Name: Protesi alla testa per il neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Scopri la neuroimmagine funzionale in ratti svegli e fissati con la testa utilizzando una protesi leggera progettata con software CAD. Questo metodo elimina le variabili di confusione degli anestetici e migliora l'integrità dei dati neurali.

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Ringraziamo Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha e Amirsoheil Zareh per il loro aiuto durante l'addestramento dei ratti e la preparazione delle imbracature. Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH, numero di sovvenzione: NS119852) e dalla Fondazione Leducq (numero di sovvenzione: 15CVD02).

Tutte le procedure erano conformi alle linee guida del National Institute of Health e approvate dall'Università della California, Irvine Animal Care and Use Committee. In questo studio sono stati utilizzati sette maschi e una femmina di ratto (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g). Dopo il completamento dello studio, i ratti sono stati sacrificati usando overdose di anidride carbonica.
1. Progettazione di diversi componenti
<ol><li>Progettazione dell'impianto cranico:<ol><li>Realizzare l'impianto della testa utilizzando un software CAD (Figura 1C) e progettarlo per visualizzare l'area posteriore al bregma e adiacente alla linea mediana centrata sulla corteccia somatosensoriale. Assicurarsi che l'impianto cranico copra un'area compresa tra 0,9 mm e 1,9 mm sul cranio lontano dall'area di imaging.</li>
		<li>Utilizzare solo tre viti per ancorare l'impianto della testa sul cranio del ratto. Progettare tutti i fori delle viti in modo che rimangano sul lato opposto della linea mediana nell'emisfero controlaterale dell'emisfero ripreso.</li>
		<li>Posizionare una barra, scavata dall'interno, nella parte superiore dell'impianto della testa per consentire ai fili di fissare il cappuccio della testa all'impianto della testa come mostrato nella Figura 1D.</li>
	</ol></li>
	<li>Design del cappuccio:<ol><li>Assicurarsi che il cappuccio copra completamente l'area di imaging e la protegga da qualsiasi tipo di trauma, come mostrato nella Figura 1A, B. Aggiungi una curvatura alla calotta della testa in modo che si allinei alla forma della testa senza causare difficoltà alle attività quotidiane dell'animale nelle gabbie arricchite standard.</li>
		<li>Tagliare il lato interno del cappuccio in una forma rettangolare più ampia in modo che la parte superiore dell'impianto cranico possa adattarsi ad esso, come mostrato nella Figura 1E. Perpendicolare a questo rettangolo, tagliare altre due regioni rettangolari per ancorare il cappuccio alla protesi della testa.</li>
		<li>Far passare un filo attraverso la barra scavata superiore dell'impianto della testa per il fissaggio del cappuccio sulla testa del ratto, come mostrato nella Figura 1E-G. Passa il secondo filo allo stesso modo. NOTA: Questi fili possono essere facilmente rimossi utilizzando pinze o pinze. I file di stampa 3D vengono forniti (formato file: STL) come file supplementare 1 e file supplementare 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Design del telaio della testa:<ol><li>Progettare il telaio della testa in modo che una parte tagliata possa muoversi attraverso la barra superiore dell'impianto della testa e venga fissata utilizzando un morsetto.</li>
		<li>Inclinare l'altra parte tagliata per fornire una resistenza extra per mantenere la testa del ratto fissata per rendere il lato controlaterale completamente accessibile per l'imaging. Ai fini di questo studio, tagliare la piastra di acciaio con ceole di stagno per produrre il telaio della testa (Figura 1H, I). NOTA: anche questa parte può essere stampata in 3D.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Addestramento iniziale dei ratti
<ol><li>Consentire ai ratti di acclimatarsi all'ambiente del vivaio nelle loro gabbie per 2-3 giorni.</li>
	<li>Inizia a maneggiare il topo in una stanza tranquilla. Apri la gabbia e chiedi allo sperimentatore di mettere la mano all'interno della gabbia vicino al topo per 15-20 minuti per consentire al topo di abituarsi.</li>
	<li>Una volta che il topo mostra calma non spaventandosi o scappando dalle mani dello sperimentatore, raccogli delicatamente il topo per la manipolazione. Maneggiare il topo per 30-45 minuti ogni giorno prima dell'allenamento dell'imbracatura.</li>
</ol>3. Allenamento con imbracatura
<ol><li>Allenare i ratti per almeno 2-3 giorni nelle imbracature prima dell'impianto chirurgico dell'impianto cranico e del cappuccio.</li>
	<li>Disporre la configurazione dell'imbracatura come mostrato nella Figura 2A. Pulire la configurazione dell'imbracatura utilizzando salviette a etanolo. NOTA: Tutte le imbracature sono cucite a mano e realizzate con un materiale di rete sul fondo o su entrambi i lati, come mostrato nella figura 2A, B.</li>
	<li>Per l'addestramento dell'imbracatura, anestetizzare i ratti usando il 4% di isoflurano per l'induzione e l'1% per il mantenimento fino a quando non c'è il riflesso del pizzicamento della zampa posteriore.</li>
	<li>In anestesia con isoflurano, posizionare i ratti su un foglio di plastica flessibile di 20 cm x 8 cm (lunghezza x larghezza), dove 10 cm x 8 cm del foglio di plastica sono completamente coperti con la parte più morbida del Velcro. NOTA: Anestetizzare i ratti per l'allenamento con l'imbracatura è un passaggio facoltativo, utilizzato principalmente per ridurre lo stress e l'ansia.</li>
	<li>Per i primi 2 giorni dell'allenamento, metti il topo comodamente in un calzino per bambini (taglia 0-3 mesi) con la testa fuori attraverso un piccolo foro inciso all'estremità del calzino.</li>
	<li>Avvolgere un piccolo pezzo di tampone assorbente intorno alla parte inferiore del corpo per mantenere il ratto asciutto e raccogliere gli escrementi.</li>
	<li>Avvolgere il topo in un panno di cotone traspirante (dimensioni: 25 cm x 25 cm). Metti il topo su un foglio di plastica che ha Velcro strisce incollate ad esso.</li>
	<li>Fissare ulteriormente il ratto al foglio di plastica usando strisce Velcro larghe 0,5 cm ad una distanza di 3-6 mm l'una dall'altra.</li>
	<li>Fissare il topo nella fionda. Rimuovere l'anestesia gassosa. Consentire al ratto di riprendersi dall'anestesia gassosa nell'imbracatura.</li>
	<li>Quando il topo inizia a frullare, offri alcune gocce di soluzione di saccarosio al 10% come ricompensa ogni 10-15 minuti.</li>
	<li>Presentare casualmente al ratto gli stimoli sensoriali che verranno utilizzati durante l'imaging (qui la stimolazione dei baffi, ogni 15-25 minuti) per abituarlo agli stimoli sensoriali. Stimolare manualmente i baffi a intervalli casuali.</li>
	<li>Allena il topo nell'imbracatura per 1 ora il giorno 1, 2 ore il giorno 2 e 3 ore il giorno 3 come mostrato nella Figura 2C.</li>
</ol>4. Preparazione prechirurgica
<ol><li>Stampare l'impianto cranico e il cappuccio della testa utilizzando la stampante 3D (Figura 1).</li>
	<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i copricapi (impianti e cappucci) immergendo l'apparecchiatura nel germicida Metricide28 per 10 ore. Risciacquare accuratamente gli strumenti con acqua sterile poco prima dell'intervento.</li>
	<li>Esporre il ratto al 4% di isoflurano e quindi mantenere all'1% -2% di isoflurano fino a quando non c'è il riflesso del pizzicamento della zampa posteriore. Questo intervento chirurgico può essere eseguito sotto molti tipi di anestesia, come isoflurano, pentobarbital di sodio, e ketamina-xilazina.</li>
	<li>Iniettare atropina (0,05 mg/kg) per via intramuscolare per ridurre le secrezioni mucose per aiutare nella respirazione.</li>
	<li>Rasare la testa del ratto di 5 mm centrata attorno alla linea mediana usando un tagliacapelli partendo da tra gli occhi fino alla parte posteriore delle orecchie.</li>
	<li>Monitorare la saturazione parziale di ossigeno e la frequenza cardiaca attraverso un pulsossimetro e una sonda cardiofrequenzimetro fissata alla zampa posteriore del ratto.</li>
	<li>Pulire la testa del topo e l'area circostante tre volte con cicli alternati di betadine e salviette imbevute di alcool al 70%.</li>
	<li>Fissare il topo in un sistema stereotassico.</li>
	<li>Inserire una sonda rettale lubrificata con vaselina per misurare la temperatura corporea del ratto e mantenerla attraverso il sistema di feedback della coperta riscaldante per evitare l'ipotermia dopo la somministrazione di anestetico.</li>
	<li>Somministrare anestetico locale lidocaina cloridrato ad una concentrazione di 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 peso corporeo per via sottocutanea nel sito chirurgico.</li>
	<li>Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.</li>
	<li>Somministrare il 2% di anestetico locale per via sottocutanea sul sito chirurgico.</li>
	<li>Iniettare 3 ml di soluzione di suoneria lattata a temperatura ambiente per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e fornire nutrimento durante l'intervento chirurgico.</li>
</ol>5. Chirurgia
<ol><li>Rimuovere la parte della pelle sopra il sito chirurgico (diametro di 4 mm centrato attorno alla linea mediana e al centro della testa) utilizzando forbici chirurgiche affilate. Sezionare e rimuovere parte della pelle (~ 2 mm di diametro, sopra la corteccia somatosensoriale sinistra) tra l'orecchio e l'occhio sulla parte temporale della testa.</li>
	<li>Rimuovere, utilizzando un bisturi, il tessuto cutaneo sottostante (pericranio) per esporre il cranio. Pulire il cranio con una garza di cotone sterilizzata.</li>
	<li>Ritrarre / resecare il muscolo temporale per esporre la dimensione desiderata per l'area di imaging [7,5 mm per 7,5 mm per questo studio].</li>
	<li>Esporre il cranio sull'emisfero controlaterale per l'impianto della testa. Posizionare l'impianto della testa sul cranio per accertare la posizione delle viti di ancoraggio per l'impianto, come mostrato in Figura 2D-F.</li>
	<li>Contrassegnare il teschio per forare le viti usando l'inchiostro indiano con la punta 1. Praticare i fori di bava per le viti utilizzando la punta del trapano dentale 3. Avvitare l'impianto della testa in posizione.</li>
	<li>Asciugare il cranio usando una garza sterile. Applicare un sottile strato di adesivo tissutale intorno e sotto l'impianto della testa per incollarlo al cranio. Applicare uno strato di cemento dentale per sostenere ulteriormente l'impianto della testa in posizione e lasciare asciugare il cemento per 2-3 minuti. NOTA: L'uso di adesivo per tessuti in aggiunta al cemento dentale garantisce una forte tenuta8.</li>
	<li>Utilizzando la punta 3 del trapano dentale, assottigliare un'area di 7,5 mm x 7,5 mm sul lato sinistro del cranio appena posteriore al bregma e laterale alla linea mediana. Assottigliare il cranio a ~50 μm come mostrato nella Figura 3A.</li>
	<li>Applicare un unguento antibiotico topico sul sito chirurgico e quindi coprirlo con un sottile strato di gomma siliconica per proteggere il cranio assottigliato, come mostrato nella Figura 3B. Coprire il sito chirurgico utilizzando il cappuccio della testa come mostrato nella Figura 3C. Fissarlo in posizione con i due piccoli pezzi di fili che attraversano sia l'impianto cranico che il cappuccio della testa come mostrato in Figura 3D, E. Applicare gomma siliconica per coprire la calotta della testa e il cranio per stabilizzare ulteriormente la cuffia sulla testa del ratto, come mostrato nella Figura 3F. NOTA: La gomma siliconica fornisce una protezione aggiuntiva al cranio assottigliato.</li>
	<li>Iniettare nel ratto flunixin meglumina (2,5 mg/kg) per via sottocutanea per la gestione del dolore e dell'infiammazione. Per prevenire l'infezione, iniettare enrofloxacina antibiotica Enrosite (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-0,01), per via intraperitoneale.</li>
	<li>Spostare il topo nella camera di recupero per aiutare a mantenere la temperatura corporea con una coperta riscaldante e una lampada di calore. Monitorare continuamente il ratto fino a quando non riprende conoscenza e può mantenere la recumenza sternale.</li>
	<li>Riportare il topo nella sua gabbia separata una volta che si è completamente ripreso.</li>
	<li>Per i prossimi 3 giorni, somministrare flunixina e buprenorfina per alleviare l'infiammazione e il dolore e arruolarsi per prevenire l'infezione due volte al giorno.</li>
</ol>6. Imaging sveglio
<ol><li>Anestetizzare il ratto con il 4% di isoflurano per l'induzione e l'1% per il mantenimento quando non c'è riflesso del pizzicamento della zampa posteriore. Iniettare acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) per via sottocutanea. NOTA: Questa concentrazione di acepromazina è inferiore a livelli di sedazione lievi e aiuta solo a mantenere calmi i ratti durante il processo di imaging.</li>
	<li>Utilizzando strisce di Velcro personalizzate, fissare il ratto sul foglio di plastica utilizzato durante le procedure di allenamento. Avvolgere la parte inferiore del corpo usando un tampone di assorbimento e posizionare il ratto comodamente nell'imbracatura.</li>
	<li>Rimuovere la gomma siliconica. Rimuovere il cappuccio della testa rimuovendo i fili di fissaggio. Fissare il telaio della testa nell'impianto della testa come mostrato nella Figura 2G.</li>
	<li>Bloccare il telaio della testa in morsetti come mostrato nella Figura 2H, I.</li>
	<li>Rimuovere l'anestesia gassosa. Lavare l'area di imaging con soluzione salina 3x e pulire con una garza bagnata. Asciugare l'area di imaging e creare un pozzo, usando vaselina, attorno all'area di imaging. Riempire il pozzetto con soluzione salina sterilizzata e coprire con un vetrino (Figura 2E).</li>
	<li>Fare riferimento alle procedure di acquisizione per l'imaging ottico del segnale intrinseco, il protocollo di stimolazione dei baffi e l'analisi e la presentazione dei dati, che sono state discusse in dettaglio in precedenza 6,7.</li>
	<li>Durante l'esperimento, monitorare i ratti per segni di agitazione e irrequietezza, che possono essere ulteriormente ridotti coprendo gli occhi dei ratti con un panno morbido o una garza (opzionale).</li>
</ol>

<ol><li>Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+protocols+in+laboratory+animals+used+for+scientific+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomedica%22%5BJournal%5D)">Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes.</a> Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).</li>
<li>Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+of+animal+models+of+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging of animal models of brain disease.</a> British Medical Bulletin. 65, 235-257 (2003).</li>
<li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+repeated+anaesthesia+on+physiological+parameters+in+male+Wistar+rats%3A+A+telemetric+study+about+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine%2C+midazolam+and+fentanyl%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl.</a> BMC Veterinary Research. 10, 310(2014).</li>
<li>Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+monitoring+in+small+laboratory+mammals+used+in+anesthesiology%2C+respiratory+and+critical+care+research%3A+A+systematic+review+on+the+current+reporting+in+top-10+impact+factor+ranked+journals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals.</a> PLoS One. 10 (8), 0134205(2015).</li>
<li>Chen-Bee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+quantifying+evoked+cortical+activity+assessed+with+intrinsic+signal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging.</a> Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).</li>
<li>Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triphasic+intrinsic+signal%3A+Implications+for+functional+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).</li>
<li>Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+signal+optical+imaging+of+brain+function+using+short+stimulus+delivery+intervals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).</li>
<li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+functional+brain+imaging+in+awake+minimally+restrained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).</li>
<li>Stenroos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+rat+brain+functional+magnetic+resonance+imaging+using+standard+radio+frequency+coils+and+a+3D+printed+restraint+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 548(2018).</li>
<li>Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogler%2C+GA+%22The+Laboratory+Rat%22">The Laboratory Rat</a>. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--Procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+and+Mot+Research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls.</a> Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).</li>
<li>Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylic+resin+molding+based+head+fixation+technique+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53064(2016).</li>
<li>Ferris, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+in+awake+animal+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Applications in awake animal magnetic resonance imaging.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 854377(2022).</li>
<li>Tiran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+functional+ultrasound+imaging+in+freely+moving+awake+mice+and+anesthetized+young+rats+without+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li>
<li>Desjardins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+mouse+imaging%3A+From+two-photon+microscopy+to+blood+oxygen+level-dependent+functional+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%3A+Cognitive+Neuroscience+and+Neuroimaging%22%5BJournal%5D)">Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging.</a> Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).</li>
<li>Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+a+chronic+cranial+window+implant+in+the+rat+for+longitudinal+in+vivo+two-photon+fluorescence+microscopy+of+neurovascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function.</a> Scientific Reports. 9, 5499(2019).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+oxygen-metabolic+photoacoustic+microscopy+of+the+awake+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain.</a> Neuroimage. 150, 77-87 (2017).</li>
<li>Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+imaging+of+functional+brain+architecture+in+the+awake+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).</li>
<li>Roe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+imaging+of+intrinsic+signals+in+anesthetized+and+awake+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys.</a> Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).</li>
<li>Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturalistic+experience+transforms+sensory+maps+in+the+adult+cortex+of+caged+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals.</a> Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

L'uso dell'imaging del ratto sveglio e fissato con la testa offre molti vantaggi in termini di facilità e personalizzazione. Le imbracature progettate su misura consentono ai ratti di essere avvolti attraverso materiale di rete traspirante, eliminando la necessità di racchiudere gli animali in camere di contenimento di plastica chiuse per lunghi periodi di tempo10,11. I ratti sono mantenuti calmi e senza stress per tutta la lunga durata delle successive sessioni ...

La maggior parte delle indagini scientifiche di neuroimaging di base, precliniche e traslazionali sono acquisite da animali anestetizzati 1,2. Gli anestetici facilitano la sperimentazione ma influenzano continuamente il metabolismo del cervello e del corpo, la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca3. Il tipo di anestetico e la durata e la via di somministrazione aggiungono variabili confondenti all'interpretazione dei dati che potrebbero contribuire alla riproducibilità e ai fallimenti traslazionali4. Uno dei principali colli di bottiglia degli studi di neuroimaging del ratto sveglio e fissato con la testa è la necessità di mantenere il ratto fermo e calmo durante i processi di preparazione e acquisizione dei dati. Piccoli movimenti producono artefatti di movimento ingiustificati, che possono influire negativamente sull'analisi e sulle interpretazioni dei dati.
È stato ideato un nuovo modello di neuroimaging da ratti svegli e fissi con la testa utilizzando imbracature personalizzate, protesi per la testa tridimensionali stampate in 3D, tappi per la testa e un telaio per la testa che offre diversi vantaggi per una facile sperimentazione. L'impianto cranico 3D è leggero e copre una piccola porzione del cranio necessaria per il transfixing. Gli impianti cranici e i cappucci stampati in 3D sono progettati utilizzando software CAD (computer-aided design). I protocolli di stimolazione dei baffi, acquisizione dei dati, analisi dei dati e risultati di ratti anestetizzati sono stati descritti in dettaglio nel precedente lavoro 5,6,7.

<table><tbody><tr><td>Ratti</td><td>Charles River</td><td>Sprague Dawley</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pivetal</td><td>21295098</td><td>Anestetico generale</td></tr><tr><td>Lidocaina HCl 2% iniezione</td><td>Phoenix</td><td>L-2000-04</td><td>Anestetico locale</td></tr><tr><td>Atropina solfato iniezione</td><td>Vedco</td><td>5098907512</td><td>Aiuto nella respirazione</td></tr><tr><td>Soluzione per iniezione di Ringer lattato</td><td>Vedco</td><td></td><td></td>50989088317</tr><tr><td>Iniezione di flunixina</td><td>Vedco</td><td>6064408670</td><td>Gestione del dolore</td></tr><tr><td>Iniezione di enrosite (Enrofloxacina 2,27%)</td><td>VetOne</td><td>501084</td><td>Evitare l'infezione</td></tr><tr><td>Iniezione di PromAce (Acepromazina maleato)</td><td>Beohringer Ingelheim</td><td>136059</td><td></td></tr><tr><td>Animax unguento</td><td>Dechra Prodotti veterinari</td><td>122-75</td><td>Principi attivi di nistatina 1000 unità per grammo, neomicina solfato 2,5 mg per grammo, tiostrepton 2500 unità per grammo e triamcinolone acetonide 1 mg per grammo</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico Puralube</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>211-38</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di preparazione PVP povidone-iodio</td><td>Medline</td><td>MDS093917</td><td>Betadine generico</td></tr><tr><td>Tamponi di alcol isopropilico</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>tessuto Vetbond adesivo</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Fresa (punta da trapano), standard in metallo duro operatorio</td><td>SS Bianco Frese</td><td>14829</td><td>#3</td></tr> Viti fresa, <tr><td>00-90 x 1/8 testa piatta in acciaio inox</td><td>J.I. Morris</td><td>F0090CE125</td><td>Viti di ancoraggio</td></tr><tr><td>Sistema stereotassico</td><td>Kopf Instruments</td><td>1430</td><td></td></tr><tr><td>Coperta riscaldante omeotermica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>50-7220-F</td><td></td></tr><tr><td>Pulsossimetro e cardiofrequenzimetro</td><td>Kent Scientific</td><td>MouseStat Jr.</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum</td><td>Fisher Scientific</td><td>P66-1LB</td><td>Vaselina generico</td></tr><tr><td>Filo, rame nudo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-545-2C</td><td>20 gauge</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure polvere</td><td>Pearson Dental</td><td>C73-0054&nbsp;</td><td>principio attivo: Metacrilato di metile</td></tr><tr><td>Teets Liquido per polimerizzazione a freddo</td><td>Pearson Dental</td><td>C73-0078&nbsp;</td><td>principio attivo: Metacrilato di metile</td></tr><tr><td>Stampo in silicone in gomma</td><td>Smooth-On</td><td>Body Double</td><td>Fast silicone polymer</td></tr><tr><td>Metricide 28 (Germicida)</td><td>Metrex</td><td>Oct-05</td><td></td></tr><tr><td>Inchiostro di India, nero</td><td>Pelikan</td><td>301051</td><td></td></tr><tr><td>Trapano dentale</td><td>NSK Dental Ultimate</td><td>XL-F</td><td></td></tr><tr><td>Stampante 3D</td><td>Prusa Research</td><td>i3 MK3S+</td><td></td></tr><tr><td>Cucire su elementi di fissaggio</td><td>Velcro</td><td>90030</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto multiuso per la protezione degli animali domestici</td><td>Joann</td><td>10173334</td><td>Materiale di rete</td></tr><tr><td>Bur (punta da trapano), frese standard in metallo duro</td><td>SS White Burs</td><td>14829</td><td>#1</td></tr></tbody></table>

protesi alla testa per il neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa

Head Implants for the Neuroimaging of Awake, Head-Fixed Rats

Gli anestetici, comunemente usati nella ricerca scientifica preclinica e fondamentale, hanno un'influenza depressiva sulle funzioni metaboliche, neuronali e vascolari del cervello e possono influenzare negativamente i risultati neurofisiologici. L'uso di animali svegli per studi di ricerca è vantaggioso, ma pone la sfida principale di mantenere gli animali calmi e fermi per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'acquisizione dei dati. L'imaging sveglio nei roditori di piccole dimensioni (ad esempio, topi) è molto comune, ma rimane scarso nei ratti poiché i ratti sono più grandi, più forti e hanno una maggiore tendenza a opporsi alle restrizioni di movimento e alla fissazione della testa per le lunghe durate richieste per l'imaging. Viene descritto un nuovo modello di neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa utilizzando imbracature personalizzate cucite a mano, protesi per la testa stampate in 3D, tappi per la testa e un telaio. I risultati ottenuti a seguito di una singola prova di stimolazione a baffo singolo suggeriscono un aumento dell'intensità della risposta funzionale evocata. L'acquisizione della risposta funzionale evocata da ratti svegli e fissi con la testa è più veloce di quella dei ratti anestetizzati, affidabile, riproducibile e può essere utilizzata per studi longitudinali ripetuti.

Vengono mostrati i segnali rappresentativi di imaging ottico di un singolo studio di un ratto anestetizzato e la risposta sommata (di 40 studi raccolti) di un ratto sveglio (Figura 4). L'intensità del segnale per la stimolazione a baffo singolo di un ratto sveglio può essere visualizzata a una soglia più alta rispetto al ratto anestetizzato, mostrando un segnale più forte dall'animale sveglio. I baffi C2 dei ratti vengono stimolati a 5 Hz per 1 s e la risposta funzionale viene visualizzata c...

Viene descritta una nuova procedura dettagliata per l'imaging funzionale di ratti svegli e fissati con la testa.

Protesi alla testa per il neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa

Anesthetics, commonly used in preclinical and fundamental scientific research, have a depressive influence on the metabolic, neuronal, and vascular ...

La maggior parte del lavoro di base e traslazionale proviene da animali anestetizzati. Gli anestetici possono aggiungere variabili confondenti all'analisi e all'interpretazione dei dati. Questo lavoro consente all'imaging sveglio nei ratti di aggirare questo problema.Questo design è abbastanza semplice. L'intero assemblaggio è leggero, quindi non compromette la normale vita dell'animale. Ciò significa che può essere utilizzato anche per l'imaging cronico a lungo termine.Ad aiutare a dimostrare questa procedura sarà il Dr.Mehwish Bhatti, un postdoc senior del nostro laboratorio. Inizia realizzando l'impianto della testa utilizzando un software CAD per visualizzare l'area posteriore al bregma e adiacente alla linea mediana centrata sulla corteccia somatosensoriale. Assicurarsi che l'impianto cranico copra un'area da 0,9 a 1,9 millimetri sul cranio lontano dall'area di imaging.Utilizzare solo tre viti per ancorare l'impianto della testa sul cranio del ratto. Progetta tutti i fori delle viti sul lato opposto della linea mediana nella parte controlaterale dell'emisfero dell'immagine. Per consentire ai fili di fissare il cappuccio della testa all'impianto della testa, posizionare una barra cava nella parte superiore dell'impianto della testa.Quindi, progettare il cappuccio, assicurandosi che copra interamente l'area di imaging e la protegga da eventuali traumi. Aggiungi una curvatura alla calotta della testa in modo che si allinei alla forma della testa senza causare difficoltà alle attività quotidiane dell'animale nelle gabbie arricchite standard. Tagliare il lato interno del cappuccio in una forma rettangolare più ampia in modo che la parte superiore dell'impianto della testa possa adattarsi ad esso.Perpendicolare a questo rettangolo, tagliare altre due regioni rettangolari per ancorare il cappuccio alla protesi della testa. Per fissare il cappuccio sulla testa del ratto, passare i fili attraverso la barra scavata superiore dell'impianto della testa. Progettare il telaio della testa in modo che una parte tagliata possa muoversi attraverso la barra superiore dell'impianto della testa e venga fissata utilizzando un morsetto.Per rendere accessibile il lato controlaterale per l'imaging, inclinare l'altra parte tagliata per fornire una forza extra per mantenere fissa la testa del ratto. Stampa l'impianto cranico e il cappuccio della testa utilizzando la stampante 3D. Misurare il peso dell'animale per calcolare la quantità di anestetico da somministrare.Anestetizzare l'animale iniettando pentobarbital di sodio per via intraperitoneale. Diverse alternative di anestesia possono essere utilizzate in questo intervento chirurgico come isoflurano, ketamina o xilazina. Iniettare atropina per via intramuscolare per ridurre le secrezioni di muco durante la respirazione.Usando un tagliacapelli, radere la testa del topo iniziando tra gli occhi e la parte posteriore delle orecchie di cinque millimetri centrata attorno alla linea mediana. Quindi monitorare la saturazione parziale di ossigeno e la frequenza cardiaca utilizzando un pulsossimetro e una sonda cardiofrequenzimetro fissata alla zampa posteriore del ratto. Pulire la testa del topo e l'area circostante tre volte con Betadine e salviette alcoliche al 70% in alternativa.Fissare il topo in un sistema stereotassico. Quindi, inserire una sonda rettale lubrificata con vaselina per misurare la temperatura corporea del ratto e mantenerla attraverso il sistema di feedback della coperta riscaldante per evitare l'ipotermia dopo la somministrazione di anestetico. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.Somministrare il 2% di anestetico locale per via sottocutanea sul sito chirurgico e tre millimetri di soluzione di Ringer lattato a temperatura ambiente per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e fornire nutrimento durante l'intervento chirurgico. Usando forbici chirurgiche affilate, rimuovere la parte della pelle sopra il sito chirurgico. Sezionare e rimuovere parte della pelle tra l'orecchio e l'occhio sulla parte temporale della testa.Utilizzando un bisturi, rimuovere il tessuto cutaneo sottostante per esporre il cranio. Quindi pulire il cranio con una garza di cotone sterilizzata. Tagliare il muscolo temporale ed esporre l'area del cranio sull'emisfero controlaterale per l'impianto della testa.Posizionare l'impianto di testa sul cranio per accertare la posizione delle viti di ancoraggio per l'impianto. Ora segna il teschio usando l'inchiostro dell'India per forare le viti con la punta da trapano. Praticare i fori di bava per le viti utilizzando la punta da trapano dentale tre e avvitare l'impianto della testa in posizione.Asciugare il cranio con una garza sterile e applicare un sottile strato di adesivo tissutale intorno e sotto l'impianto della testa per incollarlo al cranio. Utilizzare il cemento dentale per sostenere ulteriormente l'impianto della testa in posizione e lasciare asciugare il cemento per due o tre minuti. Inoltre, utilizzare la punta del trapano dentale tre per ridurre lo spessore di un'area di 7,5 millimetri per 7,5 millimetri sul lato sinistro del cranio appena posteriore al bregma e laterale alla linea mediana a 50 micrometri.Applicare un unguento antibiotico topico sul sito chirurgico e quindi coprirlo con un sottile strato di gomma siliconica per proteggere il cranio sottile. Quindi, coprire il sito chirurgico utilizzando il cappuccio della testa e fissarlo in posizione con i due piccoli pezzi di fili che attraversano sia l'impianto della testa che il cappuccio. Applicare gomma siliconica per coprire il cappuccio e il cranio per stabilizzare ulteriormente il cappuccio sulla testa del ratto.Somministrare buprenorfina e antibiotici per via intraperitoneale per gestire rispettivamente il dolore e l'infiammazione e prevenire l'infezione. Vengono mostrati i segnali di imaging ottico dalla risposta sommata di un ratto sveglio e una singola prova di un ratto anestetizzato. La risposta funzionale del ratto fisso a testa sveglia è 140 volte più forte di quella del ratto anestetizzato.Fare attenzione a non aggiungere troppo cemento sopra la piastra di testa. Può impedire il corretto fissaggio del cappuccio. Questo metodo può essere ampiamente applicato al neuroimaging del cranio sottile fissato dalla testa sveglia.Con le craniotomie, può essere esteso ad altri protocolli di neuroimaging, tra cui l'imaging a ultrasuoni funzionali, l'imaging del calcio e l'imaging a fluorescenza. L'imaging sveglio consentirà un nuovo corpo di lavoro senza le variabili confondenti introdotte con gli anestetici.

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Il video mostra una procedura per impiantare un'unità di elettrodi multicanale bidirezionale wireless nel cervello di un ratto per registrare e stimolare reti neurali multicanale.

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