Raccolta spermatica e analisi dello sperma assistita da computer nel modello Teleoste Medaka giapponese (Oryzias latipes)

Questa tecnica consente il campionamento della milt da un piccolo pesce modello, il Madaka giapponese, e lo studio della sua qualità in modo coerente. In particolare, la raccolta dello sperma mediante massaggio addominale consente di ripetere il campionamento sullo stesso pesce poiché questo approccio non è invasivo. Inoltre, questa tecnica può essere applicata per la conservazione criogenica dello sperma Madaka.

La qualità dello sperma è un indicatore essenziale del successo della fecondazione, e quindi un parametro importante da analizzare negli studi di fisiologia ecologica e produttiva intera. Per iniziare, prepara una spugna morbida, tagliandola per adattarla compiaciuta in una capsula di Petri. Taglia una linea retta al centro della spugna, che sia abbastanza lunga da tenere il pesce sul lato ventrale verso l'alto.

Dopo aver anestetizzato il pesce, asciugare l'addome del pesce pulendolo delicatamente con un tovagliolo di carta. Posizionare il pesce nel trogolo della spugna umida con il lato ventrale verso l'alto, in modo che le branchie siano esposte alla soluzione anestetica nella spugna. Se l'area intorno alla cloaca è bagnata, asciugare delicatamente la parte inferiore dell'addome con una salvietta di tessuto monouso.

Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la micro pipetta con un tubo aspiratore collegato contro la cloaca del pesce. Ora massaggiare l'addome del pesce stringendo delicatamente con una pinza liscia a punta smussata in un movimento da rostrale a caudale. Per il recupero del pesce, rilasciarlo dalla spugna nell'acqua di recupero precedentemente preparata prima di restituire il pesce al sistema dell'acquario.

Trasferire la milt raccolta in un tubo contenente la soluzione attivante preriscaldata e la soluzione di pipetta su e giù più volte utilizzando il gruppo tubo dell'aspiratore. Omogeneizzare delicatamente lo sperma diluito facendo scorrere i tubi prima dell'analisi. Dopo l'eutanasia, asciugarlo come dimostrato in precedenza e porre il pesce sotto un microscopio da dissezione con il lato laterale sinistro rivolto verso l'alto.

Usando piccole forbici da dissezione, tagliare un lembo dorsalmente dalla cloaca e poi attraverso le costole fino alle branchie per esporre gli organi interni. Individuare i testicoli e tagliare l'attacco ad entrambe le estremità con una pinza fine. Rimuovere i testicoli e trasferirli in un tubo preparato contenente una soluzione attivante preriscaldata.

Utilizzare la pinza per schiacciare i testicoli più volte contro il lato del tubo per rilasciare lo sperma, che può essere visualizzato dall'aspetto leggermente torbido della soluzione. Per iniziare l'analisi, aprire il software di analisi dello sperma e selezionare il modulo di motilità. Impostare le configurazioni nel software per tutti i parametri.

Posizionare un vetrino monouso da 20 micrometri preriscaldato sotto il microscopio su un palcoscenico riscaldato, impostato su 27 gradi Celsius. Pipettare il campione nella camera sul vetrino fino a riempimento, ma senza riempire eccessivamente. Rimuovere accuratamente i campioni in eccesso dall'ingresso della camera per evitare il movimento di deriva delle cellule nella soluzione.

Selezionare Analizza per esaminare il campione al microscopio. Assicurarsi che il microscopio sia focalizzato e selezionare nuovamente analizzare per registrare lo sperma sul campo. Spostare la diapositiva in una nuova area del campione nel fotogramma e ripetere la procedura per tre o cinque diversi campi visivi, evitando bolle d'aria, masse cellulari o artefatti.

Per visualizzare i risultati, selezionare i risultati e fare doppio clic su un campo per visualizzare il singolo campo o per verificare manualmente la presenza di spermatozoi etichettati in modo errato o non tracciati. Se necessario, fare clic con il pulsante destro del mouse sui singoli spermatozoi per rietichettare la motilità. Nel presente studio, l'analisi dello sperma assistita da computer è stata utilizzata per registrare vari parametri di velocità e movimento.

I valori calcolati includono l'indice di rettilineità, l'indice di linearità e l'oscillazione. L'osmolarità delle soluzioni di attivazione ha influito sulla motilità degli spermatozoi dalla dissezione dei testicoli. Gli spermatozoi erano immobili nell'acqua dell'acquario, ma mobili nell'HBSS con osmolarità alta e bassa.

Tuttavia, la motilità è significativamente ridotta a 36 milli osmol per chilogrammo, rispetto alle soluzioni di osmolalità più elevate. La motilità è stata anche influenzata dal metodo di raccolta dello sperma, in cui gli spermatozoi sono significativamente più mobili nel metodo di dissezione del testicolo rispetto al massaggio addominale. Inoltre, una percentuale più alta delle cellule era progressiva e più cellule si muovevano in media o rapidamente.

La percentuale di motilità e progressività sono significativamente più alte nello sperma immagazzinato a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio, rispetto ai 27 gradi Celsius di conservazione. Anche le condizioni ambientali e abitative hanno leggermente influenzato la motilità degli spermatozoi. Nessuna differenza significativa nella motilità degli spermatozoi è stata osservata negli spermatozoi raccolti dopo e prima della deposizione delle uova.

I maschi ospitati senza femmine per un mese hanno mostrato un'alta motilità, ma la differenza era insignificante. Per la raccolta dello sperma mediante massaggio addominale, è necessario un allenamento per imparare la corretta pressione e movimento del forcipe e per evitare la contaminazione simulata. Questa tecnica sarà molto utile per studiare, ad esempio, gli effetti di diversi inquinanti sulla fertilità maschile in studi ecotossicologici, dove Medaka è un modello comunemente usato.