Determinazione della cinetica di accensione in vitro e cellulare per aptameri di RNA fluorogenici
9 agosto 2022
Il protocollo presenta due metodi per determinare la cinetica degli aptameri fluorogenici dell'RNA Spinaci2 e Broccoli. Il primo metodo descrive come misurare la cinetica dell'aptamero fluorogenico in vitro con un lettore di piastre, mentre il secondo metodo descrive in dettaglio la misurazione della cinetica dell'aptamero fluorogenico nelle cellule mediante citometria a flusso.
Lo studio in vitro e della cinetica dell'aptamero fluorogenico cellulare consente all'utente di valutare se le interazioni del colorante aptamero sono abbastanza veloci da studiare un processo di interesse in tempo reale. Le tecniche presentate consentono misure cinetiche quantitative sia all'interno che all'esterno della cellula, ognuna delle quali potrebbe essere rilevante a seconda dell'applicazione dell'aptamero. I metodi presentati possono essere applicati a qualsiasi sistema di RNA fluorogenico, inclusi aptameri alternativi e biosensori basati su RNA per piccole molecole.
Per iniziare, impostare il programma di rinaturazione dell'RNA dal termociclatore. Creare il programma selezionando crea nuovo programma"aggiungi nuova fase"e aggiungi nuovo passaggio"più volte per aggiungere passaggi specifici della temperatura prima di premere salva"Regola le impostazioni aggiuntive in base al programma. Per rinaturare gli RNA di spinaci due e broccoli, preparare due gambi micromolari di ciascun RNA in acqua doppia distillata in un tubo PCR a parete sottile da 0,5 millilitri.
Quindi aggiungere volumi uguali di tampone di rinaturazione a due x per creare una soluzione di RNA micromolare. Inserire i tubi nel termociclatore. Aprire il programma di rinaturazione salvato e premere Esegui"Quindi, impostare il programma iniettore lettore di piastre.
Sul lettore di piastre a fluorescenza, selezionare la temperatura "e impostarla su 37 gradi Celsius. Prima di iniziare la cinetica, assicurarsi che la temperatura sia equilibrata a questo valore. Aprire il software del lettore di piastre.
Selezionare impostazioni"quindi vista acquisizione" per inserire il programma per le misure cinetiche, selezionare loop" per ciascun pozzetto. Quindi, impostare l'impostazione di base su 60 letture di base e le impostazioni di iniezione intelligente per l'iniezione da 10 microlitri. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione della fluorescenza su 448 nanometri, la lunghezza d'onda di emissione su 506 nanometri e la cartuccia su mono.
Impostare il tempo di lettura totale su 10 minuti con intervallo di lettura di 0,5 secondi. Impostare PMT e ottica su sei flash per lettura. Quindi ciclo di input al pozzo successivo.
Per preparare l'iniettore lettore di piastre, selezionare iniettare sul lettore di piastre e fornire una piastra di raccolta dei rifiuti quando indicato. Quindi selezionare "wash" e pulire il tubo di iniezione seguendo le istruzioni sul lettore di piastre con volumi di un millilitro di acqua doppia distillata, etanolo al 75% e quindi acqua distillata. Quindi selezionare aspirare"consentendo all'iniettore di espellere il liquido in eccesso.
Quindi selezionare prime"per innescare l'iniettore con due 260 microlitri di 100 micromolari D F H B I.To eseguire un esperimento di cinetica aggiungere 80 microlitri di miscela master tampone legante a un pozzetto di una piastra inferiore trasparente da 96 pozzetti. Quindi aggiungere 10 microlitri di RNA rinaturato. Lasciare che la piastra e la soluzione D F H B I nell'iniettore si equilibrino a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Quindi, selezionare il pozzo da analizzare nelle impostazioni del software sotto l'area di lettura. Quindi, nella scheda Home, selezionare "esegui" per eseguire il programma cinetico descritto in precedenza. Ripetere questo processo fino al completamento di tutti gli esperimenti.
Dopo l'esecuzione, lavare l'iniettore per rimuovere la soluzione rimanente di D F H B I dal tubo di iniezione, come dimostrato in precedenza. Per impostare i file sperimentali accendere il citometro a flusso e il computer. Crea un nuovo file nella scheda Esplora esperimenti facendo clic con il pulsante destro del mouse sul citometro a flusso"nome utente.
Quindi selezionare nuovo esperimento"nella finestra a discesa e quando viene visualizzata una nuova finestra sullo schermo del computer, selezionare il tipo di esperimento come tubi"e quindi selezionare ok"Nel nuovo file dell'esperimento fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella del gruppo e selezionare aggiungi nuova provetta di esempio"Etichetta le provette per ogni punto temporale specifico e replicare facendo clic con il pulsante destro del mouse sul campione" e selezionando rinomina" nel menu a discesa. Quindi, preparare una soluzione cellulare diluita aggiungendo 1,5 millilitri di un X P B S e tre microlitri di cellule indotte in mezzi AI in una provetta di coltura. Prima di aggiungere il colorante, misurare la fluorescenza di fondo delle cellule per osservare la piega accendersi nel tempo.
Una volta aggiunto il colorante, posizionare la provetta di coltura contenente cellule in P B S nel sollevatore della provetta del campione e sollevare il sollevatore sull'ago per iniezione del campione. Quindi selezionare il file campione appropriato all'interno della scheda del pannello di raccolta e fare clic su registra "Una volta completata la corsa, abbassare il sollevatore del tubo di campionamento con il tubo di coltura a mano. Per avviare una fase di risciacquo, per lavare il sistema fluidico e ridurre al minimo il trascinamento tra ciascun campione biologico replicato.
Per passare all'esempio seguente, selezionare il file di esempio successivo facendo clic sull'icona della freccia destra accanto al nome del tubo di campionamento sotto l'icona del record. Per misurare la fluorescenza delle cellule con colorante aggiungere 1,4 microlitri di colorante concentrato in un X P B S con cellule, per ottenere una concentrazione finale di 50 micromolari D F H B I uno T.Chiudere il coperchio del tubo di coltura e capovolgere da tre a cinque volte per miscelare uniformemente la soluzione. Quindi, rimuovere il coperchio e posizionare il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione.
Dopo aver sollevato il supporto verso l'ago per iniezione del campione, fare clic sull'icona "record" sotto il file di campione appropriato. Quindi, iniziare un timer premendo start"In vitro cinetica degli aptameri fluorogenici spinaci due e broccoli, ha mostrato una cinetica di associazione bifase per il legame al colorante D F H B I. Per entrambi gli aptameri, i dati cinetici sono stati meglio adattati dall'associazione a due fasi rispetto a una fase a lunghi tempi di misurazione.
La curva di adattamento migliore ha determinato le costanti di velocità e i valori di emivita per le associazioni fast e slow. Gli spinaci due nello stato di competenza vincolante, hanno mostrato un'accensione più rapida rispetto ai broccoli. La cinetica della seconda fase per entrambi gli aptameri è simile e può corrispondere a una fase comune di limitazione della velocità.
Le curve cinetiche degli aptameri sono composte da un grado simile di RNA ad associazione rapida. Per le cellule che esprimono spinaci due T RNA, l'intensità media di fluorescenza o M F I aumenta immediatamente al punto di tempo zero. Inoltre, la fluorescenza cellulare ha raggiunto il suo massimo valore equilibrato di M F I entro cinque minuti.
Al contrario, le cellule di controllo hanno mostrato una bassa fluorescenza di fondo e nessun cambiamento nei valori di M F I con l'aggiunta di D M S O I metodi presentati consentono ai ricercatori di determinare come possono rendere più veloci i sensori basati sull'RNA negli aptameri fluorogenici.
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Panoramica
Questo protocollo descrive due metodi per determinare la cinetica delle aptameri per RNA fluorogeni Spinach2 e Broccoli. Il primo metodo utilizza un lettore di piastre per misurazioni in vitro, mentre il secondo impiega la citometria a flusso per misurazioni cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia molecolare
- Chimica biologica
Sfondo
- Gli aptameri a RNA fluorogenici sono utili per studi in tempo reale delle interazioni molecolari.
- Comprendere la cinetica degli aptameri è fondamentale per la loro applicazione in diversi processi biologici.
- I metodi possono essere adattati per diversi sistemi a RNA e biosensori.
- Le tecniche di misurazione includono ambienti in vitro e cellulari.
Scopo dello studio
- Valutare la cinetica di aptameri a RNA in tempo reale.
- Fornire metodologie applicabili a diversi sistemi a RNA fluorogeni.
- Facilitare misurazioni quantitative delle interazioni degli aptameri.
Metodi Utilizzati
- Misurazioni cinetiche in vitro mediante lettore di piastre.
- Misurazioni cinetiche cellulari mediante citometria a flusso.
- Impostazione del programma di rinaturazione dell'RNA in un termociclatore.
- Preparazione dei campioni di RNA in provette per PCR.
Risultati principali
- Misurazione con successo della cinetica degli aptameri in vitro e in cellule.
- Interazioni rapide tra aptamero e colorante dimostrate, adatte a studi in tempo reale.
- Metodi applicabili a vari biosensori basati su RNA.
- Dati quantitativi ottenuti per entrambe le configurazioni sperimentali.
Conclusioni
- I metodi presentati consentono uno studio efficace della cinetica degli aptameri a RNA.
- Sono possibili ed informative sia le misurazioni in vitro che quelle cellulari.
- Queste tecniche possono far progredire la ricerca nelle applicazioni basate su RNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La determinazione quantitativa della cinetica di attivazione di aptameri per RNA fluorogenici è fondamentale per consentire la visualizzazione in tempo reale dell'RNA e applicazioni di biosensori in sistemi cellulari vivi. Un profilo cinetico accurato garantisce che le interazioni tra aptamero e colorante siano sufficientemente rapide da supportare studi dinamici dell'espressione genica e del segnale dei metaboliti. Questa capacità influenza direttamente l'affidabilità predittiva e il valore traslazionale degli strumenti di scoperta basati sull'RNA lungo tutta la filiera biofarmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi della funzione dell'RNA e dell'attività delle vie metaboliche in cellule vive.
- Consente la riduzione del rischio biologico confermando che la risposta dell'aptamero sia allineata con le tempistiche sperimentali.
- Semplifica la validazione funzionale del bersaglio per biosensori e reporter basati sull'RNA.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce parametri cinetici validati per la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi.
- Permette lo sviluppo di saggi ad alto rendimento per composti mirati all'RNA.
- Fornisce output quantitativi essenziali per la valutazione e il confronto affidabili dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le prestazioni del biosensore a modelli cellulari pertinenti alla malattia per garantire continuità traslazionale.
- Permette lo sviluppo di strumenti basati su RNA con valutazione del rischio integrata nei flussi di lavoro preclinici.
- Migliora la previsione e riduzione del rischio quantificando la cinetica degli aptameri in contesti fisiologicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questi metodi di misurazione cinetica si integrano all'interfaccia tra scoperta precoce, sviluppo di saggi e ricerca traslazionale, fornendo una base per l'implementazione di strumenti basati sull'RNA di elevata robustezza.
- Biologia della Scoperta: Consente la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la quantificazione della dinamica dell'RNA in tempo reale.
- Screening: Stabilisce la prontezza e la riproducibilità del saggio attraverso parametri cinetici standardizzati.
- Analisi: Fornisce letture quantitative di fluorescenza e costanti cinetiche per analisi comparative.
- Ricerca Translazionale: Garantisce che la cinetica dei biosensori sia compatibile con i requisiti dei modelli preclinici.
- Riutilizzo Aziendale: Offre un flusso di lavoro ampiamente applicabile a diversi sistemi di RNA fluorogenici e biosensori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi mirati all'RNA.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati, riproducibili e scalabili per misurazioni cinetiche.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go e migliora l'efficienza del capitale nello sviluppo di strumenti per l'RNA.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di asset scoperti basati sull'RNA, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'analisi cinetica basata sulla fluorescenza e nella manipolazione dell'RNA.
- Richiede l'accesso a lettori di piastre dotati di iniettori e strumentazione per citometria a flusso.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di misurazione cinetica.
- È adattabile a diverse piattaforme di biosensori e aptameri per RNA fluorogenici.
- È limitato dalle velocità di diffusione e dalle caratteristiche di uptake cellulare di specifici coloranti e tipi cellulari.
