td></td></tr><tr><td>Acido 1,3-dimetilbarbiturico</td><td></td><td>Energia A46873</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR e HSQC</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; AVANCE-III 400</td><td></td></tr><tr><td>1-idrossibenzotriazolo idrato</td><td>Energia</td><td>E020543</td><td></td></tr><tr><td>2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU)</td><td>Energia</td><td>A1797</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptopiridina</td><td>Energia</td><td>Y31130</td><td></td></tr><tr><td>Acido 6-amminocaproico</td><td>Energia</td><td>A010678</td><td></td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Energia</td><td>A01021454</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di ammonio</td><td>Energia</td><td>12980</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Energia</td><td>W330229</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldamento digitale Raffreddamento Bagno a secco</td><td> Thermo Scientific</td><td>88880029</td><td></td></tr><tr><td>Diisopropiletilamina (DIPEA)Energia</td><td></td> <td>W320014</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil formammide (DMF)</td><td>Energia</td><td>B020051</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Energia</td><td>A10027</td><td></td></tr><tr><td>Massa di ionizzazione elettrospray</td><td>SHIMADZU2020</td><td>&nbsp; LC-MS2020</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30101</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30902</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31001</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31301</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-TrP(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31801</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31901</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R32001</td><td></td></tr> Cromatografia ad alte prestazioni di <tr><td>energia</td><td>W810042</td><td></td>di <td>acido formico</td></tr><tr><td> </td><td>SHIMADZU</td><td>LC-2030</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Morfolina</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td></td></tr> Reagente <tr><td>N,N'-Diisopropilcarbodiimmide</td><td>B010023</td><td></td><td>Energia</td></tr><tr><td>Ninidrina</td><td>Energia</td><td>N7285</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di propargil</td><td>Energia</td><td>W320293</td><td></td></tr><tr><td>Rink Amide MBHA resina</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre per la raccolta di campioni per estrazione in fase solida (SPE)</td><td>&nbsp; Thermo Scientific</td><td>60300-403</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenilfosfina) palladio</td><td>Energy</td><td>T1350</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetti a tre vie</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Energy</td><td>B010737</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td> <td>J& K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIS)</td><td>Energia</td><td>T1533</td><td></td></tr></tbody></table>

costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

Negli ultimi anni, i peptidi ciclici hanno attirato una crescente attenzione nel campo della scoperta di farmaci grazie alle loro eccellenti attività biologiche e, di conseguenza, sono ora utilizzati clinicamente. È quindi fondamentale cercare strategie efficaci per sintetizzare peptidi ciclici per promuovere la loro applicazione nel campo della scoperta di farmaci. Questo articolo riporta un protocollo dettagliato per la sintesi efficiente di peptidi ciclici utilizzando bisalchilazione on-resina o intramolecolare (intermolecolare). Utilizzando questo protocollo, i peptidi lineari sono stati sintetizzati sfruttando la sintesi di peptidi in fase solida con cisteina (Cys) e metionina (Met) accoppiati simultaneamente sulla resina. Inoltre, i peptidi ciclici sono stati sintetizzati tramite bisalchilazione tra Met e Cys utilizzando un cavo sintonizzabile e un centro di solfonio on-tether. L'intero percorso sintetico può essere suddiviso in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l'accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell'acido trifluoroacetico (TFA). Inoltre, ispirato dalla reattività del centro del sulfonio, un gruppo propargilico è stato attaccato al Met per innescare l'aggiunta di tiolo-yne e formare un peptide ciclico. Successivamente, i peptidi grezzi sono stati essiccati e sciolti in acetonitrile, separati e quindi purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il peso molecolare del peptide ciclico è stato confermato dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e la stabilità della combinazione di peptidi ciclici con il riducente è stata ulteriormente confermata utilizzando HPLC. Inoltre, lo spostamento chimico nel peptide ciclico è stato analizzato da spettri di risonanza magnetica nucleare1 H (1H NMR). Nel complesso, questo protocollo mirava a stabilire una strategia efficace per sintetizzare peptidi ciclici.

Tutti i peptidi lineari sono stati sintetizzati su resina Rink-amide MBHA mediante sintesi manuale standard Fmoc in fase solida. Un esapeptide ciclico modello (Ac (ciclo-I)-WMAAAC-NH2) è stato costruito come descritto nella Figura 5A. In particolare, un nuovo centro chirale on-tether è stato generato dall'alchilazione di Met, con i due epimeri del peptide ciclico (Ia, Ib) confermati dall'HPLC in fase inversa. Inoltre, la conversione e il rapporto degli epimeri sono stati determina...

Questo protocollo presenta la sintesi di peptidi ciclici tramite bisalchilazione tra cisteina e metionina e la facile reazione tiolo-yne innescata dal centro del propargil sulfinfo.

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

In questo protocollo, è stato costruito il sale di solfonio che potrebbe agire come una nuova mano che ha reagito con la proteina cisteina sulla speciale vicinanza. Il vantaggio di questa tecnica era che questa reazione era veloce ed efficiente, e Met-catalyst libero e sviluppato un metodo semplice ed efficiente per stabilizzare i peptidi. Per iniziare, preparare la soluzione di deprotezione N-terminale 9-fluorinil-metilossicarbonile di 20% piperidina o 50% morfolina e DMF in un becher o pallone da 500 millilitri.Quindi, aggiungere 10 millilitri della soluzione di deprotezione alla colonna e l'azoto bollente nella soluzione per 30 minuti o due volte per cinque minuti. Scolare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza per cinque volte con diclorometano e N, N-dimetilformammide. Per rilevare la resina come una soluzione di colore giallo scuro, aggiungere un millilitro di N, N-dimetilformammide a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 microlitri di 5% di ninidrina a un tubo di vetro.Riscaldarlo a 130 gradi Celsius per tre minuti per valutare i cambiamenti nel colore della resina. Per l'accoppiamento dei peptidi, preparare una soluzione di miscela come descritto nel manoscritto in un tubo di polipropilene e scioglierla in tre millilitri di N, N-dimetilformammide. Quindi, aggiungere 173 microlitri di N, N-diisopropiletilammina o 154 microlitri di N, N'diisopropilcarbodiimide alla soluzione per inattivare l'amminoacido.Quindi, aggiungere la miscela alla colonna con resina e bollire con azoto per due ore. Dopo l'accoppiamento, aggiungere un millilitro di N, N-dimetilformammide a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 microlitri di 5% di ninidrina in un tubo di vetro. Riscaldarlo a 130 gradi Celsius per tre minuti mentre la resina è cambiata in incolore che conferma l'assenza di un gruppo amminico libero prima della fase di deprotezione.Dopo aver drenato la soluzione, lavare la resina come dimostrato in precedenza e aggiungere 10 millilitri della soluzione di deprotezione alla colonna. Quindi, bolle con azoto per 30 minuti o due volte per cinque minuti. E ancora, aggiungi una nuova soluzione.Aggiungere 10 millilitri di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con azoto per l'uso successivo. Pesare 100 milligrammi di resina in una colonna e lavare la resina con diclorometano e N, N-dimetilformammide prima della fase di accoppiamento. Preparare una soluzione per rimuovere il gruppo di protezione tritil-L-cisteina aggiungendo acido trifluoroacetico, triisopropilsilano, e miscela di diclorometano in un becher da 100 millilitri o pallone per rimuovere il gruppo protettivo.Aggiungere da cinque a 10 millilitri della soluzione preparata alla colonna per rimuovere il gruppo di protezione per 10 minuti. Ripeti sei volte con gorgogliamento di azoto fino a quando il colore giallo scompare completamente. Dopo aver scaricato la soluzione con una pompa per vuoto, lavare la resina come dimostrato in precedenza.Quindi, preparare una soluzione per reagire con cisteina deprotetta aggiungendo linker dialogenato e N, N-diisopropiletilammina in un becher da 50 millilitri o in un matraccio con N, N-dimetilformammide. Aggiungere da cinque a 10 millilitri della soluzione di reazione alla colonna per reagire con cisteina protetta per almeno tre ore con gorgogliamento di azoto. Anche in questo caso, scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza come dimostrato in precedenza.Per preparare la soluzione di ciclizzazione del peptide, aggiungere la miscela di acido trifluoroacetico in un becher da 20 millilitri o in un pallone nella cappa aspirante per la ciclizzazione del peptide. Quindi, aggiungere da cinque a 10 millilitri della soluzione di miscela al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail di acido trifluoroacetico per tre ore. Dopo aver disidratato e lavato la resina prima che la fase di accoppiamento sia dimostrata in precedenza, preparare una soluzione acquosa di acido formico all'1% e un bromuro di propargil millimolare e aggiungere alla soluzione di peptide di metionina.Quindi, agitare la reazione di accoppiamento di metionina e propargil bromuro a temperatura ambiente per 12 ore. Dopo la reazione, sciogliere il prodotto in un tubo di polipropilene e acetonitrile e filtrarlo attraverso una membrana filtrante da 0,22 micrometri. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.I peptidi ciclici sintetizzati utilizzando bis-alchilazione tra cisteina e metionina sono stati caratterizzati dallo spettro HPLC e LCMS, il che dimostra che gli epimeri mostravano tempi di ritenzione distinti e pesi molecolari identici. Le tracce HPLC degli epimeri e del suo prodotto coniugato hanno dimostrato la conversione dipendente dal tempo tra il peptide ciclico e il suo prodotto. Il peso molecolare dei peptidi ciclici sintetizzati utilizzando una reazione di tipo tiolo-yne è stato determinato mediante LCMS e il peptide è stato isolato e purificato mediante HPLC.I peptidi sono stati ulteriormente caratterizzati da NMR protonica e singoli spettri coerenti quantistici eteronucleari, rivelando lo spostamento chimico. Gli spettri NMR protonici della conversione dipendente dal tempo tra peptide ciclico e ditiotreitolo e ossido di deuterio sono stati ottenuti per esplorare la stabilità del peptide dovuta all'apertura dell'anello solfonico. I risultati hanno mostrato che non si sono formati prodotti di aggiunta o apertura dell'anello dopo 24 ore.Questa procedura ha stabilito una strategia efficace per sintetizzare peptidi ciclici. La reazione afferma che la selettività è anche migliorata formando una conferma che stabilizza il peptide di ciclizzazione, indicando che i peptidi ciclici erano promettenti catalizzatori di farmaci.

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