Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

La neuroinfiammazione è un attore chiave in vari disturbi neurologici. Quindi, è di grande interesse ricercare e sviluppare modelli alternativi di neuroinfiammazione in vivo per facilitare gli studi sullo sviluppo patologico. La tecnica qui descritta è uno strumento eccellente per comprendere meglio i cambiamenti patologici nel cervello attraverso l'imaging in vivo e per valutare in modo rapido ed efficiente possibili farmaci anti-neuroinfiammatori.

Prepararsi per l'iniezione tirando i capillari di vetro utilizzando un estrattore di micropipette seguendo il protocollo in cinque fasi per la trazione del tubo capillare di vetro. Aprire la punta dell'ago alla dimensione appropriata ad angolo usando una pinza. Riempire l'ago con 0,1 millilitri di olio minerale per assicurarsi che non ci siano bolle.

Rimuovere il tappo a vite dell'ago in acciaio dell'apparecchio di microiniezione. Allineare il foro dell'ago di vetro con l'ago in acciaio, quindi stringere il tappo a vite. Montare l'apparecchio di microiniezione con ago caricato in un micromanipolatore.

Regolare la posizione dell'apparecchio di microiniezione in modo che il micromanipolatore possa spostare in modo flessibile l'apparecchio al microscopio. Scaricare un volume appropriato di olio di paraffina necessario per far entrare l'ago in acciaio nel tubo di vetro capillare. Rilasciare la soluzione di iniezione costituita da PBS o lipopolisaccaride su un vetrino sterilizzato con etanolo al 70% e regolare l'apparecchio di microiniezione in modo che la punta venga inserita nella goccia liquida.

Caricare circa due microlitri di soluzione iniettabile nell'ago. Impostare il micromanipolatore in modo che la punta dell'ago dell'apparato di microiniezione si trovi nello stesso campo visivo delle larve ad alto ingrandimento. Sciogliere una soluzione di agarosio al 2% in acqua bidistillata usando un forno a microonde.

Versare l'agarosio fuso in un piatto di plastica. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per trasportare le larve anestetizzate al centro di un piatto di plastica rivestito di agarosio al 2%. Orientare le larve montate con il cervello rivolto verso l'alto per l'accesso all'ago.

Regolare l'ingrandimento del microscopio in modo che la struttura ventricolare cerebrale del pesce zebra sia chiaramente visualizzata nel campo visivo. Posizionare l'ago con attenzione sopra il tectum cerebrale. Pulire l'area del cervello con etanolo al 70% e perforare lentamente la pelle del cervello del pesce zebra con la punta dell'ago usando il micromanipolatore.

Premere il pedale per espellere un nanolitro di 1X PBS o diverse concentrazioni di lipopolisaccaride. Trasferire le larve in un mezzo E3 pulito immediatamente dopo l'iniezione. Dopo 24 ore, raccogliere le larve per l'imaging microscopico, il saggio comportamentale della locomotiva e la determinazione di altri indicatori.

Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% in mezzo E3 e riscaldarla in un forno a microonde per formare un liquido trasparente. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica pulita per trasportare le larve su un vetrino e rimuovere quanta più acqua possibile. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per aggiungere una goccia di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% alle larve.

Utilizzare un ago da siringa da un millilitro per orientare le larve. Attendere che l'agarosio si raffreddi e si solidifichi prima di iniziare l'imaging. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale lipopolisaccaridica, procedere con la determinazione dei marcatori di espressione genica.

Utilizzare due siringhe da un millilitro per separare le parti della testa delle larve senza le regioni dell'occhio e del sacco vitellino. Omogeneizzare la porzione di testa con 200 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA utilizzando una smerigliatrice tissutale a 11.000 rotazioni al minuto per cinque secondi, quindi eseguire l'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo dell'isopropanolo cloroformio. Asciugare all'aria il pellet di RNA per cinque a 10 minuti, quindi aggiungere 30 microlitri di acqua priva di RNAsi per sciogliere il pellet di RNA.

Sintetizzare il cDNA usando la trascrittasi inversa con primer casuali come descritto nel manoscritto testuale. Successivamente, eseguire la PCR in tempo reale su un sistema qPCR utilizzando un kit RT-qPCR disponibile in commercio per determinare l'espressione dei geni bersaglio. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale di lipopolisaccaride, trasferire individualmente le larve di zebrafish ai pozzetti di una micropiastra quadrata a 96 pozzetti.

Aggiungere 300 microlitri di terreno E3 a ciascun pozzetto e quindi incubare le larve per quattro ore per acclimatarsi alla piastra di prova. Trasferire la micropiastra caricata con larve nella scatola di tracciamento del pesce zebra. Accendere la sorgente luminosa e incubare le larve nella scatola di prova per 30 minuti per acclimatarsi all'ambiente.

Monitora e registra il comportamento del pesce zebra utilizzando un sistema di tracciamento video automatizzato. Registrare 12 sessioni di cinque minuti ciascuna per le singole larve di zebrafish e definire la distanza totale come descritto nel manoscritto testuale. Dopo il trattamento per 24 ore, da uno a cinque milligrammi per millilitro di iniezione cerebrale ventricolare lipopolisaccaridica ha indotto una significativa perdita di neuroni RA nel cervello del pesce zebra larvale TgEtvmat2: GFP rispetto ai gruppi di controllo e sham.

La linea transgenica elavl3:mCherry zebrafish ha dimostrato cambiamenti significativi nella densità integrata di fluorescenza dei neuroni cerebrali larvali quando iniettato con 2,5-cinque milligrammi per millilitro di lipopolisaccaride, mentre l'iniezione di lipopolisaccaride da un milligrammo per millilitro non ha mostrato alcun effetto. Inoltre, cinque milligrammi per millilitro di lipopolisaccaride hanno indotto una carenza di locomozione e diminuito la distanza totale del movimento del pesce zebra in un periodo di monitoraggio di 60 minuti. La produzione di protossido di azoto e l'espressione di mRNA di citochine pro-infiammatorie nella testa delle larve di zebrafish sono aumentate con un trattamento lipopolisaccaridico da 2,5 a cinque milligrammi per millilitro rispetto all'espressione nei gruppi di controllo e sham.

L'iniezione da uno a cinque milligrammi per millilitro di lipopolisaccaride ha dimostrato il reclutamento di neutrofili nel cervello larvale del pesce zebra, con conseguente aumento significativo del numero di neutrofili nella regione cerebrale del pesce zebra Tgmpo: eGFP. La dimensione di apertura degli aghi e la quantità di forza di iniezione per la microiniezione insieme alla separazione della testa dagli occhi e dal corpo del pesce zebra sono cruciali per questa procedura.