Quantificazione e analisi basate sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche

La letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B miocardiche. Ciò deriva probabilmente dalla variabilità nelle tecniche di perfusione e digestione. Il nostro protocollo consente l'analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso sulle cellule B del miocardio.

Questa tecnica massimizza la resa di recupero delle cellule B e riduce la variabilità nella conta della citometria a flusso tra le cellule B e altre popolazioni da campioni cardiaci. Questo metodo di digestione e isolamento ottimizzato può essere facilmente modificato per implementare un pannello anticorpale esteso per studiare diversi tipi di cellule immunitarie nel cuore. Il protocollo può anche essere applicato ad altri organi, come il polmone o il fegato, per studiare le cellule B associate a tali organi.

Per iniziare, pesa un topo maschio di 12 settimane. Caricare una siringa da insulina da 310 cc con 100 microlitri della soluzione anticorpale B220. Iniettare l'anticorpo B220 diluito mediante iniezione retroorbitale e procedere prontamente al prelievo di organi e alla perfusione.

Dopo l'eutanasia, tenere la pelle del topo con una pinza nella zona epigastrica. Fai un'apertura di due millimetri nella pelle usando le forbici e usa la pinza per staccare la pelle per rivelare lo strato di fascia. Tagliare all'epigastrio attraverso la fascia e il peritoneo.

Bloccare il processo xifoideo usando una pinza emostatica. Fare un taglio verticale attraverso la parete toracica a livello della linea medioclavicolare su ciascun lato e sollevare la parete toracica anteriore per rivelare il contenuto del mediastino. Tenere saldamente l'aorta da dietro usando una pinza.

Introdurre l'ago della siringa nell'apice del cuore. Perfuso con tre millilitri di HBSS ad una velocità di tre millilitri al minuto. Tagliare l'aorta e rimuovere il cuore.

Lavare il cuore nella capsula di Petri con HBSS. Pesare il cuore isolato e annotare il peso in milligrammi. Tritare il cuore a temperatura ambiente in piccoli pezzi con una lama.

I pezzi di cuore dovrebbero avere una dimensione di circa 1,5 millimetri. Misurare la massa del tessuto cardiaco utilizzando una bilancia e posizionare 60 milligrammi di cuore tritato da digerire in un tubo da 15 millilitri su ghiaccio con tre millilitri di HBSS. Ripetere questo processo per un topo che non ha ricevuto l'iniezione di anticorpi B220 e posizionarlo nel tubo con tre millilitri di tessuto di controllo di riferimento marcato con HBSS.

Aggiungere enzimi a ciascun tubo contenente tessuti tritati. Aggiungere 0,5 microlitri per milligrammi di DNasi I, uno 0,5 microlitri per milligrammo di collagenasi II e 0,2 microlitri per milligrammo di ialuronidasi. Posizionare la reazione di digestione nello shaker per 30 minuti a 300 rotazioni al minuto.

I tubi sono posizionati nello shaker con una piccola angolazione, circa 25 gradi di inclinazione. Aggiungere sette millilitri di HBSS a ciascuna delle provette di reazione da 15 millilitri e centrifugare a 250 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver travasato il surnatante, risospendere ogni pellet in cinque millilitri di tampone di lisi ACK.

Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto 10 millilitri di PBS a ciascun tubo, mescolare e filtrare in un tubo da 50 millilitri con un filtro da 40 micrometri. Distruggere eventuali detriti sul filtro con uno stantuffo della siringa per assicurarsi che tutto il materiale passi attraverso il filtro.

Dopo aver aggiunto PBS attraverso il filtro fino a quando il volume raggiunge 25 millilitri per cuore, aggiungere altri 25 millilitri di PBS al tubo tissutale di controllo di riferimento e dividere il volume in due tubi diversi. Etichettare uno dei tubi non macchiato e l'altro vivo / morto. Dopo aver centrifugato a 250 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, decantare il surnatante e risospendere il tubo non colorato in 100 microlitri di PBS e ciascuno degli altri pellet in 100 microlitri della soluzione di colorazione viva / morta.

Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Dopo aver aggiunto 500 microlitri di tampone FACS a ciascun campione, trasferirlo in un tubo FACS attraverso un filtro da 40 micrometri. Dopo aver rifiutato i tubi FACS a 250 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone FACS.

Aggiungere 50 microlitri di soluzione bloccante FC a ciascun tubo, ad eccezione dei tubi non colorati e vivi / morti. Mescolare e incubare per cinque minuti. Dopo aver aggiunto 50 microlitri di soluzione di miscela anticorpale a ciascun tubo, ad eccezione dei tubi non colorati e vivi / morti, incubare per 30 minuti al buio, coprendo il secchiello del ghiaccio con un foglio di alluminio.

Come per la macchia viva / morta, lavare nuovamente con 500 microlitri di tampone FACS e risospendere in 300-500 microlitri di tampone FACS. Aprire il software di controllo dello strumento. Nella parte superiore della finestra, seleziona la scheda Acquisizione e fai clic su Nuovo.

Nella sezione libreria, nel campo Tipo da filtrare, digitare PE, PerCP-Cy5.5, viola brillante 421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, selezionando il fluoro-4 e facendo clic su Aggiungi dopo aver digitato ciascuno. Quindi, fare clic su Avanti per passare alla scheda Gruppi. Ora fai clic sul simbolo con un tubo per aggiungere il cuore per l'analisi.

Fare clic sul gruppo di riferimento e verrà visualizzata una finestra. Nella colonna dei tag fluorescenti, seleziona Zombie Aqua come tag fluorescente, eliminando tutti gli altri facendo clic sull'icona rossa del cestino accanto a ciascuno. Quindi, nell'icona Tipo di controllo, selezionare Celle.

Quindi, fai clic su Salva. Fare clic su Avanti. Quindi, fare clic sulla scheda Marcatori.

Verrà visualizzata una tabella. Digitare l'indicatore di cella corrispondente nella prima riga di ogni colonna fluoro-4 e premere Invio. Fare clic su Avanti due volte per passare alla scheda Acquisizione.

In Events To Record dei campioni sperimentali, tipo 10 milioni, e nello stesso campo per la linea del gruppo di riferimento, tipo 200, 000. Fai clic su Salva e apri. In basso a sinistra, fai clic su Controllo strumento.

Impostare la tensione su FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selezionare il controllo acquisizione. Per l'opzione portata, selezionare Alta dal menu a discesa.

Vortice il tubo cardiaco non colorato e posizionarlo saldamente sulla porta di iniezione del campione. Assicurarsi che la freccia dell'indicatore verde punti al campione corretto. Quindi, fai clic su Registra e attendi fino a quando gli eventi non vengono registrati.

Fai lo stesso per il tessuto cardiaco macchiato vivo / morto. Selezionare il menu Unmix e impostare i controlli. Selezionare la casella di controllo Autofluorescenza come tag fluorescente.

Quindi, fare clic su Avanti per passare alla scheda Identifica popolazioni positive/negative. In questa scheda, verrà visualizzato un grafico dell'area di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione laterale. Fare clic e trascinare i punti del poligono per selezionare un'area compresa tra 1 e 4 milioni sull'asse dell'area di dispersione diretta e tra 0,2 e 3 milioni sull'asse dell'area di dispersione laterale.

Nel grafico successivo a destra, V5-A verrà visualizzato sull'asse X. Sposta le porte per selezionare metà del picco all'estrema destra come positivo e una regione sul lato sinistro del grafico come negativo. Nel grafico intitolato Gruppo di riferimento-Non macchiato, selezionare una popolazione in un intervallo simile.

Per i non macchiati, non deve essere selezionato alcun positivo/negativo. Fate clic sul pulsante Live Unmixing (Live Unmixing). Ora acquisisci i campioni sperimentali, vortice il tubo e posizionalo saldamente sul SIP.

Assicurarsi che la freccia dell'indicatore verde punti al campione corretto. Quindi, fare clic su Registra nel pannello Controllo acquisizione del software del citometro e attendere fino a quando gli eventi non vengono registrati. Selezionare la scheda Foglio di lavoro non misto predefinito.

Create un grafico FCS-A rispetto a SSC-A utilizzando lo strumento di mappatura dei punti in alto. Selezionare eventi superiori a 0,4 milioni sull'asse FSC-A e superiori a 0,8 milioni sull'asse SSC-A utilizzando lo strumento di selezione dei poligoni. Create un nuovo plottaggio facendo doppio clic sulla selezione e, in questo nuovo plottaggio, fate clic con il pulsante destro del mouse sull'etichetta dell'asse Y e selezionate la macchia viva o morta.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'etichetta dell'asse X e selezionare Autofluorescenza A.Selezionare tutti gli eventi inferiori a 10 e quinti sull'asse vivi/morti. Queste sono le cellule viventi. Fare doppio clic su questa selezione.

Nel nuovo plottaggio, selezionate PerCP-Cy5.5A per l'asse X e SSC-A per l'asse Y. Selezionare le popolazioni sul lato destro del PerCP-Cy5.5A. Queste sono le cellule immunitarie.

Fare doppio clic sulla selezione. Nel nuovo plottaggio, selezionate FSC-A per l'asse X e Altezza dispersione diretta per l'asse Y. Selezionare gli eventi che seguono una tendenza in cui il valore FSC-A e il valore SSC-A sono uguali.

Questo seleziona singole celle ed elimina doppietti. Fare doppio clic su questa selezione per visualizzare un nuovo grafico nella popolazione monocellulare CD45-positiva. Dal grafico della popolazione monocellulare CD45-positiva, selezionare il viola brillante 421 sull'asse X rispetto a SSC-A sull'asse Y.

Selezionate la popolazione a destra sull'asse 421 viola brillante. Questa è la popolazione di cellule B. Fare doppio clic due volte in questa popolazione per creare due nuovi grafici con la popolazione di cellule B.

Impostare il primo grafico a celle B con PEA sull'asse X e 421A viola brillante sull'asse Y. La popolazione a destra corrisponde alle cellule B intervascolari e la popolazione a sinistra rappresenta le cellule B interstiziali. Selezionare entrambi.

Configura il secondo plottaggio delle celle B con Alexa Fluor 700A sull'asse X e SSC-A sull'asse Y. La popolazione a sinistra corrisponde alle cellule CD11b-negative, e gli eventi a destra corrispondono alle cellule CD11b-positive. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuna sezione e quindi fare clic su Proprietà gate.

Fare clic su Conteggio e genitore per visualizzare il numero di eventi e le percentuali delle popolazioni genitore. Registrare il numero di eventi e le percentuali per ulteriori analisi dei dati. Dopo la rimozione delle doppiette in un cuore ingenuo non ferito, si prevede che circa il 20% delle cellule CD45-positive saranno cellule B CD19-positive.

Di queste cellule, in media, il 5,5% si trova nello spazio interstiziale. Il 94,5% si trova nello spazio intravascolare. Dell'intera popolazione di cellule B presenti nel cuore, solo circa l'1,6% corrisponde alle cellule B1 in base al marcatore di superficie CD11b e l'altro 98,4% corrisponde alle cellule B2.

Quando si analizzano le cellule B del miocardio tramite citometria a flusso, è fondamentale perfondere e tritare correttamente il cuore seguendo il protocollo. Una corretta filtrazione del cuore digerito è anche essenziale per massimizzare il recupero delle cellule immunitarie.