Isolamento fecale murino e trapianto di microbiota

Qui abbiamo descritto un protocollo per guidare gli altri nello studio dei meccanismi della disbiosi nella malattia, dalla raccolta di campioni fecali all'utilizzo del metodo Swiss roll per studiare i cambiamenti nell'intestino. Per iniziare, spruzzare il torace e i lati del topo eutanasia con etanolo al 70% e aprire con attenzione la pelle e la cavità peritoneale per esporre il tratto gastrointestinale. Isolare il cieco e utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliarlo a metà.

Esporre brevemente il cieco e tagliare 0,5 centimetri prossimalmente dall'ileo e 0,5 centimetri distalmente alla sua giunzione con il colon. Trasferire il cieco isolato su una capsula di Petri sterile. Utilizzare una spatola sterile per trasferire il contenuto cecale in tubi sterili e conservare le aliquote in un congelatore a 80 gradi Celsius.

Risospendere i pellet fecali freschi o precedentemente congelati in soluzione salina sterile in proporzione da 1 a 20 e vortice fino a omogeneizzazione. Far passare l'omogenato attraverso un filtro in nylon a 30 micrometri per rimuovere il particolato di grandi dimensioni. Centrifugare a 79G per cinque minuti e raccogliere il surnatante da utilizzare per il trapianto.

Rapina orale 100 microlitri di liquame per topo ricevente privo di germi per tre giorni consecutivi, seguito da sonda gastrica ogni tre giorni per due settimane. Posizionare delicatamente il mouse in un sistema di ritenuta sul supporto del mouse preriscaldato e lasciare la coda all'esterno. Fissare con attenzione la parte superiore senza pizzicarla in modo da non stressare il mouse.

Lasciare riposare il mouse nel supporto e posizionarlo sulla piattaforma della macchina del bracciale di coda per tre o cinque minuti, coperto da un foglio per acclimatarsi. Raccogliere almeno tre cicli di misurazioni della pressione sistolica utilizzando la pletismografia della cuffia della coda e calcolare la media delle misurazioni di tutti i round per una pressione sistolica media per ciascun animale. Raccogliere asetticamente il contenuto cecale dal topo eutanasia.

Per raccogliere l'intestino e altri tessuti, individuare il tessuto nel topo e asportarli con le forbici per esaminare il ruolo del microbiota intestinale nella salute cardiometabolica. Il primo giorno, sezionare l'intestino del topo dal lato anale al lato dello stomaco. E posizionare l'intero tratto gastrointestinale isolato in una capsula di Petri contenente PBS.

Tirare delicatamente l'estremità prossimale dall'estremità dello stomaco e rimuovere manualmente il grasso circostante e il tessuto connettivo. Isolare l'intestino tenue e fare uno zigzag di tipo Z con ogni lunghezza. Quindi, tagliare per ottenere il duodeno, il digiuno e l'ileo.

Isolare il colon tagliando la sezione dell'intestino sotto il cieco. Tagliare il duodeno, il digiuno, l'ileo e il colon. Utilizzare una siringa e un ago con una punta a sfera per lavare accuratamente e lavare l'intestino all'interno con PBS senza strappare l'intestino.

Posizionare il budello su carta da filtro ed etichettare la carta con il nome della sezione e poi P nell'angolo in alto a sinistra per prossimale o D per distale nell'angolo in basso a sinistra. Tagliare l'intestino longitudinalmente con le forbici a sfera. Aprire l'intestino sulla carta da filtro e lavare con più PBS se necessario.

Inserire l'intestino tra due carte da filtro e graffettare le carte da filtro in quattro punti o angoli vicino all'intestino. Immergere in una soluzione tampone neutra al 10% di formalina e agitare utilizzando un bilanciere a piattaforma a cinque giri / min durante la notte a temperatura ambiente. Il secondo giorno, scaldare il 2% di agarosio preparato in acqua distillata con un mescolatore in un becher coperto con un foglio di alluminio.

Per recuperare i tessuti, rimuovere la carta da filtro superiore e arrotolare l'intestino dal lato prossimale in modo che il lato prossimale entri prima e rotolare verso l'interno in modo che il lume sia anche all'interno del vetrino. Perno con un ago calibro 30 o due secondo necessità. Aspirare un millilitro di agarosio utilizzando pipette di trasferimento graduate monouso e versare l'agarosio su una sezione di budello arrotolata su una superficie piana evitando bolle d'aria nei tessuti.

Dopo che l'agarosio si raffredda e si solidifica, usa una lama di rasoio per tagliare l'agarosio extra intorno alla sezione del tessuto. Infine, posizionare le sezioni intestinali nella lavorazione dei tessuti o nell'incorporazione di cassette e immergerle in etanolo al 70% a quattro gradi Celsius. La stima della biodiversità delle specie nel contenuto cecale ottenuto da topi con diete normali a base di sale e diete ad alto contenuto di sale è mostrata qui.

I cambiamenti nel microbiota intestinale in risposta all'alto contenuto di sale includevano una diminuzione della biodiversità batterica. Il ridimensionamento multidimensionale non metrico mostra che i batteri dei topi con sale normale e dieta ad alto contenuto di sale formano gruppi separati. L'alto contenuto di sale è associato ad un aumento del rapporto tra Firmicutes e Bacteroidetes.

Il trapianto di microbiota fecale da topi ad alto contenuto di sale predispone topi privi di germi all'ipertensione indotta da angiotensina II. Il trasferimento di microbiota intestinale disbiotico ad alto contenuto di sale è stato associato a un aumento significativo della pressione sistolica nei topi privi di germi rispetto ai topi che hanno ricevuto un normale microbiota intestinale salino. Le immagini rappresentative mostrano la colorazione apolipoproteina A-I nell'ilia ottenuta da topi che avevano iperlipidemia senza o con proteinuria.

Questo protocollo allinea i passaggi per ottenere un FMT di successo in considerazioni sperimentali chiave sia per i donatori umani che per i roditori.