Valutazione della funzione biventricolare murina ex vivo in un modello di Langendorff

Con il protocollo descritto, possiamo confrontare il ventricolo sinistro del cuore del donatore e la funzione del ventricolo dopo la conservazione, e possiamo esaminare la differenza della biologia della conservazione in entrambi i ventricoli durante questo processo di conservazione. Questa tecnica utilizza un sistema di perfusione ex vivo per esaminare le funzioni cardiache dopo la conservazione. Fornisce uno strumento robusto e affidabile per lo screening di nuovi trattamenti per migliorare le funzioni cardiache del donatore dopo la conservazione.

Iniziate con la preparazione dell'impasto come descritto nel testo e modellate un pezzettino di pasta di forma ovale per ottenere la testa. Attaccalo all'estremità di un filo di spaghetti asciutto. Immergere la testa nella soluzione zuccherina già preparata e rimuoverla lentamente una volta che è ben ricoperta da un sottile film di soluzione.

Quindi, appendere il filo di spaghetti su un blocco di polistirolo espanso o altri supporti per consentire la formazione di una copertura uniforme e lucida sulla testa e asciugarlo per una notte. Il giorno successivo, immergere lo stampo in elastomero siliconico disperso in xilene e riposizionare il filo di spaghetti nel blocco di polistirene espanso a 37 gradi Celsius per due ore o fino a quando non si asciuga. Ripeti questo passaggio ancora una volta.

Quindi, metti lo stampo nell'acqua per separare e raccogliere il palloncino. Conservare il palloncino in azide di sodio allo 0,02%. Ora, taglia una punta a due estremità smussate da un ago calibro 22 e monta un'estremità smussata sul palloncino in silicone mentre l'altra estremità smussata su un tubo in PE.

Usa una sutura di seta 4-0 per legare il palloncino in posizione sull'ago. Prendi il topo C57Black/6 e inietta per via intraperitoneale 200 unità di eparina nell'addome dell'animale per l'anticoagulazione. Dopo aver confermato la corretta anestesia con un pizzicotto del dito del piede, praticare un'incisione proprio sotto lo sterno.

E usando le forbici, apri il petto tagliando il diaframma nelle costole. Quindi, piegare la parete toracica anteriore per esporre completamente il torace prima di praticare un taglio in corrispondenza dell'aorta discendente vicino all'arco aorta. Ora, trasferisci il cuore, i polmoni e il timo del topo in istidina-triptofano-chetoglutarato ghiacciato, o tampone HTK, per isolare gli organi.

Esporre l'aorta rimuovendo il tessuto connettivo. Collega l'estremità dell'aorta a un ago calibro 22 e legalo con una sutura di seta 6-0. Assicurarsi che la cannula sia sopra la radice aortica, in modo da non interferire con la valvola aortica.

Perfondere l'aorta per circa 10 minuti con 10 millilitri di tampone HTK, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius. A seconda del tipo di esperimento, conservare il cuore in una provetta da 50 millilitri con HTK ghiacciato per otto ore o eseguire immediatamente la profusione. Per eseguire la profusione, collegare il cuore montato sull'ago alla cannula nell'apparecchio di Langendorff e legarlo con una sutura di seta.

Avviare la profusione in modalità a flusso costante a tre millilitri al minuto, quindi dopo essere passati a una modalità a pressione costante a 70-80 millimetri di mercurio, regolare la velocità di perfusione a circa sei millilitri al minuto. Quindi, collegare un palloncino in silicone sgonfio riempito d'acqua a un trasduttore di pressione e a una siringa piena d'acqua utilizzando un rubinetto a tre vie. Dopo 15-20 minuti di un periodo di equilibrio successivo alla perfusione precedente, tagliare l'atrio destro, o AR, e inserire il palloncino nel ventricolo destro, o RV, attraverso l'AR. Usa del nastro adesivo per tenere il palloncino all'interno del camper e riduci al minimo l'area aperta dell'AR per aiutare a vincolare il palloncino nel ventricolo.

Dopo 20 minuti di raccolta dati funzionali per il ventricolo destro, tagliare l'atrio sinistro, o LA, e inserire un palloncino sgonfio pieno d'acqua nel ventricolo sinistro, o LV, attraverso il LA. Utilizzare del nastro adesivo per tenere il palloncino all'interno del LV.To calibrare il trasduttore di pressione, riempire prima una siringa da 10 millilitri con soluzione salina calda e collegare la siringa alla cupola attraverso un rubinetto a tre vie. Aprire il rubinetto e riempire lentamente la cupola con soluzione fisiologica prima di chiudere tutti i rubinetti e rimuovere la siringa. Quindi, collegare la cupola riempita al trasduttore collegando il manometro alla terza estremità del rubinetto a tre vie.

Nel software di registrazione, dal menu a tendina del canale di collegamento al trasduttore, selezionare l'opzione Bridge Amp. Fare clic su 0 prima di avviare la registrazione per impostare la lettura del trasduttore a zero millimetri di mercurio. Dopo alcuni secondi di registrazione, spingere lentamente la siringa e aumentare la pressione a 100.

Fare clic su Interrompi per terminare la registrazione. Nella finestra di dialogo Conversione unità, selezionare l'area di registrazione per zero millimetri di mercurio e fare clic sulla freccia fino a 1 prima di digitare zero millimetri di mercurio. Allo stesso modo, selezionare l'area di registrazione per 100 millimetri di mercurio.

Fare clic sulla freccia fino a 2 e digitare 100 millimetri di mercurio. A questo punto, fare clic su OK per calibrare il trasduttore. Al termine della calibrazione, rinominare il canale corrispondente al trasduttore di pressione con il palloncino come Pressione ventricolare o Pressione LV e avviare la registrazione quando il cuore è collegato al sistema.

Dopo aver inserito il palloncino nel ventricolo, regolare il volume d'acqua nel palloncino utilizzando una siringa micrometrica attraverso il rubinetto a tre vie per mantenere la pressione diastolica finale a 5-10 millimetri di mercurio. Quindi, rinominare un canale vuoto come dP/dt e mantenere il canale sorgente derivato come pressione del ventricolo. Questo canale registra il rapporto tra la variazione di pressione nella cavità ventricolare durante la contrazione.

Selezionare il periodo di misurazione stabile prima di passare all'impostazione nel modulo della pressione sanguigna. Quindi, selezionare LV Pressure come canale di ingresso e fare clic su selezione prima di premere OK. A questo punto, fare clic su Visualizzazione classificatore per rimuovere eventuali cicli cardiaci anomali e su Visualizza tabella per generare le tabelle per la media dei dP/dt massimi e dei dP/dt minimi per il periodo selezionato. Quando il cuore del topo è stato conservato in tampone HTK per zero ore prima della perfusione, è stata registrata una pressione sistolica più elevata per il ventricolo sinistro rispetto al ventricolo sinistro. Inoltre, rispetto al ventricolo destro, il ventricolo sinistro ha anche mostrato una contrazione muscolare significativamente maggiore, così come il rilassamento.

Tuttavia, quando la perfusione è stata eseguita sul cuore dopo averlo sottoposto a otto ore di conservazione a freddo, sia il ventricolo sinistro che il ventricolo destro hanno mostrato una significativa riduzione funzionale rispetto allo stadio di zero ore. Le diminuzioni sono state osservate essere più gravi nel ventricolo sinistro rispetto al ventricolo destro. La contrazione e il rilassamento del ventricolo sinistro dopo otto ore di conservazione sono stati del 25,1% e del 30,7% della funzione corrispondente alla conservazione a zero ore, mentre il RV ha mostrato il 32,5% e il 29,1% della funzione, rispetto alla linea di base a zero ore. L'indicazione di una disfunzione primaria del trapianto di ventricolo sinistro dopo una conservazione prolungata è risultata più significativa di quella del ventricolo destro. La qualità della conservazione dipende in gran parte dalla perfusione di HTK.

È importante assicurarsi che la perfusione sia costante per confrontare con precisione i diversi trattamenti. Con una misurazione precisa della funzione di conservazione del cuore di un donatore, questo metodo può essere facilmente adattato ai farmaci di screening che possono migliorare la funzione cardiaca del donatore e quindi convalidare ulteriormente utilizzando un modello di trapianto eterotopico.