Name: Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando lespansione del codice genetico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Scopri l'espansione del codice genetico per marcare effettori secreti da Salmonella e visualizzarli in cellule HeLa tramite microscopia dSTORM. Questo metodo consente l'imaging a super-risoluzione delle interazioni patogeno-ospite.

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Questo lavoro è stato supportato da fondi di start-up della University of Texas Medical branch, Galveston, TX, e un premio Texas STAR a L.J.K. Ringraziamo il Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germania) per il plasmide pEVOL-PylRS-AF. Le immagini nella Figura 1 sono state create utilizzando BioRender.

<ol><li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li>
<li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li>
<li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interactions+with+host+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li>
<li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-injection+machines+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li>
<li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA%2FB+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li>
<li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116(2015).</li>
<li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell%2C+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311(2019).</li>
<li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335(2017).</li>
<li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li>
<li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li>
<li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789(2021).</li>
<li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050(2020).</li>
<li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li>
<li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12(2005).</li>
<li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li>
<li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li>
<li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li>
<li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li>
<li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SifA%2C+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium%2C+directs+Salmonella-induced+filament+%28Sif%29+formation+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li>
<li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+proteins%3A+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li>
<li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li>
<li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li>
<li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases%3A+status+for+the+year+2000%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292(2000).</li>
<li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins%3A+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single%2C+fixed+E.+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li>
<li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li>
<li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li>
<li>Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811(2020).</li>
<li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715(2021).</li>
<li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Communication+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261(2019).</li>
<li>Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314(2022).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l'infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell'ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile12,13,24</su...

Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell'ospite e stabilire infezioni 1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle cellule ospiti durante la patogenesi.
Un esempio tipico è Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che causa gastroenterite acuta. Salmonella Typhimurium utilizza sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) per iniettare una varietà di proteine effettrici direttamente nelle cellule ospiti. Non appena la Salmonella entra nella cellula ospite, risiede in un compartimento legato alla membrana acida, chiamato vacuolo contenente Salmonella (SCV)3,4. Il pH acido dell'SCV attiva il T3SS codificato per l'isola di patogenicità della Salmonella 2 (SPI-2) e trasloca una raffica di 20 o più proteine effettrici attraverso la membrana vacuolare nel citosol ospite 5,6,7,8. All'interno dell'ospite, questi complessi cocktail di proteine effettrici manipolano coordinatamente le vie di segnalazione delle cellule ospiti, con conseguente formazione di strutture di membrana tubulari altamente dinamiche e complesse estese dall'SCV lungo i microtubuli, chiamati filamenti indotti da Salmonella (SIF), che consentono alla Salmonella di sopravvivere e replicarsi all'interno delle cellule ospiti 9,10,11.
I metodi per visualizzare, tracciare e monitorare le localizzazioni degli effettori batterici ed esaminare il loro traffico e le interazioni all'interno delle cellule ospiti, forniscono informazioni critiche sui meccanismi alla base della patogenesi batterica. La marcatura e la localizzazione delle proteine effettrici T3SS secrete da Salmonella all'interno delle cellule ospiti si è dimostrata una sfida tecnologica12,13; Tuttavia, lo sviluppo di proteine fluorescenti codificate geneticamente ha trasformato la nostra capacità di studiare e visualizzare le proteine all'interno dei sistemi viventi. Tuttavia, la dimensione delle proteine fluorescenti (~25-30 kDa)15 è spesso paragonabile o addirittura superiore a quella della proteina di interesse (POI; ad esempio, 13,65 kDa per SsaP, 37,4 kDa per SifA). Infatti, la marcatura fluorescente delle proteine degli effettori spesso blocca la secrezione dell'effettore marcato e blocca il T3SS14.
Inoltre, le proteine fluorescenti sono meno stabili ed emettono un basso numero di fotoni prima del fotosbiancamento, limitando il loro uso nelle tecniche microscopiche a super-risoluzione16,17,18, in particolare nella microscopia di localizzazione della fotoattivazione (PALM), STORM e microscopia STED (stimolation emission depletion). Mentre le proprietà fotofisiche dei coloranti fluorescenti organici sono superiori a quelle delle proteine fluorescenti, metodi / tecniche come CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 e HA-Tags 24,25 richiedono un'appendice proteica o peptidica aggiuntiva che può compromettere la struttura-funzione della proteina effettrice di interesse interferendo con la modifica o il traffico post-traduzionale. Un metodo alternativo che riduce al minimo la necessaria modificazione proteica comporta l'incorporazione di ncAA in un POI durante la traduzione attraverso GCE. Gli ncAA sono fluorescenti o possono essere resi fluorescenti tramite chimica a scatto 12,13,26,27,28.
Utilizzando la GCE, le ncAA con gruppi piccoli, funzionali, bio-ortogonali (come un gruppo azide, ciclopropene o cicloottino) possono essere introdotte in quasi tutte le posizioni in una proteina bersaglio. In questa strategia, un codone nativo viene scambiato con un codone raro come un codone di arresto ambrato (TAG) in una posizione specifica nel gene del POI. La proteina modificata viene successivamente espressa nelle cellule insieme a una coppia ortogonale amminoacil-tRNA sintetasi/tRNA. Il sito attivo della tRNA sintetasi è progettato per ricevere solo un particolare ncAA, che viene quindi attaccato covalentemente all'estremità 3' del tRNA che riconosce il codone ambrato. L'ncAA viene semplicemente introdotto nel mezzo di crescita, ma deve essere assorbito dalla cellula e raggiungere il citosol dove l'amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) può collegarlo al tRNA ortogonale; viene quindi incorporato nel PDI nella posizione specificata (vedere Figura 1)12. Pertanto, GCE consente l'incorporazione sito-specifica di una pletora di gruppi reattivi bio-ortogonali come chetone, azide, alchino, cicloottino, transciclooctene, tetrazina, norbonene, α, ammide β-insatura e biciclo [6.1.0]-nonyne in un POI, superando potenzialmente i limiti dei metodi convenzionali di etichettatura delle proteine 12,26,27,28.
Le recenti tendenze emergenti nelle tecniche di imaging a super-risoluzione hanno aperto nuove strade per studiare le strutture biologiche a livello molecolare. In particolare, STORM, una tecnica a super-risoluzione basata sulla localizzazione, è diventata uno strumento inestimabile per visualizzare strutture cellulari fino a ~ 20-30 nm ed è in grado di studiare i processi biologici una molecola alla volta, scoprendo così i ruoli delle molecole intracellulari che sono ancora sconosciuti negli studi tradizionali con media di ensemble13 . Le tecniche a singola molecola e super-risoluzione richiedono un piccolo tag con fluorofori organici luminosi e fotostabili per la migliore risoluzione. Abbiamo recentemente dimostrato che GCE può essere utilizzato per incorporare sonde adatte per l'imaging a super-risoluzione12.
Due delle migliori scelte per la marcatura delle proteine nelle cellule sono biciclo [6.1.0] noninilisina (BCN) e trans-ciclooctene-lisina (TCO; mostrato in Figura 1), che può essere geneticamente codificato usando una variante della coppia tRNA/sintetasi (qui chiamata tRNAPyl/PylRS AF), dove Pyl rappresenta la pirrolisina, e AF rappresenta un doppio mutante razionalmente progettato (Y306A, Y384F) derivato da Methanosarcina mazei che codifica naturalmente la pirrolisina12, 29,30,31. Attraverso la reazione di cicloaddizione di Diels-Alder (SPIEDAC) promossa dalla tensione inversa, questi amminoacidi reagiscono chesomelettivamente con i coniugati tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tali reazioni di cicloaddizione sono eccezionalmente veloci e compatibili con le cellule viventi; Possono anche essere fluorogenici, se un fluoroforo appropriato è funzionalizzato con la porzione di tetrazina12,26,32. Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della dinamica degli effettori batterici consegnati nelle cellule ospiti utilizzando GCE, seguito dalla localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando dSTORM. I risultati indicano che l'incorporazione di un ncAA tramite GCE, seguita da una reazione a clic con coloranti fluorogenici contenenti tetrazina, rappresenta un metodo versatile per la marcatura selettiva, la visualizzazione delle proteine secrete e la successiva localizzazione subcellulare nell'ospite. Tutti i componenti e le procedure qui descritti possono tuttavia essere adattati o sostituiti in modo che il sistema GCE possa essere adattato per indagare su altre questioni biologiche.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glicina SDS tampone di corsa</td><td>BIO-RAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Fischer Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP212R-1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina Sodica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x)</td><td>ThermiFischer Scientific</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP (Centrifuga ad alte prestazioni)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BDP-FL-tetrazina</td><td>Lumiprobe (USA)</td><td>2.14E+02</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Caseina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fare clic sull'aminoacido / trans-Cyclooct-2-en &ndash; L - Lisina (TCO*A)</td><td>SiChem GmbH</td><td>SC-8008</td><td>Formato: 500 mg</td></tr><tr><td>DAPI (Hoechst33342)</td><td>Spettrofotometro Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11+</td><td>DeNovix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM*</td><td>Corning</td><td>10-013-CV*</td> <td>Utilizzato per il mantenimento di HeLa Cell</td></tr><tr><td>DMEM**</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>**Utilizzato per l'infezione batterica in presenza di ncAA, vedere paragrafo 5.4.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Alexa fluoro555 anticorpo secondario</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo E. coli BL21 (DE3)</td><td>Novagen (Madison, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897-BV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td>Filtri per siringhe <td>Fischer</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand - Sterili (PVDF 0,22 &; micro; m)</td><td>Fischer Scientific</td><td>97203</td><td>Confezione da 100</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Elettroporatore</td><td>BIO-RAD</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Gibco L-Glutammina (200 mM), 100x</td><td>Fischer Scientific</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fischer Scientifico</td><td>BF229-4</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HeLa</td><td>ATTC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampone</td><td>Corning</td><td>25-060-C1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Elaborazione e analisi delle immagini:&nbsp; http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Colorante a base di Coomassie</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>Janelia Fluoro 646-tetrazina</td><td>Tocris Bioscience</td><td>7279</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>5 g</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Manager (v. 1.4.2)</td><td></td><td></td><td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Cuvetta per micropulsatore</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2086</td><td>0,2 cm distanza tra gli elettrodi, confezione da 50</td></tr><tr><td>Nikon N-STORM</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask Fiasche per colture cellulari</td><td>ThermiFischer Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Casamino Acid</td><td>Calbiochem</td><td>2240</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Paraformaldehhyde (PFA)</td><td>Microscopia elettronica Sciences&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)</td><td>GenDEPOT&nbsp;</td><td>CA005-010</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>pEVOL-PylRS-AF</td><td></td><td></td><td>Per la costruzione e la mappa del plasmide vedere i seguenti riferimenti 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td></tr><tr><td>Kit di mini-preparazione del plasmide</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pWSK29-sseJ10TAG-HA</td><td></td><td></td><td>Rif.: elife. 2021, 10, e67789.</td></tr><tr><td>plasmide pWSK29-sseJ-HA</td><td></td><td></td><td>Rif.: elife. 2021, 10, e67789.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Mappa vettoriale di PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td></tr> <tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore</td><td>540025</td><td>grado proteico, soluzione al 10%</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Fischer Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di potassio</td><td>Acros Inibitore organico</td><td>della</td> proteasi 424220250 <td></td></tr><tr><td>Cocktail Set I - Soluzione Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>539131</td><td>100x</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-HA di coniglio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6908</td><td></td></tr><tr><td>S. enterica. sierotipo Typhimurium 14028s</td><td></td><td></td><td>Rif.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fischer Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM), 100x</td><td>Corning</td><td>25-060-C1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Smembratore sonico Modello 100</td><td>Fischer Scientific</td><td>24932</td><td></td></tr><tr><td>STED microsocpe (sistema Leica TCS SP8 STED 3X)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td></td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td></tr> <tr><td>ThunderSTORM</td><td></td><td></td><td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td></tr> <tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x), 0,25%&nbsp; &nbsp;</td><td>GenDEPOT&nbsp;</td><td>CA014-010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>X-well vetrini per camera di coltura tissutale</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All'ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l'ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un'impronta per definire l'interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l'etichettatura e l'imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo. 
La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l'apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l'imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) 
Recenti scoperte suggeriscono che l'incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell'ospite. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.

Questo documento protocollare descrive un metodo basato su GCE per l'etichettatura fluorescente sito-specifica e la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella , come illustrato nella Figura 1. La struttura chimica del gruppo bioortogonale (TCO) transciclooctene contenente ncAA e del colorante fluorescente sono mostrati nella Figura 1A. La marcatura di SseJ è stata ottenuta mediante incorporazione genetica di n...

Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

L'espansione del codice genetico, o GCE, supera i limiti di altre strategie di etichettatura. Ci consente di localizzare proteine specificamente etichettate e abbiamo fluorofori organici luminosi che consentono la loro visualizzazione, in modo da evitare strategie che producono, ad esempio, fusioni proteiche fluorescenti, che possono interrompere la funzione proteica. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi altro sistema.Ad esempio, lo abbiamo usato per etichettare la proteina Zika CO e questo ci consente di fornire e produrre virus Zika etichettato che possiamo quindi osservare infettare le cellule ospiti. Per iniziare, trasferire 100 microlitri di coltura primaria in cinque millilitri di mezzo LB contenente 35 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 RPM fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,6.Sostituire il mezzo LB con il mezzo N-minimo modificato integrato con un TCO millimolare, un amminoacido non canonico. E fai crescere i batteri a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 0,2% arabinosio, 25 milligrammi per millilitro di cloramfenicolo e 100 milligrammi per millilitro di ampicillina e far crescere le cellule per altre sei ore, agitando a 250 giri / min.Dopo sei ore, lavare i batteri quattro volte in un intervallo di 30 minuti con mezzi freschi di MgM senza aminoacidi non canonici o, ncAA. Centrifugare i batteri, risospendere nel tampone PBS e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius al buio per rimuovere gli ncAA in eccesso. Dopo un'ora, centrifugare i batteri a 3.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e conservarli per un ulteriore utilizzo.Per un esperimento di controllo, ripetere lo stesso esperimento esprimendo le proteine portatrici di ncAA in assenza di ncAA. Risospendere le cellule di salmonella che esprimono SseJ incorporato con TCO in assenza o presenza di TCO nella PBS. Regolare la densità ottica a 600 nanometri a quattro in PBS e incubare le cellule con 20 micromolari Janelia Fluor 646 tetrazene o 20 micromolari BDPFL tetrazine a 37 gradi Celsius al buio e agitare per una o due ore a 250 RPM.Pellet le cellule e lavarle tre o quattro volte con PBS contenente il 5% di DMSO e lo 0,2% di Pluronic F-127. Risospendere il pellet in PBS contenente il 5% di DMSO. Dopo aver incubato durante la notte a quattro gradi Celsius al buio, lavare due volte di nuovo con PBS.Immagina immediatamente le cellule usando un microscopio confocale o fissale con paraformaldeide all'1,5% in PBS per 30-45 minuti a temperatura ambiente al buio. Coltivare e mantenere le cellule HeLa a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità in DMEM ad alto glucosio integrato con 10% FBS oltre alla streptomicina penicillina. Batteri di coltura un giorno prima dell'infezione e inoculare una singola colonia di salmonella wild-type che ospita plasmide pEVOL contenente coppia di tRNA sintetasi ortogonale e plasmide pWSK29 contenente gene SseJ in cinque millimetri di antibiotico contenente brodo LB standard durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 RPM.Riparare uno stock di cellule diluite a 100.000 cellule per millilitro e seminare 50.000 cellule HeLA per pozzetto in 500 microlitri di DMEM contenente il 10% di terreno di crescita FBS in un vetrino a otto pozzetti. Tenere lo scorrimento della camera in un'incubatrice per 24 ore a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 95% umidità. Per l'infezione batterica, la sottocoltura di salmonella wild-type che ospita plasmide pEVOL e plasmide pWSK29 contenente il gene SseJ diluendo 100 microlitri di coltura batterica durante la notte in tre millilitri di terreno LB contenente 35 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.Incubare a 37 gradi Celsius agitando a 250 RPM per cinque-sette ore. Per iniziare l'infezione delle cellule HeLa, dopo aver estratto le cellule HeLa dall'incubatore, lavare le cellule con DPBS preriscaldato e aggiungere 500 microlitri di DMEM fresco contenente il 10% di FBS a ciascun pozzetto. Posizionare il vetrino della camera nell'incubatore ad anidride carbonica fino all'inizio dell'infezione.Dopo cinque-sette ore di incubazione, diluire la coltura di salmonella in modo che la densità ottica a 600 nanometri sia 0,2 in un millilitro di terreno di crescita DMEM e aggiungere le quantità necessarie di inoculo di salmonella a ciascun pozzetto del vetrino della camera, in modo che la molteplicità dell'infezione sia 100. Dopo aver incubato le cellule infette in un incubatore ad anidride carbonica per 30 minuti, lavare le cellule tre volte con DPBS preriscaldato per rimuovere la salmonella extracellulare. Impostare questo punto temporale a zero ore dopo l'infezione e aggiungere 500 microlitri di terreno completo contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina per un'ora.Dopo l'incubazione, di nuovo, lavare le cellule tre volte con DPBS come mostrato in precedenza e aggiungere 500 microlitri del mezzo completo integrato con 0,2% arabinosio, 10 microgrammi per millilitro di gentamicina a ciascun pozzetto del vetrino della camera. In un esperimento di controllo, eseguire infezioni simili di cellule HeLa senza TCO. Dopo aver incubato il vetrino della camera per 10 ore nell'incubatore ad anidride carbonica, sostituire il mezzo completo con un mezzo completo fresco senza TCO e lavare le celle HeLa quattro volte nell'arco di 30 minuti ciascuna con DPBS preriscaldato.Quindi lavare le celle con mezzo completo fresco senza TCO. Dopo 12 ore dall'infezione, aspirare il mezzo dalle cellule e lavare la cellula con DPBS preriscaldato due o tre volte. In un gruppo di pozzetti, aggiungere 500 microlitri della miscela di soluzione colorante uno, e in un altro gruppo di pozzetti della stessa vetrina, aggiungere 500 microlitri della miscela di soluzione colorante due.Posizionare la camera di nuovo nell'incubatore ad anidride carbonica per una e mezza a due ore. Dopo 13,5-14 ore dopo l'infezione, sciacquare le cellule HeLa due volte con DPBS preriscaldato e aggiungere 500 microlitri di DMEM fresco integrato con FBS. Dopo l'incubazione per 30 minuti, lavare nuovamente le cellule con DPBS preriscaldato come mostrato in precedenza, quindi lavare con DMEM fresco quattro volte nell'arco di 30 minuti.A 16 ore dopo l'infezione, fissare le cellule HeLa con paraformaldeide aggiungendo 200 microlitri di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzetto e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Aspirare la paraformaldeide. Risciacquare tre volte con PBS e conservare le cellule in PBS a quattro gradi Celsius al buio.Portare le cellule al microscopio e posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio nel supporto del campione. Quindi cambiare il mezzo nel pozzetto con 0,4 millilitri del tampone di imaging GLOX BME appena fatto. Ridurre la potenza del laser a circa un milliwatt per identificare una cella HeLa di interesse e regolare il piano focale e l'angolo del raggio laser illuminando il campione con basse densità laser a 647 nanometri.Regolare l'angolo di illuminazione HILO. Cattura un riferimento all'immagine limitata della frazione della struttura target e passa i fluorofori allo stato scuro ruotando il laser alla sua massima potenza. Impostare il guadagno del preamplificatore su tre e attivare il trasferimento del fotogramma.Quindi impostare il guadagno EM su 200 per una maggiore sensibilità nelle misurazioni dSTORM. Regolare la potenza del laser a un livello adeguato in cui gli eventi lampeggianti sono separati nello spazio e nel tempo. Impostare il tempo di esposizione su 30 millisecondi e iniziare l'acquisizione.Acquisisci da 10.000 a 30.000 fotogrammi. Ripeti l'acquisizione simile con ROI diversi. Per la ricostruzione delle immagini di dSTORM, apri l'immagine J e importa i dati grezzi.Apri il plug-in Thunderstorm e configura l'impostazione della fotocamera corrispondente al dispositivo. Vai a eseguire l'analisi e impostare le impostazioni appropriate, come il filtro delle immagini, i metodi di localizzazione e la localizzazione subpixel delle molecole. Fare clic su OK per avviare la ricostruzione dell'immagine e iniziare l'analisi del risultato finale di post-elaborazione.Le Salmonelle che esprimono SseJ incorporate nel TCO sono trattate con Janelia Fluor 646 tetrazina e riprodotte con fluorescenza Janelia Fluor 646 in assenza o presenza di TCO. La fluorescenza di SseJ viene rilevata solo quando è presente il TCO. Le cellule HeLa sono infettate da salmonella che ospita psseJ-HA per 16 ore, fisse e immunocolorate con anticorpi anti HA, LPS e DAPI.Come previsto, i filamenti indotti da salmonella SseJ, o SIF, si formano nelle cellule infette. In assenza di TCO, il codone ambrato non viene soppresso e i SIF dipendenti da SseJ sono assenti nelle cellule HeLa infette. I SIF dipendenti da SseJ sono osservati in presenza di TCO, il che indica chiaramente che SseJ è stato salvato dall'espressione di SseJF10TCOHA usando l'espansione del codice genetico, o GCE.Qui è mostrata la specificità di etichettatura di SseJF10TCOHA secreto nelle cellule HeLa attraverso reazioni di clic SPIEDAC utilizzando due miscele di coloranti alternate una e una miscela di colorante due. Il colorante Click Janelia Fluor 646 TZ è stato ulteriormente utilizzato per osservare se vi fosse un'etichettatura di fondo nelle cellule HeLa infettate da Salmanella wild-type che trasportano SseJ HA in presenza di TCO e plasmide P vault. SseJ è stato rilasciato nel citoplasma della cellula ospite senza segnali fluorescenti intracellulari o non specifici, dimostrando che il segnale fluorescente era specifico per SseJ.L'imaging ad altissima risoluzione della GCE marcata SseJ nelle cellule HeLa è presentato in questa figura. Un'immagine in campo chiaro di una cellula HeLa sotto osservazione è mostrata qui. L'immagine a campo largo limitato alla diffrazione di SseJ secreto etichettato con TCO e Janelia Fluor 646 e la corrispondente immagine dSTORM dei SIF decorati con SseJ sono presentati qui.L'inserto mostra una vista ingrandita di un SseJ super risolto nella regione riquadro. Le soluzioni stock NCAA sono state preparate in NaOH. Non dimenticare di neutralizzarlo prima o dopo l'aggiunta ai supporti.Dopo aver etichettato la proteina di interesse, lavare ampiamente la cellula, in modo che il segnale di fondo sia minimo. Seguendo la nostra procedura GCE, ora possiamo etichettare qualsiasi fattore di virulenza nei batteri e seguirne l'attività utilizzando le nostre tecniche di imaging.

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Questo protocollo spiega come preparare e montare campioni batterici per l'imaging tridimensionale dal vivo e come ricostruire la forma tridimensionale di E. coli da queste immagini.

Immagini tridimensionali di cellule batteriche per rappresentazioni cellulari accurate e localizzazione precisa delle proteine

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

Il metodo presentato consente la visualizzazione di proteine cellulari etichettate fluorescentmente con microscopia di espansione che porta a una risoluzione di 70 nm su un microscopio convenzionale.

Imaging di proteine podocitiche Nefrrina, Actina e Podocina con microscopia di espansione

Questo articolo presenta un protocollo completo per PmbExM, una tecnica di microscopia ad espansione progettata specificamente per i biofilm di Proteus mirabilis . PmbExM utilizza un trattamento enzimatico graduale di campioni di biofilm per ottenere un'espansione isotropa di 4,3 volte, consentendo l'analisi a super-risoluzione dell'organizzazione spaziale delle strutture cellulari e subcellulari all'interno di queste comunità microbiche sessili.

Imaging a super-risoluzione del biofilm di Proteus mirabilis mediante microscopia ad espansione

Scopri l'espansione del codice genetico per marcare effettori secreti da Salmonella e visualizzarli in cellule HeLa tramite microscopia dSTORM. Questo metodo consente l'imaging a super-risoluzione delle interazioni patogeno-ospite.

Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

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