Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Questo protocollo fornisce un metodo di soluzione rapido e specifico per le dimensioni di piccole vescicole extracellulari ottimizzando i parametri di ordinamento della citometria a flusso. Queste ottimizzazioni forniscono un pannello di impostazioni di ordinamento critiche che consente di ottenere popolazioni rappresentative di piccole vescicole extracellulari utilizzando solo la dispersione diretta rispetto alla dispersione dimensionale. Iniziare eseguendo la procedura di avvio standard dello smistatore di celle di flusso.

Accendere la macchina premendo il pulsante di avvio, quindi fare clic sul pulsante di accensione laser sul pannello di controllo laser. Premere il pulsante di cambio serbatoi nel sottomenu Smart Sampler per pressurizzare la fluidica. Utilizzare un getto da 50 micrometri pulito ad ultrasuoni e un ugello dell'aria e installarlo nel gruppo ugello.

Regolare la pressione a 80 SI per il fluido della guaina e 80,3 SI per il flusso del campione sulla console di pressione. Premere il pulsante di avvio del flusso della guaina per avviare il flusso della guaina. Fare clic sul pulsante a bolla nel sottomenu Campionatore avanzato per disattivare automaticamente per 10 minuti, quindi disattivarlo.

Per allineare il flusso e determinare il punto laser, accendere la luce della camera di illuminazione per visualizzare il flusso sopra i fori di spillo. Regola i micrometri su e giù, sinistra e destra e anteriore e posteriore per centrare il flusso sul foro stenopeico e focalizzare il flusso. Aprire tutti gli otturatori laser, selezionare la scheda di intercettazione laser e flusso, quindi premere continuamente il pulsante freccia verde come richiesto per completare il processo di calibrazione dell'intercettazione laser e dell'allineamento degli ugelli.

Accedi allo schermo di allineamento laser fine. Selezionare il laser a 640 nanometri e il canale passa banda 44 a 772 bar come parametro dell'asse x e il laser a 405 nanometri e il canale passa-banda a 448 bar 59 come parametro dell'asse y. Premere il selettore del parametro trigger e scegliere il parametro di diffusione diretta del laser a 488 nanometri.

Quindi, diluire le particelle fluorescenti arcobaleno aggiungendo una goccia in un millilitro di acqua doppia distillata a una concentrazione finale di una volta 10 alla sesta perla per millilitro. Aprire lo sportello della camera di campionamento e caricare un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno preparate. Premere il pulsante di avvio del campione e regolare i micrometri su e giù per ottimizzare l'intensità della fluorescenza, rendendo ogni segnale il più intenso possibile.

Premere il pulsante Start Quality Control o QC sul pannello di controllo touchscreen per eseguire automaticamente il controllo qualità. Quindi premere il pulsante di inizializzazione IntelliSort. Lo strumento regola automaticamente la frequenza e l'ampiezza dell'oscillazione delle goccioline per ottenere il ritardo di caduta di circa 25 ed essere in grado di visualizzare chiaramente il punto di interruzione della goccia.

Quindi, premere il pulsante di ritardo di rilascio e il pulsante di manutenzione. Selezionate tubo come tipo di output di ordinamento. Posizionare un portatubo da 15 millilitri nella camera di smistamento.

Accendere la tensione della piastra e impostare la tensione della piastra su circa 4.000 volt. Quindi, attiva il modello di test selezionando il pulsante di impostazione del flusso. Regolare il cursore della fase di carica e il cursore di deflessione per assicurarsi che l'immagine del flusso sia in linea con il tubo di raccolta.

Quindi selezionare il pulsante con il segno di spunta. Accedere alla workstation Summit sul computer. Creare un nuovo protocollo dal menu principale del file.

Quindi creare un dot plot selezionando la scheda istogramma nel pannello di controllo Summit Software. Scegliete Dispersione diretta come parametro dell'asse X e Dispersione laterale come parametro dell'asse y. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'asse del nuovo grafico a punti nel workspace e presentare la dispersione diretta e la dispersione laterale nella forma logaritmica.

Selezionare la scheda di acquisizione e individuare il pannello dei parametri di acquisizione. Abilita tutti i segnali nel sottomenu dei parametri di abilitazione. Scegliete la dispersione diretta come parametro di attivazione e impostate la soglia di 0,01.

Regolare la tensione e il guadagno dello scatter in avanti e dello scatter laterale a 250 e 0,6 per garantire che gli eventi all'interno del grafico a dispersione diretta rispetto al grafico a dispersione laterale e le popolazioni siano separati. Diluire le microsfere fluorescenti in polistirene in sospensioni da 100, 200 e 300 nanometri aggiungendo un microlitro di microsfere a un millilitro di acqua bidistillata. Quindi caricare successivamente la sospensione della microsfera.

Selezionare Start nel menu di acquisizione di Summit Software per registrare 20.000 eventi, quindi fare clic su Stop dopo aver registrato gli eventi. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico a punti a dispersione in avanti rispetto al grafico a dispersione laterale per creare rettangoli e trascinare per ridimensionare. Riposizionare le regioni di rumore elettronico e la popolazione di microsfere a 100 nanometri facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle regioni per rinominarle rispettivamente come R7 e R4.

Ripetere i passaggi per inquadrare le microsfere da 200 e 300 nanometri con rettangoli successivamente e rinominarle rispettivamente come R5 e R6. Infine, determinare la regione di ordinamento da 50 a 200 nanometri in base al rumore elettronico e alla posizione delle particelle di 200 nanometri per definirla come R8. Modificare le decisioni di ordinamento nel pannello Logica di ordinamento e statistiche facendo doppio clic sul campo vuoto del flusso sinistro o L1 e selezionando la regione denominata R8 per creare la logica di ordinamento. Scegliete la modalità di interruzione della purezza e selezionate un inviluppo di gocce sopra una goccia per il flusso L1.

Caricare un campione da 500 microlitri di vescicole extracellulari precedentemente preparate o miscela EV. Premere il pulsante Start sotto il menu di acquisizione in Summit per acquisire i dati, quindi fare clic su Stop. Quindi, premere Start nel menu di ordinamento per raccogliere da 50 a 200 piccole vescicole extracellulari di dimensioni nanometriche o sEV in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

L'analisi della citometria a flusso di microsfere di polistirene di dimensioni standard per localizzare l'intervallo di dimensioni da 50 a 200 nanometri nel grafico a dispersione diretta rispetto al grafico a dispersione laterale ha rivelato segnali di particelle distinguibili. R4, R5 e R6 si riferiscono rispettivamente alle posizioni di particelle da 100, 200 e 300 nanometri. R7 è il rumore elettronico come limite di rilevamento per particelle a 50 nanometri e R8 rappresenta l'intervallo di posizione da 50 a 200 nanometri.

La distribuzione delle dimensioni delle particelle della miscela EV derivata da cellule pancreatiche mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o NTA, era nell'ampio intervallo da 40 a 400 nanometri dopo l'ultracentrifugazione. La selezione citometrica a flusso è stata eseguita per isolare e purificare il sEV da 50 a 200 nanometri all'interno della regione R8. La qualità dell'isolamento è stata verificata da NTA e si è scoperto che l'intervallo di dimensioni delle particelle di sEV dopo la selezione era compreso tra 50 e 200 nanometri.

La presenza di sEV è stata ulteriormente osservata da TEM e i sEV isolati sono stati confermati contenere marcatori di CD6, CD63 e CD81 mediante Western Blot Analysis. Questo metodo consente la separazione di piccole vescicole extracellulari e la classificazione o l'analisi temporanea dell'espressione genica di piccole vescicole extracellulari, aprendo numerose applicazioni di ricerca a valle.