Misurazioni simili al potenziale d'azione indotte dal laser di cardiomiociti su array di microelettrodi per una maggiore predittività della farmacologia di sicurezza

Questo metodo consente di registrare potenziali d'azione intracellulari simili su MEA tradizionali, consentendo così una migliore descrizione della forma AP e una classificazione più sensibile dei potenziali pro-aritmici. Rispetto alle tipiche registrazioni del potenziale di campo, la forma potenziale effettiva intracellulare fornisce maggiori informazioni sull'autorizzazione precisa dei canali ionici sottostanti. Se applicato a cardiomiociti derivati da pazienti clinici attraverso la tecnologia delle cellule staminali, il metodo può contribuire alla diagnosi causale e alla personalizzazione di C R P e malattie cardiache come le aritmie Il nostro tecnico, Karin Gebhardt dimostrerà la coltivazione dei cardiomiociti.

Per iniziare a rivestire i campi di elettrodi dei MEA precedentemente autoclavati, Dropwise con fibronectina utilizzando una pipetta da 10 microlitri sotto la cappa a flusso laminare. Per ridurre lo shock osmotico, trasferire la soluzione galvanica a goccia per 90 secondi nel tubo da 50 millilitri contenente cardiomiociti scongelati. Aggiungere delicatamente otto millilitri di mezzo di placcatura nel tubo e mescolare accuratamente la sospensione cellulare.

Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, rimuovere il surnatante, assicurandosi di non scartare il pellet e regolare il numero di celle alla concentrazione finale. Prima della sede della cella, rimuovere la soluzione di rivestimento applicata dall'area dell'elettrodo MEA utilizzando una pipetta da 10 microlitri. Per evitare l'essiccazione del rivestimento seminare immediatamente le cellule aggiungendo quattro microlitri di celle goccia sui campi degli elettrodi per entrambi, sei pozzetti MEA e un pozzetto M E A.Ora, lasciare che le celle aderiscano ai pozzetti per un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Sotto la cappa a flusso laminare, aggiungere 200 microlitri e un millilitro di terreno di placcatura sterile riscaldato a 37 gradi Celsius per sei pozzetti MEA e MEA a pozzetto singolo. Per le registrazioni MEA, posizionare il sistema MEA sopra il dispositivo con il supporto del chip MEA centrato sul foro dell'obiettivo. Quindi consentire al laser di concentrarsi sugli elettrodi posizionando la configurazione MEA, in modo che l'obiettivo sia direttamente sotto il foro del sistema MEA.

Per consentire alle cellule di riprendersi dal disturbo meccanico, trasferire il chip MEA con le cellule coltivate dall'incubatore alla configurazione MEA 15 minuti prima della registrazione. Quindi, pulire accuratamente i cuscinetti di contatto e i perni, utilizzando un tampone isopropanolo per ridurre i livelli di rumore. Posizionare attentamente il MEA nella configurazione MEA e posizionare il chip MEA a sei pozzetti con il numero di serie visibile sul lato destro o un singolo chip MEA con l'elettrodo di riferimento a sinistra.

Ora, impostare il riscaldamento integrato del sistema MEA a 38 gradi Celsius. Chiudere il coperchio del dispositivo poiché l'interruttore di sicurezza integrato consente di attivare il laser solo se il coperchio è chiuso sul chip MEA. Utilizzando il programma di configurazione MEA, impostare il filtro del sistema MEA passa-alto e passa-basso rispettivamente su 0,1 hertz o inferiore e 3.500 hertz.

Utilizzare il software rack MC o qualsiasi software alternativo per la registrazione. Regolare l'intervallo di input in base all'esperimento. Assicurarsi che il segnale non saturi l'amplificatore e la frequenza di campionamento.

Utilizzare la funzione di visualizzazione a lungo termine del software per controllare la registrazione. Dopo aver inserito il chip MEA nella configurazione MEA e aver impostato il software, inizializzare la meccanica laser utilizzando il software FB ALP. Ora, fai clic sul pulsante di inizializzazione.

Al termine dell'inizializzazione il punto laser virtuale sarà nel pozzo D per un MEA a sei pozzetti e in basso a sinistra per un singolo pozzo MEA rispettivamente. Quindi utilizzando il tasto di controllo con un clic del mouse, spostare il punto laser virtuale al centro dell'elettrodo D cinque e regolare la messa a fuoco tenendo premuto il tasto di controllo e scorrendo con la rotellina del mouse. In alternativa, utilizzare la funzione di messa a fuoco automatica.

Premere il pulsante impostato P uno, e il punto laser virtuale si sposterà automaticamente nel pozzo F.Il sistema è ora allineato. Regolare la potenza del laser e il tempo di processo in base ai requisiti sperimentali. Per abilitare il laser, fare clic sul pulsante laser off che apparirà come laser acceso, Passare al software di registrazione.

Scegli un nome file e fai clic sul pulsante rosso di registrazione seguito dal pulsante di riproduzione nella parte superiore della finestra per registrare la misurazione. Prima di aprire le celle con il laser registrare una linea di base per 60 secondi. Tornare al software di inizializzazione e disattivare gli elettrodi da escludere dal laser sulla mappa virtuale sul lato destro della finestra del software.

Per avviare il laser utilizzare Alt clic del mouse e selezionare l'elettrodo centrale di questo pozzo. Questo avvia il laser per aprire automaticamente le celle su ciascun elettrodo di questo pozzo, ripetere per ogni pozzetto per aprire tutti gli elettrodi precedentemente attivati di questo pozzo selezionato. Sciogliere la concentrazione millimolare di Nifedipina E-40 31 e Dofetilide prima nel DMSO e poi in mezzo completo fino a 10 volte la concentrazione desiderata.

Non superare mai una concentrazione finale di DMSO dello 0,1% nel pozzetto. Registrare l'attività di base per 60 secondi. Avviare la perazione indotta dal laser come dimostrato in precedenza, con conseguente trasformazione degli FPS in liAP.

Applicare tutti i farmaci come singola concentrazione per pozzetto. Rimuovere 20 microlitri e 100 microlitri di mezzo per pozzetto rispettivamente da sei pozzetti e MEA a pozzetto singolo. Aggiungere 20 microlitri o 100 microlitri della soluzione madre di farmaco da misurare nel pozzetto.

A seconda del tipo di MEA, e pipetta attentamente su e giù due o tre volte. Lasciare lavare i composti per 300 secondi. Durante questo periodo, la forma liAP può trasformarsi nella forma FP.

Ancora una volta, la perazione indotta dal laser indotta e registra eventuali difetti indotti dal composto sul liAP per altri 60 secondi. L'aggiunta di nifedipina ha ridotto la fase di plateau dei liAP in modo dipendente dalla concentrazione, e quindi ha accorciato l'intero liAP. Questo accorciamento era paragonabile ai potenziali di campo dei cardiomiociti da elettrodi non manipolati.

E-40 31 ha inibito la ripolarizzazione dei canali del potassio rilevanti KV one point 11 e ha portato al comportamento aritmico dei cardiomiociti a concentrazioni aumentate. Inoltre, E-40 31 ha aumentato la durata del liAP in modo dipendente dalla concentrazione. Alla fine del liAP sono state osservate piccole deflessioni di tensione positive a 0,1 micromolari che sono diventate più evidenti con concentrazioni più elevate, indicando una nuova depolarizzazione transitoria chiamata EAD.

Alla massima concentrazione di 0,1 micromolari, questi EAD si sono intensificati nel tempo in battiti ectopici. Che sono potenziali d'azione prematuri. EAD e battiti ectopici sono indicatori chiave dell'attività pro aritmica.

E alla fine, l'attività elettrica si traduce in battiti aritmici. Le relazioni di risposta alla concentrazione erano correlate con le registrazioni FP e liAP. Inoltre, in presenza di dofetilide, sia FP che liAP mostravano durate di circa due secondi all'interno dello stesso pozzo, la forma d'onda FP presentava regolari deflessioni di ripolarizzazione.

Mentre nel liAP gli EAD sono rilevabili. È importante regolare la messa a fuoco prima di ogni melomen poiché un'immagine al microscopio fuori fuoco potrebbe influenzare l'apertura delle cellule. Inoltre, il potenziale d'azione viene preso poco dopo che l'opterperazione dovrebbe essere utilizzata per l'analisi.

Questa tecnica è più sensibile nel rilevare precedenti effetti aritmici rispetto al MEA standard, consentendo con maggiore precisione la rilevazione di effetti avversi composti.