Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi
6 ottobre 2022
Il presente protocollo dimostra l'uso di un saggio di amplificazione esponenziale veloce, a 3 stadi, basato su aptamero per rilevare bersagli. La preparazione del campione, l'amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore sono coperti per implementare questo sistema per riconoscere la presenza di teofillina rispetto a quella della caffeina.
Questo metodo offre un modo per amplificare il segnale dagli eventi di legame in una forma che è rilevabile visivamente per un basso utilizzo delle risorse o può essere quantificata utilizzando strumentazione basata sull'assorbanza. Questo è un protocollo relativamente veloce, one-pot, per determinare la presenza del bersaglio dell'aptamero in un campione di interesse. I risultati possono essere confrontati con una curva di taratura standard se si desidera quantificarla.
Gli individui devono essere molto precisi durante il trasferimento e la miscelazione delle soluzioni, poiché una miscelazione insufficiente porterà a risultati negativi. Inoltre, assicurarsi che i reagenti e le soluzioni siano mantenuti refrigerati fino all'uso per ridurre al minimo il segnale di fondo. Inizia attivando i prodotti di scissione del ribozima aggiungendo cinque unità di polinucleotide chinasi T4 in una provetta PCR.
Quindi, aggiungere un microlitro di tampone ribozima 5X pre-preparato a ciascuna provetta del campione. Per dimostrare visivamente la specificità, aggiungere 1,5 microlitri di due teofillina millimolare o due caffeina millimolare a ciascuna provetta come campioni di prova e mescolare accuratamente ciascun campione pipettando da cinque a 10 volte. Quindi, aggiungere due microlitri di RNA nanomolare 600 contenenti un dominio aptamerico specifico per bersaglio a ciascuna provetta del campione, seguita dal pipettaggio per mescolare rapidamente i componenti.
Ora, posiziona il tubo su un blocco freddo per ridurre al minimo il segnale di fondo. Dopo aver preparato tutte le provette di reazione, incubare ogni campione a temperatura ambiente per esattamente tre minuti. Al termine dell'incubazione, riportare immediatamente le provette a ghiaccio per il campione.
Aggiungere 3,5 microlitri di miscela enzimatica nicase polimerasi a ciascuna provetta e mescolare bene. Quindi, aggiungere 31,5 microlitri di miscela di reazione EXPAR contenente nucleotidi modello e tampone di reazione a ciascuna provetta e miscelare mediante pipettaggio. Una volta preparati tutti i campioni, incubare il campione preparato a 55 gradi Celsius per cinque minuti utilizzando un timer.
Riportare immediatamente le provette nel ghiaccio dopo l'incubazione. Aggiungere due microlitri di soluzione di emina a ciascuna provetta per lo sviluppo del colore e mescolare bene. Quindi, aggiungere 58 microlitri della soluzione TMB disponibile in commercio a ciascuna provetta di campionamento, mescolare bene e incubare per lo sviluppo del colore.
Leggere i campioni qualitativamente ad occhio o quantificare i risultati utilizzando un lettore di piastre di assorbanza, come descritto nel manoscritto. Il costrutto ottimizzato potrebbe riconoscere un minimo di 500 teofillina nanomolare in 30 minuti. I preparati campione esposti al bersaglio producono un colore blu, mentre i campioni che non contengono alcun bersaglio rimangono incolori.
Una curva standard è stata preparata dal segnale misurato a A450 dopo 30 minuti di sviluppo del colore. È importante mantenere i campioni sul ghiaccio quando non si eseguono incubazioni, poiché anche l'RNA ottimizzato mostrerà comunque un basso livello di attività di fondo.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra un saggio di amplificazione esponenziale rapido, in 3 fasi, basato su aptameri per la rilevazione di bersagli come la teofillina. Copre la preparazione del campione, l'amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Chimica analitica
- Biotecnologia
Sfondo
- Gli aptameri sono brevi molecole di RNA o DNA a singolo filamento che possono legarsi a bersagli specifici.
- L'amplificazione del segnale è cruciale per la rilevazione di bersagli a bassa abbondanza.
- I metodi di rilevazione visiva possono essere vantaggiosi per ambienti con scarse risorse.
- La gestione precisa dei reagenti è essenziale per risultati accurati.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido per rilevare la teofillina rispetto alla caffeina.
- Fornire un protocollo one-pot per l'amplificazione del segnale.
- Consentire la quantificazione dei risultati utilizzando una curva di calibrazione.
Metodi utilizzati
- Ativazione dei prodotti di clivaggio dei ribosimi con T4 polinucleotide chinasi.
- Rilevazione visiva degli eventi di legame.
- Quantificazione utilizzando strumentazione basata sull'assorbanza.
- Miscuglio attento e raffreddamento dei reagenti per minimizzare il segnale di fondo.
Principali risultati
- Il metodo consente la rilevazione di teofillina nei campioni.
- I risultati possono essere interpretati visivamente o quantificati.
- La precisione nella gestione della soluzione è fondamentale per risultati di successo.
- I segnali di fondo possono essere minimizzati con una corretta gestione dei reagenti.
Conclusioni
- Il saggio basato su aptameri è un metodo rapido ed efficace per la rilevazione del bersaglio.
- Può essere adattato per varie applicazioni in ambienti a scarse risorse.
- Studi futuri potrebbero esplorare ulteriori bersagli e l'ottimizzazione del protocollo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Aptamer-based detection systems with isothermal exponential amplification offer rapid, sensitive, and visually interpretable outputs for target validation in early discovery workflows. This three-stage G-quadruplex amplification protocol enables both qualitative and quantitative readouts, supporting robust decision-making at the assay development and screening inflection points. The approach enhances predictive confidence for target engagement and specificity, directly impacting portfolio triage and downstream assay readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular recognition events using aptamer specificity.
- Supports functional validation of target binding through visually detectable outputs.
- Facilitates rapid assessment of target engagement for mechanistic de-risking.
- Improves confidence in target selectivity by distinguishing closely related analytes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, one-pot protocol for reproducible assay setup.
- Delivers quantitative outputs via absorbance measurement for reliable compound evaluation.
- Enables rapid screening of samples with minimal instrumentation requirements.
- Supports calibration curve-based quantification for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Offers potential for adaptation to disease-relevant biomarkers when supported by aptamer design.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through scalable detection formats.
- Reduces risk of false positives by minimizing background signal with optimized protocols.
Pipeline & Workflow Integration
This aptamer-EXPAR system fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge from molecular recognition to quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming target presence and specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput or resource-limited settings.
- Analytics: Enables absorbance-based measurement and standard curve generation for comparative analysis.
- Translational Research: Can be adapted for biomarker detection if aptamer specificity is established.
- Enterprise Reuse: Protocol modularity allows adaptation to new targets by substituting aptamer domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with a rapid, standardized, and scalable protocol.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient assay development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative detection data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer design and nucleic acid handling.
- Needs access to basic molecular biology instrumentation and absorbance plate readers for quantification.
- Demands precise reagent handling and temperature control to minimize background signal.
- Protocol can be adapted to different targets by modifying the aptameric domain.
- Careful optimization is necessary to ensure specificity and minimize false positives.
