Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma Drosophila

Il conteggio delle unità formanti colonie, o CFU, è una tecnica standard in microbiologia, ma è lenta e richiede molte piastre di agar. La nostra tecnica offre un vantaggio di cento volte rispetto ai tradizionali metodi di conteggio CFU in entrambe le piastre di agar tempo. Abbiamo applicato la metodologia per misurare il microbioma intestinale di piccoli modelli animali, in particolare moscerini della frutta.

Questo protocollo è un modo semplice, veloce e automatizzato per quantificare le CFU nelle mosche gnotobiotiche. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro con strumentazione fabbricata fai-da-te per fotografare i CFU e software personalizzato per automatizzarne il conteggio. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato in qualsiasi esperimento di microbiologia in cui potrebbero essere utili metodi più efficienti di placcatura e conteggio CFU.

Maneggiare le mosche in modo efficiente e individuare le piastre richiede destrezza manuale, quindi questo dovrebbe essere praticato. L'utilizzo del software di conteggio automatico richiede un giudizio sulla soglia, quindi le ricevute dovrebbero essere confrontate con i conteggi manuali per identificare i parametri migliori per il tuo esperimento A dimostrare la procedura sarà Ren Dodge, un ricercatore del mio laboratorio che ha sviluppato la tecnica. Per iniziare, versare perle di vetro da 0,5 micron sul vassoio di misurazione delle perline.

Stendere le perline sul vassoio in modo che tutti i pozzetti siano pieni e livellati. Quindi, spazzolare via le perline in eccesso in un tubo conico. Ora, posizionare una piastra PCR semi-bordata capovolta sul vassoio di misurazione e allinearla con i pozzetti inserendola nella rientranza sul vassoio di misurazione.

Quindi, capovolgilo rapidamente per trasferire le perline. Rimuovere le perline in eccesso dalla superficie della piastra PCR. Assicurarsi che tutti i pozzetti contengano perline.

Se necessario, utilizzare un misurino per aggiungere perline a un singolo pozzetto. Quindi, coprire la piastra con un foglio di alluminio e autoclave. Prima di utilizzare la piastra, aggiungere 100 microlitri di PBS a ciascun pozzetto immediatamente prima di aggiungere le mosche utilizzando il pipetter a 96 canali.

Per sterilizzare in superficie le mosche anestetizzati, trasferire le mosche dalla fiala in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando un piccolo imbuto. Spruzzare immediatamente un millilitro di etanolo al 70% nel tubo, chiudere il tubo e mescolare per inversione per 10 secondi. Quindi, aspirare l'etanolo con una pipetta P-1000 evitando di aspirare eventuali mosche.

Dopo il lavaggio finale PBS, chiudere il tubo e picchiettarlo con forza sulla panca un paio di volte con il cappuccio rivolto verso il basso in modo che le mosche entrino nel tappo. Dopo aver aperto il tubo, erogare le mosche nei pozzetti usando una pinza e posizionare una mosca in ciascun pozzetto. Mantieni le mosche anestetizzate, mantenendo la piastra sul ghiaccio durante il carico.

Rimuovere le perle vaganti vicino ai pozzetti, poiché possono rompere il sigillo di alluminio e causare perdite. Assicurarsi che il lato opaco della pellicola di tenuta sia orientato verso il basso sulla piastra e che il lato lucido sia rivolto verso l'alto verso la termosaldatrice. Premere saldamente il termosaldante per cinque secondi e bruciare con l'applicatore manuale per fissare la pellicola.

Omogeneizzare le mosche per cinque minuti. Assicurarsi che le mosche siano completamente omogeneizzate e che la soluzione diventi colorata. Per rimuovere il liquido dalla pellicola sigillante, ruotare lungo la piastra del tallone per 30 secondi in un mini filatore a piastra a 350 G.Rimuovere la pellicola tenendo la piastra per evitare che schizzi goccioline di omogenato di mosca.

Posizionare tre piastre rettangolari di crescita dell'agar MRS con i coperchi aperti nell'armadio di biosicurezza per asciugare per almeno 10 minuti. Preparare due piastre di diluizione aggiungendo 100 microlitri di PBS a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti utilizzando un pipetter a 96 canali. Caricare un rack di punte P-20 sul pipetter a 96 canali.

Effettuare una diluizione 1:10 aspirando 11,1 microlitri di omogenato dalla piastra del campione. Ora, erogarlo nella prima piastra di diluizione contenente 100 microlitri di PBS sterile per pozzetto. Tenere la piastra di diluizione sullo scuotitore per 10 secondi a 600 giri/min.

Mescolare di nuovo pipettando su e giù almeno 10 volte. Trasferire 11,1 microlitri dalla prima piastra di diluizione alla seconda piastra di diluizione e ripetere le fasi di miscelazione per eventuali ulteriori diluizioni. Per le piastre spotting, caricare due microlitri da ciascun pozzetto nel pipetter a 96 canali.

Abbassare lentamente la testa del pipetter sulla piastra, evitando di pugnalare l'agar, e assicurarsi che tutti i punti siano stati erogati. Quindi, controllare che le macchie liquide si impregnino rapidamente nell'agar e non corrano insieme. Ripetere il processo di placcatura per le lastre di diluizione rimanenti come descritto nel manoscritto.

Una volta che il liquido è stato completamente assorbito nell'agar, capovolgere le piastre e incubarle fino a quando le colonie hanno raggiunto la dimensione ottimale. Organizza le lastre logicamente e tienile in un ordine specifico mentre fotografi. Orientali in modo che A1 sia nell'angolo in alto a sinistra per tutte le piastre.

Dopo aver rimosso il coperchio della piastra, posizionare la piastra sul palco con A1 orientato nell'angolo corretto. Immagina le tavole. Trasferisci le immagini su un computer e rinominale, incluso il nome dell'esperimento, il tipo di supporto, il fattore di diluizione e altri dettagli pertinenti.

Organizzare le immagini da elaborare per la quantificazione in una cartella. I nomi dei file che distinguono le targhe diventano titoli di colonna per ogni set di conteggi nel foglio di calcolo di output. Creare sottocartelle denominate Ritagliato e Ricevute nella cartella.

Queste cartelle riceveranno i file di output. Ora avvia il plug-in Croptacular da ImageJ e fai clic su OK per iniziare il ritaglio. Apparirà una finestra di dialogo per scegliere la cartella di origine.

Fare clic su OK. Selezionare la cartella di origine e fare clic su Apri. Quindi, fare clic su OK nella finestra di dialogo per scegliere la directory di destinazione. Selezionare la cartella di destinazione e premere Apri.

Se l'immagine è già diritta, premi semplicemente la barra spaziatrice. In caso contrario, raddrizzare l'immagine disegnando una linea lungo un bordo che dovrebbe diventare orizzontale. Ridisegna la linea tutte le volte che è necessario se l'immagine non appare diritta.

Quindi, disegna una casella di confine per l'area di conteggio e regola le sue dimensioni e proporzioni fino a quando tutti i punti sono all'interno delle loro celle. Trascinare il cursore all'esterno della casella del limite per aggiornare la griglia. Quando la griglia sembra buona, premere Spazio.

Poiché il plugin presuppone che tutte le foto siano allineate in modo identico, assicurati che l'immagine successiva ruoti automaticamente allo stesso angolo della prima. Se questo è corretto, premere la barra spaziatrice per continuare. Altrimenti, raddrizzare l'immagine come prima.

La griglia richiama anche la stessa posizione dell'immagine precedente. Regolare se necessario e premere la barra spaziatrice. Avvia Count-On-It e seleziona Gridiron.

Impostate l'intensità della colonia di soglia in base a un valore di intensità pixel superiore e inferiore. Rendi la soglia il più rigorosa possibile, pur selezionando tutte le colonie. Fare clic su OK nella finestra di dialogo Azione richiesta quando la soglia è soddisfacente, quindi fare clic su OK per continuare.

Nella prima immagine, viene data la possibilità di procedere o tornare al menu di configurazione. Per procedere con il processo batch, fare clic su OK. Quindi, selezionare una cartella per conservare la tabella delle ricevute e dei risultati. Utilizzare la cartella Ricevute creata in precedenza.

Dopo la prima immagine, le immagini seguenti verranno impostate per impostazione predefinita sulla stessa soglia delle impostazioni precedenti. Fare clic su OK per utilizzare queste impostazioni o modificare le impostazioni. Esaminare le ricevute di conteggio prodotte dal software e correggere manualmente eventuali errori di conteggio.

Il plugin ImageJ è statisticamente accurato, ma si verificano errori. Prova le ricevute per esaminare i valori anomali e identificare i conteggi errati. Il software salva i dati CFU come file CSV nella stessa cartella delle ricevute.

Per le mosche colonizzate con Lactobacillus plantarum, c'è stata una significativa diminuzione dei batteri per le mosche che sono state trasferite giornalmente al cibo sterile, trasferite giornalmente, tenute su cibo sterile quattro ore prima dell'analisi, o trasferite giornalmente e mantenute su agar sterile quattro ore prima dell'analisi rispetto alle mosche che non sono mai state trasferite al cibo sterile dopo l'inoculazione. Risultati simili sono stati osservati nelle mosche alimentate con Acetobacter indonesiensis, dove le mosche trasferite, post-trasferite e cancellate hanno mostrato una significativa riduzione delle CFU, ma il lavaggio non ha avuto un effetto misurabile, suggerendo che la riduzione delle CFU era dovuta all'eliminazione dei batteri dall'intestino piuttosto che dalla cuticola. Il conteggio dei CFU negli spot da 2 a 25 colonie per spot non ha mostrato alcuna differenza rispetto al metodo tradizionale.

I punti con una media di 35 colonie hanno mostrato CFU inferiori rispetto alle piastre di diffusione di controllo. Questa riduzione potrebbe essere dovuta alla sovrapposizione di colonie in punti densi. Nelle foto su tavola, l'intensità della colonia era superiore del 300% rispetto allo sfondo.

Le colonie mCherry-positive di Lactobacillus plantarum hanno mostrato un'intensità rossa superiore del 1.000% rispetto alle colonie mCherry-negative. Le colonie Acetobacter indonesiensis GFP-positive hanno mostrato un'intensità verde superiore del 200% rispetto alle colonie GFP-negative. Il plug-in Count-On-It per ImageJ automatizza il conteggio CFU dalle foto delle lastre.

Le colonie vengono rilevate con precisione, con conteggi comparabili al conteggio manuale. Le ricevute di conteggio possono essere utilizzate per identificare i conteggi errati. La modifica delle soglie dimensionali e delle lunghezze d'onda della fluorescenza consente di contare separatamente diverse morfologie delle colonie.

È essenziale assicurarsi che la piastra sia ben sigillata prima di bordare le perline. È anche importante progettare controlli positivi per calibrare le misurazioni. Usiamo questa tecnica anche per studiare popolazioni in vitro di batteri in piastre a 96 pozzetti, che ci permettono di studiare comunità miste di batteri.

Questa tecnica consente approcci di screening ad alto rendimento per misurare la colonizzazione intestinale e la variazione biologica nella colonizzazione.