Name: Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Scopri la tecnica CRISPR-EZ per modificare geneticamente i topi mediante elettroporazione degli zigoti. Questo metodo efficiente e accessibile facilita la creazione di modelli murini per studiare lo sviluppo embrionale.

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A.J.M. ha creato il concetto originale che ha portato allo sviluppo di CRISPR-EZ e ha prodotto le figure. C.K.D. ha compilato e adattato i protocolli interni e pubblicati per questo manoscritto corrente. A.J.M. è supportato da NIH (R00HD096108).

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<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li>
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<li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li>
<li>Tröder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891(2018).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR%2FCas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554(2017).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR%2FCas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li>
<li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li>
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<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).</li>
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<li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+generating+a+mouse+model%3A+frequently+asked+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li>
<li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR%2F+Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703(2016).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
</ol>

Non ci sono dichiarazioni finanziarie rilevanti da parte degli autori.

Qui viene presentata una tecnologia di editing del genoma del topo semplice e altamente efficiente. L'elettroporazione può essere utilizzata per generare embrioni modificati in 1-2 settimane (Figura 1) e può produrre topi modificati entro 6 settimane9. Rispetto ai protocolli basati sull'elettroporazione sviluppati contemporaneamente che forniscono RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, il metodo qui descritto è concettualmente simile e offre efficienze nello stesso <sup class...

L'editing del genoma nei topi vivi è stato notevolmente semplificato ed è diventato accessibile e più conveniente dall'emergere dell'editing CRISPR 1,2,3. I primi tentativi di modifica animale hanno utilizzato la microiniezione per fornire mRNA / sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare 4,5,6. Mentre la microiniezione è abbastanza efficace, la quantità di pratica richiesta per padroneggiarla completamente potrebbe non essere appropriata per tirocinanti e studenti e richiede anche attrezzature costose che un laboratorio finanziato modestamente non è in grado di permettersi. La microiniezione viene normalmente eseguita da tecnici esperti in strutture transgeniche con orari e prezzi di servizio che sono limitanti per molti ricercatori. Un approccio più accessibile è quello dell'elettroporazione, che si è dimostrata abbastanza efficace per la consegna di mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare7. Ulteriori miglioramenti nelle strategie di editing e consegna del genoma CRISPR hanno suggerito che gli RNP pre-assemblati già impegnati con sgRNA possono essere un mezzo efficace per ridurre il mosaicismo8.
La logica alla base dello sviluppo e dell'uso di questo protocollo era quella di aggirare molte delle limitazioni e degli ostacoli associati alla microiniezione. Come suggerisce il nome, un metodo semplice, interno ed economico che potrebbe determinare rapidamente se vale la pena utilizzare progetti di sgRNA non testati durante un esperimento di microiniezione sarebbe una fase di controllo della qualità di primo passaggio molto conveniente (Figura 1). Mentre questo metodo non può sostituire la microiniezione per strategie più complesse, come l'introduzione di lunghe sequenze di DNA del donatore per risultati basati sulla ricombinazione, è ideale per strategie meno complesse come piccole delezioni o inserzioni e geni di marcatura. Questo metodo è appropriato per i ricercatori con competenze di base di manipolazione embrionale che hanno semplici esigenze di editing, vorrebbero testare la loro ipotesi entro il periodo di tempo dello sviluppo preimpianto o preferiscono testare gli sgRNA negli embrioni prima di fissare un appuntamento con uno specialista di microiniezione. Qui, i reagenti di editing vengono consegnati transitoriamente in embrioni in stadio pronucleare come RNP Cas9 / sgRNA tramite elettroporazione (una serie di impulsi elettrici) per massimizzare l'efficienza diminuendo il mosaicismo8. Utilizzando un metodo di genotipizzazione embrionale, i risultati di editing sono disponibili in circa 1 settimana9, riducendo così la necessità di varie applicazioni di microiniezione a un costo significativamente ridotto.
L'efficacia di questo metodo raggiunge il picco allo stadio embrionale pronucleare, quando l'embrione non ha ancora fuso i pronuclei materno e paterno o è entrato nella fase S (Figura 2). La superovulazione viene utilizzata per massimizzare il numero di zigoti, ma produce sia zigoti pronucleari che uova non fecondate. Gli zigoti sani possono anche essere preselezionati prima dell'elettroporazione per aumentare l'efficienza complessiva. Poiché altri protocolli di elettroporazione hanno modificato in modo efficiente gli zigoti senza la necessità di includere un passo simile 7,10,11,12,13,14,15, un passo opzionale di questo protocollo è la leggera erosione della zona pellucida (ZP). La ZP è uno strato glicoproteico che aiuta il legame degli spermatozoi, la risposta degli acrosomiali e la fecondazione che circondano gli embrioni in stadio pronucleare. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che una delicata erosione a base acida della ZP fornisce una consegna affidabile dell'elettroporazione Cas9 RNP con un impatto solo marginale sulla vitalità.
Abbiamo osservato tassi di rilascio di RNP fino al 100% di efficienza tramite elettroporazione in ceppi di topo che sono comunemente usati nella ricerca come C57BL / 6J e C57BL / 6N 9,16. Gruppi indipendenti hanno anche sviluppato procedure basate sull'elettroporazione con efficienze superiori o corrispondenti alla microiniezione 11,12,13,14,15,17, con protocolli di elettroporazione che funzionano bene nel ratto18,19, nel maiale 20,21,22 e nella mucca 23 , quindi suggeriamo ai lettori di confrontare i protocolli per trovare le condizioni che meglio si adattano alle loro esigenze sperimentali e di attrezzature. Il sistema qui descritto utilizza materiali e attrezzature comuni, che richiedono solo abilità di manipolazione embrionale di base. Questa tecnica è efficace per una serie di strategie di editing, rendendo questo metodo ampiamente accessibile alla comunità di ricerca.
La progettazione di piccoli RNA guida ideali (sgRNA) è essenziale per un editing efficiente. Raccomandiamo lo screening di due o tre strategie di sgRNA per sito bersaglio direttamente negli embrioni di topo, specialmente se si desidera generare linee di topo. Una volta progettati, si raccomandano metodi privi di clonazione come la trascrizione in vitro (IVT) per produrre sgRNA di alta qualità3. Gli RNP e gli sgRNA sono mescolati con 30-50 embrioni in stadio pronucleare processati ed esposti a una serie di impulsi elettrici per prima permeabilizzare temporaneamente la ZP e la membrana cellulare, con impulsi successivi per mantenere i pori aperti ed elettroforese gli RNP attraverso lo zigote24. Dopo l'ottimizzazione, abbiamo scoperto che sei impulsi da 3 ms a 30 V per embrioni di massa (~ 50) erano ottimali per l'efficacia e la vitalità dell'editing, fornendo una consegna altamente efficiente di Cas9 / sgRNA RNP 9,16,25. Gli eventi di editing nella morula di topo possono essere confermati utilizzando una varietà di strategie di convalida comuni per l'editing CRISPR, come il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP), la digestione dell'endonucleasi T7 e il sequenziamento Sanger della regione di interesse26.
Il metodo attuale è più appropriato per semplici schemi di editing (Figura 3), come inserimento/delezioni (indel), delezioni di dimensioni esone dell'ordine di 500-2000 bp e la consegna di mutazioni puntiformi e piccole inserzioni come tag C- o N-terminali (ad esempio, FLAG, HA o V5)9,16,27. Il potenziale per l'editing del genoma complesso, come grandi inserzioni di tag fluorescenti o alleli condizionali, rimane incerto ed è attualmente al centro dei prossimi miglioramenti.
Questo metodo è facilmente padroneggiabile e può essere utilizzato per testare rapidamente gli sgRNA in embrioni di topo in coltura in 1 settimana9 (Figura 1). Presentato in questo lavoro è un protocollo in sei fasi, che include 1) progettazione di sgRNA; 2) sintesi di sgRNA; 3) superovulazione e accoppiamento; 4) coltura, raccolta e trattamento di embrioni; 5) assemblaggio RNP ed elettroporazione; 6) coltura embrionale e genotipizzazione. Vengono fornite informazioni su tutti i materiali utilizzati (Tabella dei materiali). Come controllo positivo, i reagenti per modificare il locus della tirosinasi (Tyr) 9,16 sono stati inclusi nella tabella supplementare 1.

<table><tbody><tr><td>Cuvetta per elettroporazione con distanza di 0,1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>n. di cat. 1652089</td><td>Elettroporazione</td></tr><tr><td>26-G, ago da 1/2 pollice</td><td>BD</td><td>n. di cat. 305111</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>3... Topi maschi di 8 mesi e topi femmina di 3-5 settimane</td><td>JAX</td><td>cat. n. 000664</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>35 mm Piastra di coltura tissutale</td><td>Greiner Bio-One,</td> <td>n. cat. 627-160</td><td>Coltura embrionale</td></tr><tr><td>60 mm Piastra di coltura tissutale</td><td>Greiner Bio-One,</td> <td>n. cat. 628-160</td><td>Elaborazione embrionale</td></tr><tr><td>Colorante di caricamento 6x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n. cat. R0611</td><td>sgRNA Sintesi e genotipizzazione</td></tr><tr><td>Soluzione acida di Tyrode (AT), grado di coltura embrionale</td><td>Sigma-Aldrich,</td> <td>n. di cat. T1788</td><td>Elaborazione di embrioni</td></tr><tr><td>BSA, grado di coltura embrionale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n. di cat. A3311</td><td>Processazione e coltura di embrioni</td></tr><tr><td>Proteina Cas9</td><td>Alt-R S.p. nucleasi Cas9 3NLS</td><td>n. di cat. 1074181</td><td>Elettroporazione</td></tr><tr><td>DNasi I, senza RNasi</td><td>New England BioLabs,</td> <td>n. di cat. M0303</td><td>Sintesi di sgRNA</td></tr><tr><td>DPBS (senza calcio e magnesio)</td><td>Gibco</td><td>n. cat. 14190-144</td><td>Elaborazione embrionale</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>n. cat. R3101S</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>EDTA, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n. cat. EDS-100G</td><td>RNP</td></tr><tr><td>Tampone Etanolo</td><td>Koptec</td><td>cat. n. V1016</td><td>sgRNA Sintesi</td></tr><tr><td>Gelatina (polvere) tipo B, grado di laboratorio</td><td>Fisher,</td> <td>cat. n. G7-500</td><td>Lisi Tampone</td></tr><tr><td>glicerolo,&nbsp; grado di biologia molecolare</td><td>Fisher</td><td>cat. n. BP229</td><td>RNP Tampone</td></tr><tr><td>Taq Polimerasi</td><td>Promega</td><td>cat. n. M712</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>HEPES, grado di coltura cellulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. n. H4034</td><td>RNP Buffer</td></tr><tr><td>HinfI (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>n. cat. R0155S</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit di sintesi di RNA ad alto rendimento</td><td>New England BioLabs,</td> <td>cat. n. E2040</td><td>Sintesi</td></tr> <tr><td>di sgRNAGonadotropina corion umana, liofilizzata (hCG)</td><td>Millipore</td><td>n. 230734</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>Ialuronidasi/M2</td><td>Millipore</td><td>n. MR-051-F</td><td>Embryo Processing</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve medium (terreno simplex ottimizzato con integratore di potassio più aminoacidi)</td><td>Zenith Biotech</td><td>cat. ZEKS-050</td><td>Coltura embrionale</td></tr><tr><td>LE agarosio, grado analitico</td><td>BioExpress</td><td>cat. n. E-3120-500</td><td>sgRNA Sintesi e genotipizzazione</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Zenith Biotech</td><td>cat. n. ZFM2-050</td><td>Elaborazione degli embrioni</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio, anidro (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. n. M8266</td><td>RNP e tampone di lisi</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Millipore</td><td>cat. ES-005C</td><td>Coltura embrionale</td></tr><tr><td>Nonidet P-40, sostituto (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. n. 74385</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi, grado di biologia molecolare</td><td>Ambion</td><td>cat. AM9937</td><td>sgRNA Sintesi e genotipizzazione</td></tr><tr><td>Oligo per la sintesi di sgRNA, oligo donatore e primer PCR per la genotipizzazione</td><td>Tecnologie del DNA integrate Ordini</td><td>personalizzati</td><td>sgRNA Design</td></tr><tr><td>Siero ridotto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>cat. n. 31985062</td><td>Coltura embrionale</td></tr> DNA <tr><td>polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England BioLabs,</td> <td>cat. n. M0530</td><td>sgRNA Sintesi</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio grado di biologia molecolare (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. n. P9333</td><td>RNP e tampone di lisi</td></tr><tr><td>Gonadotropina sierica cavalla gravida liofilizzata ((PMSG)</td><td>ProspecBio</td><td>cat. n. HOR-272</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>Proteinasi K, grado di biologia molecolare</td><td>Fisher</td><td>cat. BP1700-100</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL senza RNasi</td><td>VWR</td><td>n. cat. 20170-333</td><td>Sintesi e genotipizzazione di sgRNA</td></tr><tr><td>Provette per strisce PCR a otto pozzetti prive di RNasi</td><td>VWR</td><td>n. cat. 82006-606</td><td>Sintesi e genotipizzazione di sgRNA</td></tr><tr><td>Perle di purificazione magnetiche</td><td>GE Healthcare</td><td>n. cat. 65152105050250</td><td>Sintesi di sgRNA Tris</td></tr><tr><td>(2-carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n. cat. C4706</td><td>RNP Tampone</td></tr><tr><td>Soluzione Tris-HCl, pH 8,5 grado di biologia molecolare</td><td>Teknova</td><td>n. di cat. T1085</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Tween 20 grado di biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n. di cat. P7949-500</td><td>Tampone di lisi</td></tr></tbody></table>

editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione crispr degli zigoti

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Con efficienza, precisione e facilità eccezionali, il sistema CRISPR / Cas9 ha migliorato significativamente l'editing del genoma in colture cellulari e esperimenti su animali da laboratorio. Quando si generano modelli animali, l'elettroporazione degli zigoti offre maggiore efficienza, semplicità, costo e produttività come alternativa al metodo gold standard di microiniezione. L'elettroporazione è anche più delicata, con una maggiore vitalità, e fornisce in modo affidabile Cas9 / RNA a guida singola (sgRNA) ribonucleoproteine (RNP) negli zigoti dei comuni ceppi di topo da laboratorio (ad esempio, C57BL / 6J e C57BL / 6N) che si avvicina al 100% dell'efficienza di consegna. Questa tecnica consente mutazioni di inserzione/delezione (indels), mutazioni puntiformi, la delezione di interi geni o esoni e piccole inserzioni nell'intervallo 100-200 bp per inserire LoxP o tag brevi come FLAG, HA o V5. Pur essendo costantemente migliorato, qui presentiamo lo stato attuale di CRISPR-EZ in un protocollo che include la produzione di sgRNA attraverso la trascrizione in vitro , l'elaborazione degli embrioni, l'assemblaggio di RNP, l'elettroporazione e la genotipizzazione degli embrioni preimpianto. Un ricercatore di livello universitario con esperienza minima nella manipolazione degli embrioni può ottenere embrioni geneticamente modificati in meno di 1 settimana utilizzando questo protocollo. Qui offriamo un metodo semplice, a basso costo, efficiente e ad alta capacità che potrebbe essere utilizzato con embrioni di topo.

Questo metodo genera più di 100 μg di sgRNA (20 μL a concentrazione di &gt;6.000 ng/L) per un efficiente assemblaggio di RNP Cas9/sgRNA. Il metodo di superovulazione di routine qui descritto produce tipicamente 10-20 embrioni vitali per femmina collegata. A causa degli errori di manipolazione e delle perdite tipiche associate alla manipolazione degli embrioni, si prevede che l'80% degli embrioni sia fecondato, vitale e in condizioni eccellenti dopo l'elettroporazione. Per aiutare i ricercatori a eseguire un esperimento d...

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Questo metodo potrebbe controllare gli RNA guida negli embrioni, testare le prime domande sullo sviluppo o creare topi modificati. Qualsiasi progresso in CRISPR Cas9 potrebbe essere utilizzato con questo metodo. Il vantaggio principale di questo metodo è che è facile da imparare e utilizza reagenti disponibili per i laboratori che hanno accesso ai topi.In futuro, questa tecnica sarebbe utile per correggere una malattia o una mutazione nella prole di un animale da compagnia o di un animale importante per l'agricoltura. Questo metodo è più adatto per generare modelli di mouse. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato varianti di questo metodo per studiare gli eventi che circondano la fecondazione e lo sviluppo precoce del preimpianto, in particolare, la regolazione genica nella potenza dell'embrione.La parte più impegnativa è usare l'ago di vetro per spostare gli embrioni da una piastra all'altra. A dimostrare questa procedura sarà Chantal Diallo, specialista di ricerca nel mio laboratorio. Per iniziare la raccolta e l'elaborazione degli embrioni, posizionare il topo femmina eutanasia sulla schiena e spruzzare il 70% di etanolo sull'addome da aprire chirurgicamente.Per aprire la ca

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l'ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Il presente protocollo descrive la microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 e DNA del donatore per produrre in modo efficiente topi knock-in e floxed con cassette geniche.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di modelli murini geneticamente modificati utilizzando cellule staminali embrionali, in particolare per il knock-in del DNA di grandi dimensioni (KI). Questo protocollo è ottimizzato utilizzando l'editing del genoma CRISPR / Cas9, con conseguente miglioramento significativo dell'efficienza KI rispetto al tradizionale metodo di targeting linearizzato del DNA mediato dalla ricombinazione omologa.

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Questo protocollo descrive la microiniezione e l'elettroporazione in vivo per l'editing del genoma mediato da CRISPR limitato a livello regionale nell'ovidotto del topo.

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l'elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell'embrione a 2 cellule.

Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Scopri la tecnica CRISPR-EZ per modificare geneticamente i topi mediante elettroporazione degli zigoti. Questo metodo efficiente e accessibile facilita la creazione di modelli murini per studiare lo sviluppo embrionale.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

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