Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Questo sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar può essere utilizzato per studiare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della dinamica e della distribuzione di proteine e lipidi durante le attività cellulari. Questa tecnica offre sia un'alta sub radice che una cattiva generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su errori di nanobar brevettati con curvatura della membrana predefinita da nanofabbricazione ad alta risoluzione. Per iniziare, posizionare il nano chip in un becher da 10 millilitri con il lato del modello rivolto verso l'alto.

Aggiungere con attenzione un millilitro di acido solforico al 98% al becher e assicurarsi che l'acido copra completamente il lato anteriore e posteriore del chip. Ruotare lentamente il becher e aggiungere 200 microlitri di perossido di idrogeno al 30% goccia a goccia fino a quando l'intero becher diventa caldo. Assicurarsi che l'acido solforico e il perossido di idrogeno siano ben miscelati per formare la soluzione Piranha per la rimozione delle molecole organiche dal nano chip.

Posizionare il becher in un contenitore di vetro secondario e mantenere il nano chip immerso nella soluzione di Piranha durante la notte per pulire accuratamente le impurità. Estrarre il becher e pipettare con cura la soluzione di Piranha in un contenitore per rifiuti acidi. Caricare cinque millilitri di acqua deionizzata nel becher per diluire l'acido residuo e gettarlo nei rifiuti acidi.

Ripetere questo passaggio cinque volte. Afferrare il chip con una pinzetta e lavare con un flusso continuo di acqua deionizzata per rimuovere accuratamente l'acido residuo. Asciugare il truciolo con azoto gassoso al 99,9% per la formazione di SLB.

Sonicare la miscela lipidica per 30 minuti. Congelare la miscela lipidica in azoto liquido per 20 secondi e poi scongelare a 42 gradi Celsius per due minuti a bagnomaria. Ripetere i cicli di congelamento/disgelo 30 volte.

Dopo di ciò, la miscela lipidica sembra un liquido chiaro. Passare la miscela lipidica attraverso il mini estrusore ed estrudere avanti e indietro 20 volte. Raccogliere i SUV dalla siringa sull'altro lato per ridurre la contaminazione con particelle più grandi o materiale estraneo e trasferirlo in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.

Estrarre accuratamente il nano chip pulito dall'acqua deionizzata con un paio di pinzette e asciugare con azoto gassoso al 99,9%. Eseguire la pulizia superficiale del nano chip con trattamento al plasma ad aria per un'ora. Assemblare il nano chip in una camera PDMS.

Inizia posizionando il chip su una superficie pulita con il motivo rivolto verso l'alto. Coprire delicatamente il PDMS centrale con il chip e assicurarsi che l'intero modello sia esposto all'area centrale della grande apertura di forma ovale nel PDMS centrale. Coprire il PDMS superiore con il PDMS centrale e mantenere i suoi due piccoli fori all'interno della regione del grande foro ovale del PDMS centrale.

Quindi, viene assemblata la camera PDMS. Caricare i SUV nel canale PDMS da uno dei due piccoli fori nel PDMS superiore con una pipetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per formare l'SLB. Pipettare delicatamente il tampone PBS nel canale PDMS da un lato del piccolo foro e rimuovere i rifiuti con un batuffolo di cotone dall'altro foro per lavare via i SUV non legati.

Quindi acquisire l'SLB formato sul nano chip. Impostare la microscopia confocale a scansione laser utilizzando un obiettivo olio 100x. Apri il software Zen per selezionare la potenza del laser di eccitazione che può eccitare la fluorescenza del lipide e delle proteine.

Scegliere Modalità di acquisizione. Quindi fare clic su Configurazione intelligente, seguito da Texas Red. Regolare la messa a fuoco con la manopola di messa a fuoco per individuare le nano barre sul chip fino a quando i bordi della barra nano sono nitidi sotto il canale lipidico.

Impostare i parametri di scansione per ottenere un'immagine di controllo del canale lipidico prima di aggiungere proteine. Condurre il test FRAP sbiancando con doppio strato lipidico marcato fluorescente su una singola area nanobar casuale. Selezionare le caselle di controllo Aree esperimento e Sbiancamento.

Disegna un'area circolare di cinque micrometri di diametro che può includere l'intera nanobarra al centro e aggiungi alle regioni dell'esperimento. Parametri di imaging TimeLapse di input. Scegliere Serie temporali.

Quindi fare clic su Durata. Selezionare 100 cicli e intervallo pari a due secondi. Parametri di sbiancamento in ingresso.

Selezionare le caselle di controllo laser che eseguono FRAP e impostare l'alimentazione su 100%Fare clic su Avvia esperimento per l'esperimento FRAP. Caricare la soluzione proteica nel canale PDMS e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire il legame della proteina sull'SLB. Rifocalizzare le nanobarre e impostare i parametri di scansione per acquisire immagini di entrambi i canali lipidici e proteici per il rilevamento della curvatura proteica.

Selezionare le regioni dell'esperimento e condurre il test FRAP su entrambi i canali lipidici e proteici ed eseguire l'imaging TimeLapse per caratterizzare la mobilità della proteina sensibile alla curvatura. Entrambi mostrano un maggiore accumulo all'estremità delle singole nanobarre rivestite SLB con larghezza di 300 nanometri. Qui l'SLB contiene 10% PS per migliorare elettrostaticamente il legame proteico.

Entrambe le proteine hanno un rapporto end-to-centro più alto rispetto ai lipidi, che è di circa uno. Quando si confrontano IDR FBP17 e F-Bar, il rapporto più alto tra estremità e centro di IDR FBP17 indica un rilevamento della curvatura più forte rispetto a F-Bar. Tutte e tre le proteine hanno mostrato un accumulo preferenziale nei siti di membrana curva dell'estremità nanobar quando la curvatura è diminuita al di sotto dei 400 nanometri di diametro.

Tra questi tre domini proteici, IDR FBP17 fornisce la più alta nano barra e densità, indicando la sua più forte capacità di rilevamento della curvatura, mentre F-Bar mostra il valore più basso. La curva di legame proteico può essere tracciata aumentando gradualmente la concentrazione proteica che mostra che IDR FBP17 ha una forte capacità di rilevamento della curvatura cooperativa. Rispetto al rapido recupero dei segnali lipidici sui nanobar, l'F-Bar non può recuperare entro due minuti, suggerendo la sua mobilità di membrana significativamente ridotta e la dinamica di associazione nei siti curvi della membrana.

Sorprendentemente, a differenza del comportamento di F-Bar, i segnali IDR FBP17 hanno mostrato un evidente recupero nello stesso lasso di tempo, indicando la natura dinamica di IDR FBP17 accumulata sulle membrane curve. Tuttavia, dopo aver lavato via l'IDR FBP17 non legato nella soluzione, non è stato possibile osservare lo stesso recupero nel canale IDR FBP17 di prima. La qualità SLB è molto importante quando si studia l'interazione tra membrana curva e proteina.

Quindi il test FRAP è necessario nel nostro esperimento per convalidare la mobilità della membrana. Questo sistema aiuterà i ricercatori a studiare vari parametri che influenzano l'interazione proteica con la membrana curva, come i domini di rilevamento della curvatura e la composizione lipidica, nonché a condurre studi dinamici sulla membrana curva come i comportamenti di separazione facciale.