Separazione automatica e raccolta di sostanze correlate al cancro da campioni clinici
13 gennaio 2023
Questo documento descrive l'applicazione di apparecchiature automatizzate per separare e raccogliere in modo semplice ed efficiente sostanze, come il DNA privo di cellule e le cellule tumorali circolanti, dal sangue intero.
Il nostro protocollo è facile da usare. Usando questa tecnica, chiunque può facilmente isolare il componente dal sangue. La contaminazione può essere ridotta al minimo e i materiali possono essere separati con precisione.
Con l'automazione e l'istituzione di questo protocollo, i ricercatori possono facilmente ottenere sostanze correlate al cancro con elevata purezza, il che è utile per vari studi a valle. In particolare, si prevede che apporterà importanti vantaggi per la ricerca sugli utenti finali. A dimostrare la loro procedura sarà Jay Jeong, ricercatore senior e assistente manager presso il Cancer Genomics Research Institute.
Per iniziare, caricare la cartuccia LBx 1 selezionando il tipo di cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Premere il pulsante freccia per modificare il numero di campioni. Quindi, aprire lo sportello dello strumento e inserire tutte le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce.
Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante di esecuzione sullo schermo del touchpad.
Lo strumento chiude le valvole sulle cartucce che richiede circa 30 secondi. Segui il messaggio per aprire la porta. Rimuovere la ruota di supporto e rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia.
Pipettare un massimo di 10 millilitri di un campione di sangue intero utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue. Dopo aver inserito le cartucce nello strumento, chiudere lo sportello dello strumento e premere il pulsante OK.
I mantelli di plasma e buffy vengono automaticamente separati dal sangue intero, il che richiede circa 30 minuti. Una volta separati il plasma e il buffy coat, apparirà un messaggio sullo schermo accompagnato da un suono di allarme. Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante di arresto.
Apri la porta. Rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo. Recuperare tre millilitri di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta per pipetta da un millilitro.
Quindi, recuperare tre millilitri del buffy coat dall'uscita del buffy coat usando una punta di pipetta da un millilitro. Quindi, caricare la cartuccia LBx 2 selezionando il nome della cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Premere il pulsante freccia per modificare il numero di campioni e seguire la stessa procedura indicata per la cartuccia LBx 1 per inserire la cartuccia nel supporto della cartuccia.
Dopo aver inserito la cartuccia e chiuso lo sportellone, premere il pulsante di esecuzione sullo schermo del touchpad. Seguire la procedura illustrata in precedenza per rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia e posizionarla sul tavolo. Pipettare la soluzione del gradiente di densità utilizzando una pipetta sierologica.
Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso della cartuccia e iniettare lentamente la soluzione. Quindi, pipettare l'intero campione di sangue e iniettarlo lentamente nell'ingresso del campione. Dopo aver inserito e fissato la cartuccia, chiudere lo sportello e premere il pulsante OK.
Una volta che il plasma e il PBMC sono automaticamente separati dal sangue intero, apparirà un messaggio accompagnato da un suono di allarme. Aprire lo sportello e rimuovere la cartuccia. Recuperare tre millilitri di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta di pipetta da un millilitro, quindi recuperare tre millilitri di PBMC dall'uscita PBMC.
Allo stesso modo, per la cartuccia FAST-auto, dopo aver rimosso la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia, iniettare sei millilitri della soluzione PBS nell'ingresso PBS della cartuccia. Quindi, pipettare tre millilitri di sangue intero o buffy coat ottenuto da LBx 1, o campione PBMC ottenuto da LBx 2, e iniettare lentamente il campione nell'ingresso del campione della cartuccia. Dopo aver inserito la cartuccia e averla fissata, chiudere lo sportello e premere il pulsante OK.
Una volta completato l'arricchimento automatico dei CTC, interrompere l'allarme. Rimuovere la cartuccia e inserire il dispositivo di rimozione della piastra posteriore, o BPR, nei quattro fori sulla parte anteriore della cartuccia. Premere l'ala blu scuro con i pollici di entrambe le mani e quindi premere il corpo azzurro fino a quando non scatta.
Rimuovere con cautela il corpo della cartuccia sollevandolo. Molto delicatamente, raccogliere la membrana del filtro dal bordo usando una pinzetta e posizionare la membrana in un tubo da 1,5 millilitri per la preparazione dell'acido nucleico o su un vetro diapositiva per la colorazione. Se necessario, recuperare il sangue filtrato all'uscita del sangue utilizzando una punta di pipetta da un millilitro.
I cfDNA estratti sono stati valutati utilizzando Bioanalyzer e i nastri dello schermo cfDNA sono stati utilizzati insieme a una scala elettronica. La linea verde è stata utilizzata per allineare la scala e il campione. I segni del triangolo indicano la banda del DNA.
La maggior parte del cfDNA ha una lunghezza di 166 coppie di basi e alcune esistono in multipli interi di lunghezza. Di solito, la concentrazione di cfDNA misura fino alle dimensioni di 50-700 coppie di basi. Sebbene ci sia una differenza nella quantità ottenuta da ogni singolo campione, come 8,47 nanogrammi per millilitro e 5,2 nanogrammi per millilitro, i risultati dell'estrazione del cfDNA sono stati buoni sia per la concentrazione che per la distribuzione delle dimensioni in tutti i casi.
Questi risultati indicano che il metodo LBx 1 separa accuratamente il plasma contenente cfDNA. In FAST-auto, la membrana è stata rimossa e colorata con anticorpi fluorescenti per rilevare CTC e globuli bianchi. La membrana colorata, posta su vetrini, è stata osservata al microscopio a fluorescenza.
Dopo la colorazione della membrana, le cellule mostrano segnali DAPI o positivi nucleari in blu, mentre EpCAM e CK o CTC positivi sono evidenziati in verde e CD45 o WBC positivi sono evidenziati in rosso. Non è difficile rimuovere la membrana. Tuttavia, è necessario fare attenzione alla perdita e alla contaminazione dei CTC.
Sangue intero, PBMC e buffy coat sono tutti disponibili. Invece, devi solo impostare l'intero volume. Possono essere utilizzati anche altri liquidi, anche se saranno necessari test.
Questa tecnica può essere utilizzata direttamente negli ospedali e la sostanza può essere ottenuta rapidamente.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo di facile utilizzo per la separazione e raccolta automatizzata di sostanze da sangue intero, inclusi DNA libero da cellule e cellule tumorali circolanti. Questa tecnica minimizza le contaminazioni e consente una separazione accurata, facilitando l'estrazione ad alta purezza di sostanze correlate al cancro per studi successivi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Elaborazione automatizzata del sangue
- Genomica del cancro
- Estrazione di sostanze
Sfondo
- Importanza dell'isolamento di sostanze correlate al cancro dal sangue.
- Sfide nel ridurre al minimo la contaminazione durante l'estrazione.
- Necessità di protocolli efficienti nella ricerca sul cancro.
- Ruolo dell'automazione nel migliorare l'efficienza della ricerca.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplice da usare per l'estrazione delle sostanze.
- Migliorare la purezza dei materiali estratti.
- Facilitare studi successivi nella ricerca sul cancro.
Metodi Utilizzati
- Attrezzatura automatizzata per la separazione.
- Stabilimento del protocollo per l'accessibilità da parte dell'utente.
- Minimizzazione della contaminazione durante l'estrazione.
- Raccolta di DNA libero da cellule e cellule tumorali circolanti.
Risultati principali
- Elevata purezza delle sostanze estratte.
- Isolamento efficace dei componenti associati al cancro.
- Dimostrazione del protocollo da parte di un ricercatore senior.
- Vantaggi potenziali per la ricerca dell'utente finale.
Conclusioni
- Il protocollo automatizzato migliora l'efficienza dell'estrazione.
- Fornisce vantaggi significativi per la ricerca sul cancro.
- La accessibilità del protocollo può agevolare diversi studi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La separazione automatizzata di sostanze correlate al cancro da campioni clinici affronta un collo di bottiglia fondamentale nei flussi di lavoro della biopsia liquida, consentendo l'estrazione ad alta purezza e riproducibile di analiti come il cfDNA e le CTC. Questa capacità aumenta la sicurezza predittiva nella scoperta precoce e nella ricerca traslazionale, riducendo al minimo le contaminazioni e standardizzando la preparazione dei campioni. La flessibilità della piattaforma supporta svariati studi omici e su biomarcatori successivi, rafforzando il processo decisionale sul portafoglio in punti critici di svolta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'isolamento preciso di cfDNA e CTC per un'analisi mirata su ipotesi dei percorsi del cancro.
- Riduce l'ambiguità biologica fornendo analiti ad alta purezza per la validazione funzionale dei bersagli.
- Supporta la previsione affidabile negli studi biomarker e meccanicistici in fase precoce.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce una preparazione del campione standardizzata e riproducibile per saggi molecolari e cellulari successivi.
- Semplifica lo sviluppo dei saggi fornendo materiale in ingresso costante tra diversi lotti e studi.
- Permette flussi di lavoro di screening scalabili attraverso l'automazione e la riduzione della variabilità introdotta dall'operatore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori supportando l'estrazione di analiti clinicamente rilevanti da campioni di pazienti.
- Mantiene la continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, garantendo l'integrità e la confrontabilità dei campioni.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento fornendo dati solidi e con contaminazione minima per i team multidisciplinari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma automatizzata di separazione si integra all'interfaccia tra acquisizione del campione e analisi molecolare successiva, collegando i flussi di lavoro della scoperta precoce, dell'identificazione dei composti promettenti e della ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando analiti pertinenti alla malattia dal sangue.
- Screening: Fornisce campioni pronti per il saggio, riproducibili, per piattaforme di screening molecolari e cellulari.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa della concentrazione di cfDNA e il conteggio delle CTC per studi comparativi.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica standardizzando gli input del campione.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità riutilizzabile e automatizzata, adattabile a diversi tipi di campioni e obiettivi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e la validazione degli obiettivi fornendo analiti ad alta purezza e con contaminazioni minimizzate.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità, la scalabilità e la standardizzazione tra gruppi e sedi di ricerca.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo i rischi biologici nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione di programmi biomarker e terapeutici con una gestione adeguata del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche nella manipolazione dei campioni e nell'analisi molecolare successiva.
- Necessita di strumentazione compatibile e di un'infrastruttura analitica per flussi di lavoro automatizzati.
- Richiede la standardizzazione trasversale ai team di protocolli e misure di controllo qualità.
- Adattabile a diversi tipi di campioni derivati dal sangue; richiede validazione per altri fluidi corporei.
- È necessaria un'accurata manipolazione per prevenire la perdita o la contaminazione di analiti rari come le CTC.
