Affrontare i problemi pratici nella microindentazione basata sulla microscopia a forza atomica su espianti di cartilagine articolare umana

L'obiettivo di questo protocollo è stato quello di creare un modello in vitro per studiare le proprietà meccaniche della cartilagine articolare durante l'insorgenza e la progressione dell'osteoartrite. Il vantaggio principale della presente tecnica è che gli espianti di cartilagine sono facili da generare e altamente rappresentativi della cartilagine di età nativa. Questo modello può essere utilizzato per analizzare e monitorare vari approcci osteoartritici, diagnostici e terapeutici a livello biomeccanico.

Per iniziare, taglia la cartilagine dall'osso usando un bisturi. Utilizzando un punzone per biopsia, generare dischi di quattro millimetri di diametro. Posizionare il disco su un dispositivo di taglio personalizzato.

Usando una spatola, fissare e stabilizzare il disco cartilagineo. Tagliare il disco cartilagineo con una lametta da barba. Usando una spatola, raccogli il disco e mettilo in un tubo da 1,5 millilitri.

Per rimanere nei campioni di cartilagine, aggiungere 130 microlitri di colorante fluorescente permeabile alle cellule a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e distribuire il disco sulla piastra come un disco per pozzetto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra del microscopio a fluorescenza. Selezionare il filtro a fluorescenza appropriato e l'obiettivo.

Posizionare l'obiettivo sotto il pozzetto preselezionato contenente la cartilagine individuale. Concentrati sul disco per vedere il modello cellulare. Selezionare la funzione di navigazione per avere una panoramica dell'intero pozzo.

Utilizzate il pulsante sinistro del mouse e trascinatelo per spostarvi in una posizione diversa dello stage. Selezionare un quadrato che racchiuda l'area di interesse da scansionare. Seleziona l'opzione del punto della mappa di messa a fuoco del software, quindi seleziona ogni singola tessera facendo clic con il pulsante sinistro del mouse al centro di essa.

Selezionare l'opzione mappa di messa a fuoco nella finestra visualizzata con tutti i riquadri selezionati in precedenza. Fare doppio clic su un riquadro per visualizzarlo e metterlo a fuoco. Quindi, fare clic su imposta Z per salvare il piano focale e passare al riquadro successivo.

Dopo aver regolato il piano focale per ogni singola piastrella, iniziare l'acquisizione dell'immagine premendo Avvia scansione. Fissare ogni disco di cartilagine preselezionato contenente un modello cellulare in piastre di Petri aggiungendo una quantità sufficiente di colla biocompatibile sui lati superiore, inferiore, sinistro e destro del disco. Coprire i dischi con 2,5 millilitri di terreno Leibovitz senza L-glutammina.

Posizionare la capsula di Petri nel portacampioni dei dispositivi AFM. Per calibrare il cantilever AFM, posizionarlo sulla superficie del cantilever del mattone di vetro in modo che poggi sul piano ottico lucidato al centro del mattone di vetro. Abbassare il cantilever a passi di 100 micrometri utilizzando la funzione del motore passo-passo fino a quando non è completamente immerso nel fluido.

Per identificare il sito di misurazione della cartilagine desiderato, avviare un approccio scanner con il cantilever su un'area pulita e priva di campioni della capsula di Petri. Quindi ritrarre il cantilever a 1,5 millimetri di distanza dal fondo della piastra. Passa dalla visualizzazione in campo chiaro a quella a fluorescenza e identifica visivamente la parte superiore del disco.

Spostare il portacampioni AFM esattamente di due millimetri verso il centro del disco. Eseguire un approccio scanner per raggiungere la superficie del disco cartilagineo e ritrarre il cantilever di 100 micrometri. Per generare una curva di distanza di forza, concentrarsi sulle celle posizionate nel sito di misurazione desiderato.

Fare clic sul pulsante Esegui per avviare le misurazioni e acquisire cinque curve di distanza di forza su ciascun sito di misurazione. Salvate le curve una volta che sono state ispezionate. Per stimare i moduli di Young, utilizzando l'opzione Apri un batch di curve di spettroscopia, aprire le curve di distanza di forza generate da analizzare.

Selezionare il modello Hertz-fit seguito dall'opzione elasticity-fit. Quindi visualizzare e documentare il modulo di Young. Adattare utilizzando il rapporto di Poisson di 0,5 e il raggio di punta a sbalzo appropriato.

Quindi controllare visivamente l'adattamento della curva della distanza di forza per garantire la correttezza. Per la determinazione della profondità di indentazione, aprire ciascuna delle curve di distanza di forza generate nel software di analisi dei dati e selezionare il modello di adattamento Hertz come processo di analisi. Applicare l'opzione Sottrai offset linea base per azzerare l'asse di deflessione verticale e selezionare la funzione offset più inclinazione.

Utilizzare la funzione Trova punto di contatto per identificare automaticamente il punto di contatto. Utilizzando la funzione di posizione verticale della punta, sottrarre la distanza che tiene conto esclusivamente della deflessione a sbalzo dall'altezza piezoelettrica grezza durante l'indentazione. Selezionare l'opzione di adattamento dell'elasticità per visualizzare la curva della distanza di forza elaborata.

Quindi selezionare l'area del grafico in modo che sia allineata con il valore più negativo sull'asse di posizione della punta verticale. Nella scheda dei parametri della casella XMIN, leggere e documentare il rientro. I dischi contenenti corde singole hanno mostrato valori di rigidità più elevati con una mediana di 2,6 kilo pascal, che è rappresentativa di aree cartilaginee sane e non compromesse.

Con l'insorgenza e la progressione dell'osteoartrite, le misurazioni dell'AFM hanno mostrato una forte diminuzione graduale della rigidità del 42% nelle corde doppie, del 77% nei piccoli cluster e, infine, dell'88% negli stadi avanzati rappresentati da grandi cluster. I dischi contenenti un pattern diffuso si manifestano in elevata elasticità con un'importante variazione dei singoli valori del modulo di Young. Per tutti i dischi cartilaginei con un'organizzazione del pattern cellulare predominante assegnata, la profondità di indentazione associata al setpoint impiegato è risultata inversamente proporzionale alla rigidità.

Gli artefatti osservati nelle curve di distanza della forza generate sono indicativi di un contatto non ottimale tra il cantilever AFM e la superficie della cartilagine o di una fissazione impropria del campione alla piastra di Petri. I nostri espianti di cartilagine possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando una varietà di tecniche di biologia molecolare come l'analisi delle proteine tramite eliza, l'immuno marcatura, il western moding o l'analisi gen tramite PCR. Questo metodo può essere utilizzato per studiare l'impatto diretto di nuove terapie sul cartilegio articolare e può aiutare i ricercatori a ottenere importanti informazioni sui meccanismi del potoma dell'osteoartrite.