Name: Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dellefficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri la preparazione e la valutazione di un vaccino tumorale nanoemulsione nasale autoassemblato in vitro e in vivo. Questo metodo offre basse tossicità sistemiche e promettenti effetti terapeutici per lo sviluppo futuro di vaccini mucosi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è stato supportato dal n. 31670938, 32070924, 32000651 del National Natural Science Foundation Program of China, n. 2014jcyjA0107 e n. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing, n. 2020XBK24 e n. 2020XBK26 dei progetti speciali dell'Università medica dell'esercito e n. 202090031021 e n. 202090031035 del programma nazionale di innovazione e imprenditorialità per studenti universitari.

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la linea guida sugli animali da laboratorio per la revisione etica del benessere degli animali (GB / T 35892-2018) e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare. I topi sono stati sottoposti a eutanasia mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio all'1%.
1. Preparazione dell'I-OAV NE
<ol><li>Mescolare 1 mg di monofosforil lipide A (MPLA) con 100 μL di DMSO, vortice per 5 minuti e lasciare riposare per 4 ore a temperatura ambiente (RT) per sciogliersi completamente.</li>
	<li>Aggiungere Tween 80 e I-OVA quantitativamente e mescolare. NOTA: Tween 80 e I-OAV sono stati miscelati con un rapporto di massa di 25:119.</li>
	<li>Aggiungere lo squalene nella miscela preparata al punto 1.2 (7:3, Smix: squalene).</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di MPLA (10 mg/ml) alla miscela preparata al punto 1.3.</li>
	<li>Preparare il vaccino in nanoemulsione utilizzando metodi di emulsificazione a bassa energia19: aggiungere la soluzione miscelata alle goccioline d'acqua a circa il 70% del volume totale e mescolare delicatamente per ottenere una miscela trasparente e facilmente scorrevole. NOTA: Il controllo BNE (emulsione in bianco) è stato preparato con lo stesso metodo, sostituendo l'acqua con I-OVA.</li>
</ol>2. Caratterizzazione fisico-chimica e stabilità
NOTA: Valutare la distribuzione delle dimensioni delle gocce, il potenziale zeta e altri dati fisico-chimici del vaccino I-OVA NE seguendo le fasi 2.1-2.3; eseguire la caratterizzazione morfologica del vaccino I-OVA NE seguendo le fasi 2.4-2.7; ed esaminare la struttura 3D del vaccino I-OVA NE seguendo i passaggi 2.8-2.9.
<ol><li>Mescolare 50 mg di proteine muconiche con 100 ml di acqua per preparazioni iniettabili per preparare una soluzione di mucina allo 0,05%.</li>
	<li>Diluire 4 mg/mL I-OVA NE 200 volte con 0,05 mg/mL di proteine muconiche o acqua deionizzata.</li>
	<li>Osservare le dimensioni delle particelle, il potenziale zeta, l'indice di polidispersione (PDI) e la mobilità elettroforetica a 25 °C utilizzando un nanoanalizzatore19.</li>
	<li>Diluire 10 μL di I-OVA NE 200 volte con 2 ml di acqua deionizzata.</li>
	<li>Posizionare 5 μL di vaccino I-OVA NE prediluito (fase 2.4) su una griglia di rame rivestita di carbonio e coprirla con 10 μL di acido fosfotungstico all'1% per 3 minuti.</li>
	<li>Rimuovere l'acido fosfotungstico in eccesso con carta da filtro.</li>
	<li>Ottenere immagini utilizzando TEM. Posizionare un campione da 10 μL diluito 50 volte su una griglia di rame al carbonio a 100 maglie e lasciarlo riposare a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti prima di aggiungere 10 μL di acido fosfotungstico (1%, pH 7,4). Esaminare tutti i campioni mediante TEM ad una tensione di 120 kV.</li>
	<li>Caratterizzare la morfologia molecolare dell'I-OVA NEutilizzando un microscopio a forza atomica ad alta risoluzione. Ottenere le immagini a colori di I-OVA NE nelle seguenti condizioni: per sonde di tungsteno (costante di forza: 0,06 N·m-1); Intervallo di scansione: 450 nm x 450 nm; Modalità di tocco: modalità di imaging; e metodo di scansione: scansione punto per punto su RT.</li>
</ol>3. Saggi di tossicità in vitro e in vivo
NOTA: La tossicità in vitro del vaccino I-OVA NE è stata valutata seguendo le fasi 3.1-3.9 e la tossicità in vivo del vaccino I-OVA NE è stata valutata seguendo le fasi 3.10-3.13.
<ol><li>Rianimare le cellule epiteliali umane BEAS-2B seguendo le fasi 3.1.1-3.1.4 e coltivarle in un mezzo di crescita completo a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . NOTA: Per preparare il terreno di crescita completo, aggiungere siero bovino fetale (FBS) e penicillina/streptomicina al terreno RPMI-1640 a concentrazioni finali rispettivamente del 10% e dell'1%.<ol><li>Accendere il bagnomaria e regolare la temperatura a 37 °C. Rimuovere i flaconcini di cellule congelati in azoto liquido e scongelarli rapidamente a bagnomaria a 37 °C.</li>
		<li>Dopo lo scongelamento, pipettare rapidamente le cellule in una provetta sterile da centrifuga da 15 ml, aggiungere 2 ml del terreno di coltura completo e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante, aggiungere 2 ml del terreno di crescita completo per risospendere le cellule e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante, aggiungere 6 ml di terreno di crescita completo per risospendere le cellule e trasferire le cellule in un pallone di coltura T25 per coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .</li>
	</ol></li>
	<li>Quando la densità cellulare raggiunge l'80% -90%, scartare il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per digerire le cellule per 1-2 minuti. Quando si osserva l'arrotondamento delle cellule, aggiungere immediatamente 4 ml del mezzo di crescita completo per neutralizzare la tripsina.</li>
	<li>Mescolare e aspirare i campioni in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo completo RPMI-1640. Utilizzare 20 μL per il conteggio delle cellule e diluire le cellule a 1 x 105 cellule/ml.</li>
	<li>Placcare le celle BEAS-2B ad una densità di 1 x 104 celle/pozzetto in piastre a 96 pozzetti in 100 μL di RPMI-1640 mezzo completo e preincubare le piastre per 24 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .</li>
	<li>Scartare il surnatante e aggiungere 100 μL di I-OVA NE, 100 μL di I-OVA+BNE (miscelati fisicamente) e 100 μL di I-OAV prediluiti con un mezzo di crescita completo a varie concentrazioni finali (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml), con BNE come controllo. Incubare per 24 h a 37 °C. NOTA: Aggiungere 100 μL di terreno di crescita completo ai gruppi di controllo negativi e 100 μL di sospensione cellulare (1 x 105/mL) ai gruppi di controllo positivi.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e aggiungere 90 μL di terreno di crescita completo e 10 μL di soluzione CCK-8 a ciascun pozzetto della piastra.</li>
	<li>Incubare la piastra per 2 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di piastre marcato con enzima.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di sopravvivenza delle cellule BEAS-2B come indicato nella seguente equazione: (Campione OD450− Controllo negativo OD450/Controllo positivo OD450− Controllo negativo OD450) × 100%</li>
	<li>Dividere casualmente topi C57BL / 6 di 6 settimane in cinque gruppi (n = 5 in ciascun gruppo) e anestetizzarli con isoflurano al 4% per l'induzione. Mantenere l'anestesia con isoflurano al 2%. Utilizzare l'unguento al solfato di neomicina sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza.</li>
	<li>Utilizzare punte per pipette da 10 μL per eseguire l'immunizzazione nasale dei topi con 10 μL/narice di I-OVA, I-OVA+BNE e IOVA NE a 4 mg/ml per tutti i 3 giorni. Utilizzare BNE e PBS come controllo sperimentale. NOTA: Fornire supporto termico fino a quando l'animale non si riprende dall'anestesia.</li>
	<li>Eutanasia di tutti i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg 1% di sodio pentobarbital il giorno 4.</li>
	<li>Tagliare campioni di circa 3 mm di spessore di tessuti nasali con le forbici e rimuovere i tessuti polmonari.</li>
	<li>Fissare i tessuti nasali e l'intero tessuto polmonare in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Disidratare i tessuti attraverso un gradiente seriale di alcol e xilene e quindi incorporarli nella paraffina. Tagliare i blocchi di cera finiti su un'affettatrice di paraffina con uno spessore di 4 μm.</li>
	<li>Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina (H & E). Quindi, osservare al microscopio la tossicità della mucosa, tra cui iperemia, edema, infiltrazione di neutrofili e danni strutturali nella mucosa nasale e nel tessuto polmonare, 7.</li>
</ol>4. Assorbimento cellulare in vitro
<ol><li>Piastre BEAS-2B celle ad una densità di 5 x 10 5 celle/pozzetto in piastre da 12 pozzetti con vetrini di copertura in 2 ml del terreno di crescita completo e preincubare le piastre per una notte a 37 °C in un incubatore al5 % di CO2 .</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di I-OVA NE marcato con FITC (purezza: 98,3%, prodotto dall'azienda, 4 mg/ml) o I-OVA (4 mg/ml) a 900 μL di sospensione cellulare e porre a 37 °C per 90 minuti. NOTA: Preparare I-OVA NE marcato con FITC come descritto al punto 4.1. Aggiungere 1 mL di terreno di crescita completo ai gruppi di controllo.</li>
	<li>Lavare tre volte con 0,1 M PBS (1 mL/pozzetto) per 30 minuti a 37 °C dopo il trattamento.</li>
	<li>Fissare questi campioni con paraformaldeide al 4% per 20 minuti al buio. Dopo la fissazione, rimuovere la paraformaldeide e lavare 3 volte con 0,1 M PBS (1 mL/pozzetto) per 30 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Preincubare i campioni con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) ad una concentrazione finale di 10 μg/mL per 10 minuti al buio, quindi lavare 5 volte con 0,1 M PBS (1 mL/pozzetto) per 30 minuti a 37 °C dopo il trattamento.</li>
	<li>Ottenere l'assorbimento cellulare da parte di CLSM con le seguenti impostazioni dei parametri: Dimensioni fotogramma: 512 px x 512 px, Velocità di scansione: 8; Passo di linea: 1; Media: 2.</li>
</ol>5. Rilascio in vivo
<ol><li>Anestetizzare topi nudi con gas isoflurano al 4% e mantenere l'anestesia al 2% di isoflurano. Immunizzare topi nudi per via intranasale con 10 μL di I-OAV marcato con PE a 4 mg/ml o I-OVA NE marcato con PE a 4 mg/ml in ciascuna narice.</li>
	<li>A 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h e 24 h, catturare tutti i topi sotto anestesia dal sistema IVIS.</li>
	<li>Eseguire una scansione in background immediatamente prima della somministrazione intranasale per fornire un valore di soglia (Min = 1,06 x 106) per regolare le immagini raccolte in tutti i punti temporali.</li>
	<li>Fare clic sul software Living Image per avviare la sequenza e fare clic su Inizializza per inizializzare il sistema IVIS</li>
	<li>Quando viene inizializzata, la spia di stato della temperatura nel pannello di controllo di acquisizione IVIS è rossa. Quando la spia di stato della temperatura diventa verde, è possibile eseguire l'imaging.</li>
	<li>Fare clic su Creazione guidata immagini e quindi scegliere Fluorescenza nella finestra di dialogo visualizzata.</li>
	<li>Regolare i seguenti parametri: Tempo di esposizione: auto sec, Binning: 8, F/Stop: 2, Campo visivo: D.</li>
	<li>Selezionare il filtro di eccitazione da 620 nm e il filtro di emissione da 670 nm. Fare clic su Acquisisci sequenza per acquisire l'immagine.</li>
	<li>Elabora le immagini live di tutti i mouse e i dati di radianza con il software Living Image.<ol><li>Dopo aver acquisito l'immagine, fai clic su Strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti, seleziona Cerchio e crea un cerchio ROI .</li>
		<li>Clicca su Misura ROI per ottenere un valore quantitativo per l'area ROI .</li>
	</ol></li>
</ol>6. Efficacia antitumorale in vivo
<ol><li>Rinfrescare e coltivare le cellule E.G7-OVA del linfoma di topo da EL4 con un terreno di crescita completo seguendo i passaggi 2.1.1-2.1.4. NOTA: Per preparare il terreno di coltura completo della cella E.G7-OVA, mescolare RPMI 1640 terreno con 2 mM di L-glutammina regolato per contenere 1,5 g / L di bicarbonato di sodio, 4,5 g / L di glucosio, 10 mM HEPES e 1,0 mM di piruvato di sodio e integrato con 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo e 0,4 mg / mL G418, 90% e siero fetale bovino, 10%.</li>
	<li>Sottocoltura delle cellule con un rapporto di 1:2 quando le cellule raggiungono una densità compresa tra 1 x 106 cellule/ml e 1 x 107 cellule/ml.</li>
	<li>Valutare l'effetto protettivo preventivo sui topi come descritto nei passaggi 6.3.1-6.3.4.<ol><li>Dividere casualmente topi C57BL / 6 di 6 settimane in cinque gruppi (n = 8 in ciascun gruppo). Anestetizzare topi nudi con gas isoflurano al 4% e mantenere l'anestesia con isoflurano al 2%. Rasare parzialmente i peli posteriori e l'unguento al solfato di neomicina sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza.</li>
		<li>Immunizzare per via intranasale i topi con 10 μL di 1 mg / mL I-OVA, BLE + I-OVA o I-OVA NE in ciascuna narice, BNE (diluito quattro volte con PBS) o un controllo PBS 3 volte con un intervallo di 7 giorni tra ogni immunizzazione.</li>
		<li>Inoculare tutti i topi ipodermicamente nella schiena destra con 5 x 105 cellule E. G7-OAV il 7 ° giorno dopo l'immunizzazione finale.</li>
		<li>A 0, 6, 9, 12, 15 e 18 giorni dopo l'immunizzazione finale, monitorare i volumi del tumore misurando due assi del tumore utilizzando calibri digitali e registrare la sopravvivenza di 30 giorni (dopo l'immunizzazione finale) dei topi.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutare l'effetto protettivo terapeutico sui topi dopo inoculazione di cellule E.G7-OAV come descritto nelle fasi 6.4.1-6.4.3. Per il raggruppamento e la manipolazione dei topi fare riferimento al punto 6.3.1.<ol><li>Il giorno 0, iniettare i topi C57BL/6 per via sottocutanea nella schiena destra con cellule E.G7-OAV (5 x 105 cellule/topo).</li>
		<li>A 0, 7 e 14 giorni dopo l'iniezione, immunizzare tutti i topi immunizzati per via intranasale con 10 μL di I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (tutti a concentrazioni di 1 mg / ml), BNE o PBS tre volte in ciascuna narice.</li>
		<li>A 0, 6, 9, 12, 15 e 18 giorni dopo l'iniezione, monitorare il volume del tumore e registrare la sopravvivenza a 30 giorni dei topi. NOTA: Se il volume del tumore supera i 3.000 mm3, i topi dovrebbero essere eutanizzati per ragioni umane e questi topi saranno considerati morti nella curva di sopravvivenza. Il volume del tumore è calcolato con una formula ellissoidale modificata come indicato nella seguente equazione: Volume = π/6 x L xL 2 dove L rappresenta la lunghezza del tumore e W rappresenta la larghezza del tumore (unità di lunghezza: mm, unità di volume: mm3).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Analisi statistica
<ol><li>Analizza le differenze nei dati tra i diversi gruppi utilizzando un software statistico appropriato con ANOVA unidirezionale, confronti multipli di Tukey o test t di uno studente. Utilizzare il metodo Kaplan-Meier per stimare i risultati di sopravvivenza e confrontare i gruppi con le statistiche log-rank. Esprimere tutti i risultati come media ± SD. Il significato dei valori P P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001 è rappresentato utilizzando *, ** e ***, rispettivamente, sui grafici. </li>
</ol>

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection%2C+severity%2C+hospitalization%2C+and+mortality%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160(2022).</li>
<li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+vaccine%2C+immunological+memory+and+cancer+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li>
<li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363(2022).</li>
<li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li>
<li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OVA-specific+CD8%2B+T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li>
<li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function%3A+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li>
<li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li>
<li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220(2022).</li>
<li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+%28IKVAV%29+peptide+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li>
<li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li>
<li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954(2008).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li>
<li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li>
<li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li>
<li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920(2021).</li>
<li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li>
<li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJafari+Eskandari%2C+M+%22Electron+Crystallography%22">Electron Crystallography</a>. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).</li>
<li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477(2022).</li>
<li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+nanoparticles%3A+Production%2C+characterization%2C+toxicology+and+ecotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731(2020).</li>
<li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies%3A+A+matter+of+hierarchical+control%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li>
<li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+%28BEAS-2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020(2022).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li>
<li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunopotentiator%2C+ophiopogonin+D%2C+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).</li>
<li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

I nanovaccini funzionalizzati con membrane di immunociti hanno grandi vantaggi nella terapia mirata alla malattia e gli effetti collaterali sono ridotti al minimo da proprietà come il tropismo tumorale unico, l'identificazione di bersagli specifici, circolazione prolungata, interazioni intercellulari migliorate e bassa tossicità sistemica. Possono anche essere facilmente integrati con altri moduli di trattamento per trattare i tumori in modo cooperativo16,20. Gli...

Come una delle innovazioni più importanti per la salute pubblica, i vaccini svolgono un ruolo chiave nella lotta contro l'onere globale delle malattie umane1. Ad esempio, attualmente sono in fase di sperimentazione oltre 120 vaccini candidati per le malattie COVID-19, alcuni dei quali sono stati approvati in molti paesi2. Rapporti recenti affermano che i vaccini contro il cancro hanno effettivamente migliorato i progressi dei trattamenti clinici contro il cancro perché dirigono il sistema immunitario dei malati di cancro a riconoscere gli antigeni come estranei al corpo3. Inoltre, epitopi multipli di cellule T situati all'interno o all'esterno delle cellule tumorali possono essere utilizzati per progettare vaccini peptidici, che hanno mostrato vantaggi nel trattamento dei tumori metastatici a causa della mancanza della significativa tossicità associata alla radioterapia e alla chemioterapia 4,5. Dalla metà degli anni 1990, studi preclinici e clinici per il trattamento del tumore sono stati condotti principalmente utilizzando vaccini peptidici antigene, ma pochi vaccini mostrano un adeguato effetto terapeutico sui malati di cancro6. Inoltre, i vaccini antitumorali con epitopi peptidici hanno scarsa immunogenicità e insufficiente efficienza di consegna, che può essere dovuta alla rapida degradazione dei peptidi extracellulari che diffondono rapidamente dal sito di somministrazione, il che porta a un insufficiente assorbimento dell'antigene da parte delle cellule immunitarie7. Pertanto, è necessario superare questi ostacoli con la tecnologia di consegna del vaccino.
OAV257-264, l'epitopo MHC di classe I legante 257-264 espresso come proteina di fusione, è un epitopo modello 8frequentemente usato. Inoltre, l'OAV257-264 è cruciale per la risposta immunitaria adattativa contro i tumori, che dipende dalla risposta citotossica dei linfociti T (CTL). È mediato dalle cellule T CD8+ antigene-specifiche nel tumore, che sono indotte dal peptide OAV257-264 . È caratterizzato da un insufficiente granzima B, che viene rilasciato dalle cellule T citotossiche, portando all'apoptosi delle cellule bersaglio8. Tuttavia, la somministrazione di peptidi OAV257-264 liberi può indurre poca attività CTL perché l'assorbimento di questi antigeni avviene in cellule non specifiche piuttosto che in cellule presentanti l'antigene (APC). La carenza di un'appropriata stimolazione immunitaria provoca l'attività CTL5. Pertanto, l'induzione di un'efficace attività CTL richiede notevoli progressi.
A causa della barriera fornita dalle cellule epiteliali e della continua secrezione di muco, gli antigeni del vaccino vengono rapidamente rimossi dalla mucosa nasale 9,10. Lo sviluppo di un vettore vaccinale efficiente che possa passare attraverso il tessuto mucoso è fondamentale perché le cellule presentanti l'antigene sono situate sotto l'epitelio mucoso9. L'iniezione intranasale di vaccini induce teoricamente l'immunità mucosale per combattere l'infezione della mucosa11. Inoltre, la somministrazione nasale è un metodo di somministrazione efficace e sicuro per i vaccini grazie alla sua praticità, all'evitamento della somministrazione intestinale e al miglioramento della conformità del paziente7. Pertanto, la consegna nasale è un buon mezzo di somministrazione per il nuovo nanovaccino epitopo peptidico.
Diversi biomateriali sintetici sono stati ideati per combinare epitopi di interazioni cellula-tessuto e cellula-cellula. Alcune proteine bioattive, come Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), sono state introdotte come parte della struttura dell'idrogel per conferire bioattività12. Questo peptide probabilmente contribuisce all'attaccamento, alla migrazione e alla crescita delle cellule13 e lega le integrine α 3β1 e α6β1 per interagire con diversi tipi di cellule tumorali. IKVAV è un peptide di adesione cellulare derivato dalla proteina di membrana basale della laminina αcatena 1 che è stata originariamente utilizzata per modellare il microambiente neurale e causare la differenziazione neuronale14. Pertanto, trovare un veicolo di consegna efficiente per questo nuovo vaccino è importante per il controllo della malattia.
Sistemi di emulsione recentemente riportati, come W805EC e MF59, sono stati anche composti per la somministrazione della cavità nasale del vaccino influenzale inattivato o dell'antigene di superficie dell'epatite B ricombinante e illustrati per innescare sia l'immunità mucosale che sistemica15. Le nanoemulsioni (NE) presentano i vantaggi di una facile somministrazione e di una comoda co-formazione con adiuvanti efficaci rispetto ai sistemi di erogazione della mucosa particolata16. È stato segnalato che i vaccini a nanoemulsione alterano il fenotipo allergico in modo prolungato diverso dalla desensibilizzazione tradizionale, che si traduce in effetti soppressivi a lungo termine17. Altri hanno riferito che le nanoemulsioni combinate con antigeni immunodominanti specifici per Mtb potrebbero indurre potenti risposte delle cellule della mucosa e conferire una protezione significativa18. Pertanto, è stato progettato un nuovo nanovaccino autoassemblato intranasale con il peptide sintetico IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, il peptide costituito da IKVAV legato all'OVA257-264). È importante valutare sistematicamente questo nuovo nanovaccino.
Lo scopo di questo protocollo è valutare sistematicamente le caratteristiche fisico-chimiche, la tossicità e la stabilità del nanovaccino, rilevare se l'assorbimento dell'antigene e gli effetti protettivi e terapeutici sono migliorati utilizzando mezzi tecnici ed elaborare i principali contenuti sperimentali. In questo studio, abbiamo stabilito una serie di protocolli per studiare le caratteristiche fisico-chimiche e la stabilità, determinare l'entità della tossicità dell'I-OVA NE alle cellule BEAS-2B da CCK-8 e osservare la capacità di presentare l'antigene delle cellule BEAS-2B al vaccino utilizzando la microscopia confocale, valutare i profili di rilascio di questo nuovo nanovaccino in vivo e in vitro.e rilevare l'effetto protettivo e terapeutico di questo vaccino utilizzando un modello murino portatore di tumore E.G7-OVA.

<table><tbody><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre Bio-Rad 6.0</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA&</td><td>nbsp; Kit Bio-Rad 6.0</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8</td><td>Dojindo, Giappone</td><td>Centrifuga CK04</td><td></td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf, Germania&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Certificato FITC I-OVA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>HF 90/240 Incubatrice Heal</td><td>Force, Svizzera</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Fornitore verificato - Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td><td>E2695</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon, Giappone</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>IPC-208</td><td>Chong Qing University, Cina</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS system&nbsp;</td><td>Calibro Life Science Società a responsabilità limitata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1230 TEM</td><td>JEOL Società a responsabilità limitata del Giappone</td><td>1230 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., Regno Unito</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MPLA&</td><td>nbsp; Invivogen Lit. Co.</td><td>tlrl-mpla</td><td></td></tr><tr><td>Unguento al solfato di neomicina</td><td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H31022262</tr><tr><td>OVA257&ndash; 264</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Coniugazione di peptidi sintetici (I-OVA) di IKVAV-PA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Zeiss LSM800 microscopio a fluorescenza confocale a scansione laser</td><td>Zeiss, Germania</td><td>Zeiss LSM800</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dell'efficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

I peptidi epitopici hanno attirato l'attenzione diffusa nel campo dei vaccini tumorali a causa della loro sicurezza, alta specificità e produzione conveniente; in particolare, alcuni epitopi MHC I-limitati possono indurre un'efficace attività citotossica dei linfociti T per eliminare le cellule tumorali. Inoltre, la somministrazione nasale è una tecnica di consegna efficace e sicura per i vaccini tumorali grazie alla sua praticità e alla migliore compliance del paziente. Tuttavia, i peptidi epitopici non sono adatti per la consegna nasale a causa della loro scarsa immunogenicità e mancanza di efficienza di consegna. Le nanoemulsioni (NE) sono sistemi termodinamicamente stabili che possono essere caricati con antigeni e consegnati direttamente alla superficie della mucosa nasale. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) è il pentapeptide principale della laminina, un peptide legante l'integrina espresso dalle cellule epiteliali respiratorie umane. In questo studio, un vaccino antitumorale epitopo autoassemblato intranasale contenente il peptide sintetico IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) è stato preparato con un metodo di emulsificazione a bassa energia. La combinazione di IKVAV e OVA257-264 può migliorare l'assorbimento dell'antigene da parte delle cellule epiteliali della mucosa nasale. Qui, stabiliamo un protocollo per studiare le caratteristiche fisico-chimiche mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), microscopia a forza atomica (AFM) e diffusione dinamica della luce (DLS); stabilità in presenza di proteine mucina; tossicità esaminando la vitalità cellulare delle cellule BEAS-2B e dei tessuti nasali e polmonari dei topi C57BL/6; assorbimento cellulare mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM); rilasciare profili mediante imaging di piccoli animali in vivo; e l'effetto protettivo e terapeutico del vaccino utilizzando un modello portatore di tumore E.G7. Prevediamo che il protocollo fornirà indizi tecnici e teorici per lo sviluppo futuro di nuovi vaccini per mucosa peptidica epitopo delle cellule T.

Secondo il protocollo, abbiamo completato la preparazione e la valutazione sperimentale in vitro e in vivo della somministrazione del nanovaccino del tumore nasale. TEM, AFM e DLS sono mezzi efficaci per la valutazione delle caratteristiche di base del potenziale zeta superficiale e della dimensione delle particelle del nanovaccino (Figura 1). Le cellule epiteliali BEAS-2B sono un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro dei vaccini nasali (<stro...

Qui, presentiamo metodi dettagliati per la preparazione e la valutazione del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo.

Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dell'efficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Il nuovo vaccino a nanoemulsione ha grandi vantaggi nella terapia tattica della malattia. Questi effetti impostati sono minimizzati da proprietà come il chopismo tumorale unico, l'identificazione di tattiche specifiche e la bassa tossicità sistemica. Prevediamo che il protocollo fornirà indizi tecnici e teorici per lo sviluppo futuro di nuovi vaccini per mucosa peptidica ectype delle cellule T.Inizia mescolando un milligrammo di monofosforolo lipide A con 100 microlitri di DMSO. Vortice per cinque minuti e lasciarlo sciogliere per quattro ore a temperatura ambiente. Aggiungere quantitativamente TWEEN 80 e I-OVA.Mescolare i componenti e aggiungere lo squalene. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione MPLA alla miscela preparata. Per preparare il vaccino nano emulsione, aggiungere la soluzione miscelata alle goccioline d'acqua a circa il 70% del volume totale e mescolare delicatamente per ottenere una miscela trasparente e facilmente scorrevole.Per i test in vitro, iniziare con il risveglio delle cellule epiteliali BEAS2B. Accendere il bagno d'acqua e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius. Scongelare rapidamente le fiale di cellule congelate a bagnomaria, temperate a 37 gradi Celsius.Dopo lo scongelamento, pipettare rapidamente le cellule in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri e aggiungere due millilitri del mezzo di crescita completo. Centrifugare il tubo a 129 G per cinque minuti. Rimuovere il supinatante e risospendere le cellule in due millilitri del mezzo di crescita completo.Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, rimuovere il supinatante e aggiungere sei millilitri di terreno di crescita completo per risospendere le cellule. Quindi trasferire le cellule in un pallone di coltura T25 e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Una volta che la densità cellulare raggiunge l'80% al 90% scartare il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS.Aggiungere un millilitro di 0,25% tripsin per digerire le cellule per uno o due minuti. Quando si osserva l'arrotondamento delle cellule, aggiungere immediatamente quattro millilitri del mezzo di crescita completo per neutralizzare la tripsina. Mescolare e aspirare i campioni in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri.Centrifugare i campioni a 129 G per cinque minuti. Rimuovere il supinante e risospendere le celle in un millilitro di mezzo completo RPMI 1640. Utilizzare 20 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule e diluire le cellule a una volta 10 alla quinta cella per millilitro.Quindi placcare le celle BEAS2B ad una densità di una volta 10 alla quarta cella per pozzetto in 96 piastre di pozzetto in 100 microlitri di mezzo completo RPMI 1640 e pre-incubare le piastre per 24 ore come dimostrato in precedenza. Alla fine dell'incubazione, scartare il supinatante e aggiungere 100 microlitri di RPMI 1640 a ciascun pozzetto della piastra del pozzetto 96. Aggiungere 100 microlitri ciascuno di nano emulsione I-OVA, I-OVA miscelato con BNE e I-OVA pre-diluito con un mezzo di crescita completo a varie concentrazioni finali con BNE come controllo e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius.Una volta completata l'incubazione, rimuovere il mezzo e trasferire la piastra in un luogo buio. Aggiungere 90 microlitri di terreno di coltura completo e 10 microlitri di soluzione CCK8 a ciascun pozzetto della piastra. Incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nanometri utilizzando un lettore di piastre marcato con enzimi. Utilizzare punte per pipette da 10 microlitri per eseguire l'immunizzazione nasale dei topi con I-OVA, I-OVA plus BNE e I-OVA NE per tre giorni. Utilizzare BNE e PBA come controllo sperimentale.Successivamente, tagliare campioni spessi circa tre millimetri di tessuti nasali con le forbici e metterli in paraformaldeide al 4%. Rimuovere i tessuti polmonari e fissare i tessuti nasali e polmonari interi in paraformaldeide al 4% per 24 ore. TEM e AFM sono utilizzati per la valutazione delle caratteristiche di base del potenziale zeta superficiale e della dimensione delle particelle del nano vaccino.Vengono mostrate le dimensioni delle particelle, gli indici di polidispersità, i potenziali zeta e la mobilità elettroforistica di I-OVA NE nelle analisi di stabilità dei musin. La vitalità relativa delle cellule BEAS2B è superiore all'80% nelle colture esposte a diverse concentrazioni peptidiche di I-OVA, BNE + I-OVA e I-OVA NE per 24 ore. Il gruppo I-OVA EN non ha avuto alcuna evidente tossicità mucosale, danno tissutale, sanguinamento o infiltrazione di cellule infiammatorie.Le cellule epiteliali BEAS2B hanno catturato più FITC marcato I-OVA NE rispetto a quello della sua soluzione acquosa. L'effetto a rilascio prolungato di I-OVA NE in vitro è stato analizzato utilizzando il sistema IV-IS. Il vaccino I-OVA NE ha avuto un effetto a rilascio prolungato rispetto alla soluzione acquosa di I-OVA.Nel gruppo I-OVA NE, il tempo percentuale di sopravvivenza è più alto rispetto ad altri gruppi e il volume del tumore era significativamente più piccolo, suggerendo che ha un migliore effetto di protezione preventiva rispetto agli altri gruppi. Nel modello terapeutico, il tempo mediano di sopravvivenza era significativamente diverso tra i diversi gruppi. Il volume tumorale del gruppo I-OVA NE era significativamente inferiore a quello del gruppo I-OVA.Mescolare la miscela in modo uniforme è importante in questa procedura. Altrimenti ridurrà l'efficienza dei nanovaccini.

preparation-characteristics-toxicity-efficacy-evaluation-nasal-self

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra la produzione di vaccini tumorali in nanoemulsione. I depositi stabili del serbatoio dell'olio che trasportano peptidi sintetici e adiuvanti sono prodotti mediante nanoemulsione a bassa energia, offrendo una promessa significativa per l'immunoterapia tumorale.

Preparazione di un vaccino adiuvante a nanoemulsione

Descriviamo tecniche basate sull'imaging di animali interi e citometria a flusso per monitorare l'espansione delle cellule T CD8+ antigene-specifiche in risposta all'immunizzazione con nanoparticelle in un modello murino di vaccinazione.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

La scarsa comprensione delle prestazioni in vivo delle nanomedicine ostacola la loro traduzione clinica. Qui sono descritte le procedure per valutare il comportamento in vivo dei nanofarmaci antitumorali a livello sistemico, tissutale, di singola cellula e subcellulare in topi immunocompetenti portatori di tumore. Questo approccio può aiutare i ricercatori a identificare promettenti nanofarmaci antitumorali per la traduzione clinica.

Una procedura completa per valutare il<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestazioni del Cancro nanomedicina

Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Viene descritto un protocollo standard per studiare l'attività antitumorale e la tossicità associata di IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC.

Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α

Questo manoscritto descrive come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dalle cellule tumorali (EV) utilizzando la citometria a flusso. Gli EV derivati da tumori sottoposti a morte cellulare immunogenica indotta dal trattamento sembrano particolarmente rilevanti nell'immunosorveglianza tumorale. Questo protocollo esemplifica la valutazione dei veicoli elettrici immunostimolatori del tumore indotti da oxaliplatino, ma può essere adattato a varie impostazioni.

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Qui viene presentato un semplice protocollo per la produzione di nanoparticelle di mRNA basate su polimeri poli(beta aminoestere), facili da personalizzare cambiando l'mRNA incapsulato. Viene inoltre descritto il flusso di lavoro per la sintesi dei polimeri, le nanoparticelle e la loro caratterizzazione essenziale in vitro. Viene aggiunta anche una prova di concetto per quanto riguarda l'immunizzazione.

Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle poli(beta aminoesters) caricate con mRNA a fini vaccinali

Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l'adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.

In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

Il presente protocollo prepara e valuta le proprietà fisiche, la risposta immunitaria e l'effetto protettivo in vivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione.

Valutazione della risposta immunitaria di un vaccino adiuvante nanoemulsione contro l'infezione da Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA)

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l'artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell'intestino tenue dopo l'iniezione intramuscolare della nanoemulsione.

Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA

Scopri la preparazione e la valutazione di un vaccino tumorale nanoemulsione nasale autoassemblato in vitro e in vivo. Questo metodo offre basse tossicità sistemiche e promettenti effetti terapeutici per lo sviluppo futuro di vaccini mucosi.

Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dellefficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo (Video) | JoVE Journal

Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dell'efficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo

Esplora altri video