Name: Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Impara a valutare la salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari 3D. Questo metodo permette di studiare l'attivazione dei CAF e le loro interazioni con il microambiente tumorale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal SERB-Women Excellence Award Project, India (SB/WEA-02/2017) e dal SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR/2017/000892) a DP. Gli autori, LA e SR riconoscono IIT Ropar e MHRD per le loro borse di ricerca. MK riconosce l'ICMR per la sua borsa di ricerca.

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il presente studio introduce lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari comprendenti cellule tumorali, popolazione di cellule stromali (cioè fibroblasti) e popolazione di cellule immunitarie (cioè monociti) utilizzando un metodo di goccia sospesa modificata. I fibroblasti e i monociti/macrofagi sono tra le popolazioni più significative che costituiscono il microambiente tumorale (TME) e la loro presenza è spesso correlata a una prognosi infausta16. Quando presenti nella TME, i fibroblasti si ...

I tumori solidi sono composti da popolazioni cellulari eterogenee che sono guidate dal microambiente tumorale (TME), tuttavia, l'origine della maggior parte delle cellule deve ancora essere scoperta. Principalmente le cellule stromali e immunitarie (fibroblasti, cellule endoteliali, monociti, macrofagi, cellule dendritiche, cellule B, cellule T e loro sottogruppi) riflettono l'eterogeneità tumorale nei tumori polmonari, mammari, renali e altri tumori solidi 1,2,3. Comprendere l'origine di ciascun sottotipo e il loro potenziale di trans-differenziazione è della massima necessità per lo sviluppo di terapie avanzate contro questi tumori. L'analisi di questa variegata popolazione cellulare nelle biopsie umane presenta diverse sfide a causa del tipo di tumore, del sito, dello stadio, della limitazione della quantità del campione e delle variabilità specifiche del paziente4. Pertanto, è necessario un modello sperimentale, che non sia solo affidabile, ma possa anche simulare la condizione tumorale in vivo, dimostrandosi ideale per lo studio della diafonia tumore-stroma e il suo coinvolgimento nella fisiopatologia della malattia.
Le colture tridimensionali (3D) di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono un sistema modello in vitro vantaggioso di tumori a causa della loro somiglianza con le controparti naturali. MCTS può replicare meglio gli aspetti dei tumori solidi rispetto ai modelli di coltura cellulare 2D, compresa la loro architettura spaziale, le risposte fisiologiche, il rilascio di mediatori solubili, i modelli di espressione genica e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Inoltre, uno dei principali vantaggi della MCTS è che può essere utilizzato per studiare l'eterogeneità tumorale e il microambiente tumorale (TME). Il metodo hanging-drop è lo strumento più comunemente impiegato per lo sviluppo e l'analisi di MCTS5. In questo metodo, le diverse cellule con i media sono sospese sotto forma di goccioline, il che consente la sua crescita in modo coerente aggregato 3D ed è semplice da accedere per l'esame. La tecnica è semplice; Non richiede molte cellule ed elimina la necessità di un substrato specializzato come l'agarosio per lo sviluppo di sferoidi6. Un ulteriore vantaggio di questo metodo risiede nella riproducibilità della sua tecnica. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato anche per co-coltivare popolazioni cellulari miste, come cellule endoteliali e cellule tumorali, per simulare l'angiogenesi tumorale precoce7.
In questo studio, sferoidi tumorali polmonari 3D multicellulari sono stati preparati con cellule di adenocarcinoma polmonare, fibroblasti e monociti utilizzando il metodo della goccia sospesa che imita il microambiente del tumore polmonare. Quindi la popolazione di fibroblasti associati al cancro (CAF) è stata isolata per studiare la salute mitocondriale. L'idea principale alla base dello sviluppo di questi sferoidi è quella di isolare i CAF poiché la diafonia tra le cellule negli sferoidi potrebbe trasformare i fibroblasti in uno stato CAF attivato simile ai miofibroblasti. In secondo luogo, questo studio può anche descrivere come la produzione aberrante di ROS e la disfunzione mitocondriale spingano i fibroblasti normali verso il fenotipo CAF più aggressivo. È stato scoperto che i fibroblasti assemblati all'interno degli sferoidi tumorali hanno acquisito caratteristiche miofibroblastiche con una maggiore attività ROS e l'induzione dell'espressione genica metabolica. Questo protocollo evidenzia l'importanza del microambiente tumorale nell'attivazione della CAF e potrebbe essere un ottimo modello per la generazione in vitro e lo studio delle caratteristiche fenotipiche della CAF.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC anti-umano &alfa;-SMA</td><td>R& Sistemi D</td><td>Cat# IC1420A</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-fibroblasti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-050-601<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549 cellule di adenocarcinoma polmonare</td><td>NCCS</td> Pune-MRC-5 <td></td><td></td></tr><tr><td>fibroblasti polmonari fetali</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Monociti umani</td><td>NCCS Pune</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Himedia</td><td>Cat# 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dicloroindofenolo (DCPIP)</td><td>SRL</td><td>Cat# 55287</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# C3099</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># D1306</td><td></td></tr><tr><td>DCFDA</td><td>Sigma</td><td>Cat# D6883</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11995073</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco Cat</td><td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo fisher scientifico</td><td>Cat# 17892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SRL</td><td>Cat# 62858</td><td></td></tr><tr><td>EZcoun Kit di analisi cellulare lattato deidrogenasi</td><td>HiMedia</td><td>Cat# CCK036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>Cat# </td><td></td>10082147</tr><tr><td>Halt Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#</td> 15630080 <td></td></tr><tr><td>Cuore di cavallo Citocromo c</td><td>SRL</td><td>Cat# 81551</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT Reagente per ipossia rossa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# H10498</td><td></td></tr><tr><td>JC-1 Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># T3168</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>Cat# P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck</td><td>Cat# M8266</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 69824</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH MB Grade</td><td>SRL</td><td>Cat# 54941</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 85124</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina metosolfato (PMS)</td><td>SRL</td><td>Cat# 55782</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>Cat# P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11875093</td><td></td></tr><tr><td>Kit di lisi a cellula singola</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4458235</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Merck</td><td>Cat# A7631</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro di sodio</td><td>Sigma</td><td>Cat# 205222</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 89904</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3771</td><td></td></tr><tr><td>Succinato di sodio esaidrato</td><td>SRL</td><td>Cat# 36313</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Kit di sintesi cDNA Sigma</td><td>Cat# S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11754-050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>Cat# T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% EDTA</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25200072</td><td></td></tr><tr><td>Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td>Cat# 172-5124<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contatore di celle automatizzato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL sistema di imaging principale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Numero di serie F0518-1727-0191</td><td></td></tr><tr><td>Software LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito fluorescente Leica</td><td>s</td><td>DMi8 automatizzato S/N 424150)</td><td></td></tr><tr><td>Separatore Midi MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-042-302</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3d

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono tra le cellule stromali più abbondanti presenti nel microambiente tumorale, facilitando la crescita e la progressione del tumore. La complessità all'interno del microambiente tumorale, tra cui secretoma tumorale, infiammazione di basso grado, ipossia e squilibrio redox, favorisce l'interazione eterotipica e consente la trasformazione dei fibroblasti residenti inattivi per diventare CAF attivi. I CAF sono metabolicamente distinti dai fibroblasti normali (NF) in quanto sono più glicoliticamente attivi, producono livelli più elevati di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e sovraesprimono l'esportatore di lattato MCT-4, portando all'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (MPTP). Qui è stato descritto un metodo per analizzare la salute mitocondriale di CAF attivati isolati dagli sferoidi tumorali 3D multicellulari comprendenti cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A549), monociti umani (THP-1) e cellule di fibroblasti polmonari umani (MRC5). Gli sferoidi tumorali sono stati disintegrati a diversi intervalli di tempo e attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente, i CAF sono stati isolati. Il potenziale di membrana mitocondriale dei CAF è stato valutato utilizzando il colorante JC-1, la produzione di ROS mediante colorazione con 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFDA) e l'attività enzimatica nei CAF isolati. L'analisi della salute mitocondriale dei CAF isolati fornisce una migliore comprensione dell'effetto Warburg inverso e può anche essere applicata per studiare le conseguenze dei cambiamenti mitocondriali della CAF, come i flussi metabolici e i corrispondenti meccanismi regolatori sull'eterogeneità del cancro del polmone. Pertanto, il presente studio sostiene una comprensione delle interazioni tumore-stroma sulla salute mitocondriale. Fornirebbe una piattaforma per verificare i candidati farmaci mitocondriali specifici per la loro efficacia contro i CAF come potenziali terapie nel microambiente tumorale, prevenendo così il coinvolgimento del CAF nella progressione del cancro del polmone.

La Figura 1 mostra lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari utilizzando tre diverse popolazioni cellulari - A549 (adenocarcinoma polmonare), MRC-5 (fibroblasti) e THP-1 (monociti) - con il metodo della goccia sospesa come osservato il giorno 7 e il giorno 10 al microscopio. Il giorno 7, gli sferoidi erano compatti e rigidi con un diametro di 260 ± 5,3 μm, e il giorno 10, gli sferoidi avevano un diametro di 480 ± 7,5 μm (Figura 1A pannello superiore,<stron...

Gli sferoidi tumorali 3D multicellulari sono stati preparati con cellule di adenocarcinoma polmonare, fibroblasti e monociti, seguiti dall'isolamento dei fibroblasti associati al cancro (CAF) da questi sferoidi. I CAF isolati sono stati confrontati con fibroblasti normali per valutare la salute mitocondriale studiando il potenziale transmembrana mitocondriale, le specie reattive dell'ossigeno e le attività enzimatiche.

Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Questo protocollo evidenzia l'importanza del microambiente tumorale nell'attivazione dei fibroblasti associati al cancro o CAF. Potrebbe essere un ottimo modello in vitro per studiare le caratteristiche fenotipiche. I principali vincoli nella biologia della CAF risiedono nella limitata disponibilità di CAF da campioni primari di biopsia tumorale.Quindi questa tecnica può essere utilizzata per studiare vari aspetti della biologia CAF. Questo studio descrive la produzione crociata aberrante e la disfunzione mitocondriale associata all'attivazione della CAF che porta a una prognosi tumorale sfavorevole. L'applicazione di questo metodo sarebbe utile per valutare le interazioni traumatiche del tumore, in particolare l'attivazione della CAF e la salute mitocondriale.Al fine di esplorare i nuovi bersagli farmacologici. Gli individui devono avere esperienza nella procedura cellulare prima di eseguire questa tecnica. La dimostrazione visiva di questa tecnica permetterà di comprendere i passaggi critici nell'isolamento della popolazione CAF dagli sferoidi tumorali e le applicazioni a valle per studiare la biologia della CAF.La signorina Leena Arora, la signorina Moyna Kalia e la signora Soum

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Questo protocollo descrive la tecnica per eseguire il saggio del flusso extracellulare su sferoidi 3D generati dalla co-coltura di cellule tumorali pancreatiche (Patu8902) e fibroblasti pancreatici attivati (PS1) per misurare le due principali vie di produzione di energia, la glicolisi e la respirazione mitocondriale.

Saggio del flusso extracellulare in sferoidi 3D: un metodo per misurare l'attività metabolica degli sferoidi tumorali del pancreas

Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.

Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l'efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l'immunofluorescenza, la trascrizione l'analisi e l'imaging delle cellule di vita.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Viene stabilito un nuovo modello di sferoide tridimensionale basato sull'interazione eterotipica delle cellule tumorali e dei fibroblasti stromali. Qui, presentiamo la cocoltura di cellule tumorali e fibroblasti stromali, imaging time-lapse, e microscopia confocale per visualizzare la formazione di sferoidi. Questo modello tridimensionale offre una piattaforma pertinente per studiare le interazioni tumora-stroma e testare le terapie antitumorali.

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

Qui, stabiliamo una piattaforma di profilazione metabolica che integra gliomi sferoidi tridimensionali (3D) e normalizzazione basata sull'imaging tramite analisi del flusso extracellulare. Questo approccio consente una valutazione più accurata delle risposte metaboliche dei tumori ai trattamenti farmacologici e fornisce informazioni sui potenziali meccanismi di resistenza.

Progressi nella profilazione metabolica degli sferoidi tridimensionali dei tumori cerebrali per lo screening dei farmaci

Impara a valutare la salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari 3D. Questo metodo permette di studiare l'attivazione dei CAF e le loro interazioni con il microambiente tumorale.

Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D (Video) | JoVE Journal

Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D

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