Name: Valutazione della funzione biventricolare murina ex vivo in un modello di Langendorff (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Impara a valutare la funzione biventricolare murina ex vivo con il sistema di perfusione Langendorff. Questo metodo permette di confrontare le funzioni del ventricolo sinistro e destro dopo la conservazione a freddo.

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Tutti gli esperimenti sugli animali in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Michigan, Ann Arbor. Tutti i topi sono stati alloggiati con un ciclo di luce 12:12 in stanze prive di agenti patogeni. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli animali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.
1. Costruzione del catetere a palloncino in silicone
NOTA: Il palloncino in silicone è realizzato come descritto in precedenza13.
<ol><li>Aggiungere 9,5 ml di acqua distillata, 14,2 ml di sciroppo di mais leggero e 33,8 g di saccarosio in un becher da 100 ml. Scaldare e mescolare la soluzione fino a quando lo zucchero non sarà completamente sciolto.</li>
	<li>Preparare l'impasto mescolando 10 g di farina di frumento e 5 g di acqua fino ad ottenere una consistenza omogenea e lasciarlo riposare per 10 min.</li>
	<li>Formate un piccolo pezzo di pasta in un ovale, la "testa", e attaccatelo all'estremità di un filo di spaghetti asciutto. Quindi, immergere questa testa nella soluzione di zucchero e rimuoverla lentamente dalla soluzione, poiché la testa è ora completamente ricoperta. NOTA: L'impasto deve essere liscio e di consistenza uniforme. Le dimensioni dell'impasto possono essere variate per generare diverse dimensioni di palloncini, da 5 mm (diametro corto) a 7 mm (diametro lungo). Prova a coprirli con un sottile film di soluzione zuccherina.</li>
	<li>Appendere il filo di spaghetti su un blocco di polistirolo espanso, o altri supporti, per formare una copertura lucida uniformemente sulla testa e asciugare per una notte.</li>
	<li>Immergere lo stampo in dispersione di silicone (elastomero siliconico disperso in xilene). Rimettere il filo di spaghetti nel blocco di polistirolo espanso a 37 °C per 2 ore o fino a quando non si asciuga. Ripeti questo passaggio una volta. NOTA: È essenziale evitare che il gel di dispersione siliconica si ossidi a causa dell'esposizione all'aria, poiché ciò genererà uno spessore irregolare del palloncino.</li>
	<li>Metti lo stampo nell'acqua per separare e raccogliere il palloncino. Conservare il palloncino in azide di sodio allo 0,02%.</li>
	<li>Tagliare una punta a due estremità smussata da un ago da 22 G; montare un'estremità smussata sul palloncino in silicone e un'altra estremità smussata sul tubo in PE. Usa la seta 4-0 per legare il palloncino in posizione sull'ago. NOTA: Testare l'integrità del palloncino iniettandovi acqua. Una volta riempito il palloncino, premere delicatamente il palloncino per verificare se il palloncino mantiene la tensione all'interno. Usa un nuovo palloncino se perde. I palloncini montati possono essere conservati per un uso futuro.</li>
</ol>2. Preparazione del sistema di perfusione cardiaca
<ol><li>Preparare 1 L di tampone di perfusione Krebs-Henseleit (KH) e trasferirlo nel serbatoio dell'acqua del sistema Langendorff.</li>
	<li>Collegare il tubo dell'aria al serbatoio dell'acqua e attivare il flusso d'aria per bilanciare il tampone KH con il 5% di CO 2 e il 95% di O2 per almeno 30 minuti.</li>
	<li>Impostare il bagnomaria a 41,5 °C e far circolare l'acqua nello strato esterno del sistema Langendorff per riscaldare il sistema e il tampone KH. NOTA: La temperatura del bagno d'acqua richiede un'ottimizzazione per ogni sistema. Per questo sistema, la temperatura del bagnomaria manterrà il KH a 37-37,5 °C durante la perfusione nel cuore.</li>
</ol>3. Isolamento, montaggio e incannulamento del cuore del topo
<ol><li>Per l'anticoagulazione, somministrare 200 unità di eparina in soluzione salina mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) nel quadrante destro dell'addome di topo C57/B6. Aspirare la siringa prima dell'iniezione per verificare che lo smusso degli aghi non si trovi nella vescica o nel lume del tratto gastrointestinale. Utilizzare almeno quattro topi in ogni condizione sperimentale (ma considerare anche l'entità dell'effetto del trattamento).<ol><li>Dopo 30 minuti, somministrare 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina i.p. per anestetizzare il topo. Controlla se il topo anestetizzato è incosciente eseguendo un pizzicotto del dito del piede e assicurandoti che non si osservi alcuna risposta. L'acepromazina 2 mg/kg può essere aggiunta al cocktail ket/xyl se il ceppo di topi utilizzato non raggiunge un livello adeguato di anestesia solo con ket/xil.</li>
		<li>Fai un'incisione proprio sotto lo sterno. Usa le forbici per aprire il torace tagliando il diaframma e le costole. Piegare la parete toracica anteriore per esporre completamente il torace. Taglio in corrispondenza dell'aorta discendente (chiusa all'arco dell'aorta). Trasferire il cuore, i polmoni e il timo del topo in un tampone freddo istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK). Isolare gli organi sotto un tampone HTK ghiacciato. Esporre l'aorta rimuovendo eventuali tessuti connettivi. NOTA: Massimizzare la lunghezza dell'aorta includendo sia l'aorta ascendente che la regione dell'arco aortico nell'escissione per consentire spazio sufficiente per il collegamento a un ago.</li>
	</ol></li>
	<li>Collegare l'estremità dell'aorta a un ago da 22 G e legare con una sutura di seta 6-0. Assicurarsi che la cannula sia al di sopra della radice aortica per non interferire con la valvola aortica. Perfondere l'aorta con 10 mL di tampone HTK freddo (4 °C) per circa 10 minuti. NOTA: Ci vogliono meno di 15 minuti dalla rimozione del cuore all'incannulamento dell'aorta; Tuttavia, è importante mantenere la velocità di perfusione al livello appropriato. Iniezioni troppo veloci e vigorose possono generare pressioni elevate e causare danni vascolari/cardiaci.</li>
	<li>Conservare il cuore in una provetta da 50 mL con HTK ghiacciato per 8 ore o eseguire immediatamente la perfusione (non conservare il controllo) ed evitare il contatto diretto con il ghiaccio. NOTA: Il contatto diretto del tessuto cardiaco con il ghiaccio può causare lesioni da freddo.</li>
	<li>Collegare il cuore montato sull'ago alla cannula nell'apparecchio di Langendorff e legarlo con una sutura di seta. NOTA: Per standardizzare la procedura, attendere un totale di 3 minuti per il processo di incannulamento prima della perfusione.</li>
	<li>Avviare la perfusione con una modalità a flusso costante a 3 mL/min; quindi, passare alla modalità a pressione costante a 70-80 mmHg e regolare il cuore a ~6 mL/min. NOTA: Palpare dolcemente il cuore può aiutare ad accelerare la rianimazione cardiaca. Se la portata di perfusione è molto superiore a 6 mL/min in modalità a pressione costante, potrebbe esserci una perdita nell'incannulamento o la valvola dell'aorta potrebbe non funzionare correttamente. Regolare i collegamenti per riparare la perdita. La modalità a flusso costante annulla l'autoregolazione del tono vascolare del cuore. La modalità a pressione costante consente al cuore di regolare il flusso di perfusione coronarica. Pertanto, la modalità a pressione costante misurerà con precisione la funzione cardiaca e la qualità di conservazione del cuore.</li>
	<li>Collegare un palloncino sgonfio e pieno d'acqua a un trasduttore di pressione e a una siringa piena d'acqua con un rubinetto a tre vie. Dopo un periodo di equilibratura di 15-20 minuti, tagliare l'atrio destro (RA) e inserire il palloncino nel RV attraverso l'AR. Utilizzare del nastro adesivo per tenere il palloncino all'interno del camper. Ridurre al minimo l'area aperta dell'AR per aiutare a vincolare il palloncino nel ventricolo (vedere la Figura 1 per la configurazione). NOTA: È necessario un periodo di equilibrio, poiché la contrazione e il rilassamento cardiaco non sono stabili all'inizio e la misura è meno accurata e rappresentativa. Se il nodo AV è danneggiato durante l'apertura dell'AR, il cuore mostrerà frequenti aritmie.</li>
	<li>Dopo 20 minuti di raccolta dei dati funzionali del ventricolo destro, tagliare l'atrio sinistro (LA) e inserire un palloncino sgonfio riempito d'acqua nel ventricolo sinistro attraverso il LA. Usa del nastro adesivo per tenere il palloncino all'interno del LV. NOTA: Il cuore deve mantenere stabile l'emodinamica per più di 1,5 ore.</li>
</ol>4. Registrazione dei dati funzionali
<ol><li>Taratura del trasduttore di pressione<ol><li>Riempire una siringa da 10 ml con soluzione fisiologica calda e collegare la siringa alla cupola attraverso un rubinetto a tre vie. Aprire il rubinetto e riempire lentamente la cupola con soluzione fisiologica, quindi chiudere tutti i rubinetti e rimuovere la siringa. Collegare la cupola riempita al trasduttore; Collegare il manometro alla terza estremità del rubinetto a tre vie.</li>
		<li>Nel software di registrazione, selezionare Bridge Amp dal menu a discesa del canale che si collega al trasduttore. Rinominate il canale come Pressione perfusa. Fare clic su Zero per azzerare il trasduttore.</li>
		<li>Avviare la registrazione facendo clic su Start in modo che il trasduttore legga 0 mmHg. Dopo alcuni secondi di registrazione, spingere lentamente la siringa e aumentare la pressione a 100. Fare clic su Interrompi per interrompere la registrazione.</li>
		<li>Nella finestra di dialogo Conversione unità, selezionare un'area di registrazione per 0 mmHg e fare clic sulla freccia fino a Punto 1 e digitare 0 mmHg. Selezionare l'area di registrazione per 100 mmHg, fare clic sulla freccia fino al punto 2 e digitare 100 mmHg. Fare clic su OK per calibrare il trasduttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Rinominare il canale corrispondente al trasduttore di pressione con il palloncino come Pressione ventricolare. Avviare la registrazione quando il cuore è collegato al sistema. Dopo aver inserito il palloncino nel ventricolo, regolare il volume d'acqua nel palloncino utilizzando una siringa micrometrica attraverso il rubinetto a tre vie per mantenere la pressione telediastolica a 5-10 mmHg. NOTA: La misura telediastolica potrebbe diminuire durante la misurazione, preferibilmente a partire da una velocità prossima a 10 mmHg.</li>
	<li>Rinominare un canale vuoto come dP/dt. Dal menu a discesa, selezionare Derivata | canale sorgente come Pressione ventricolare. Il canale registrerà il rapporto tra la variazione di pressione nella cavità ventricolare durante il periodo di contrazione.</li>
	<li>Selezionare un periodo di misurazione stabile, quindi fare clic su Impostazioni nel modulo Pressione sanguigna.<ol><li>Selezionare la pressione ventricolare come canale di ingresso e fare clic su Selezione per un periodo di calcolo | Va bene.</li>
		<li>Fare clic su Visualizzazione classificatore per rimuovere il ciclo cardiaco anomalo (ad esempio, tempo di ciclo o pressione anomali).</li>
		<li>Fare clic su Vista tabella per generare le tabelle della media di max dP/dt (contrazione) e min dP/dt (rilassamento) per il periodo selezionato. NOTA: Memorizzare il file di registrazione per ciascun campione e salvare la tabella della funzione cardiaca media per l'analisi statistica.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li>
<li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+%26%2334%3Bhigh-risk%26%2334%3B+donor+hearts%3A+Implications+for+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of &#34;high-risk&#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li>
<li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matching+the+market+for+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679(2016).</li>
<li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li>
<li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li>
<li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation%3A+a+thorn+amongst+the+roses%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury%3A+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li>
<li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997(2021).</li>
<li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated%2C+Langendorff-perfused+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li>
<li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li>
<li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004(2021).</li>
<li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology+%26+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology & Biomaterials. 1 (101), (2011).</li>
<li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li>
<li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+function+and+failure%3A+report+of+a+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo protocollo descrive il metodo Langendorff per perfusione retrograda tramite incannulamento aortico. Questa tecnica può essere utilizzata per valutare la funzione LV e RV dei cuori murini dopo la conservazione a freddo. I risultati mostrano che la conservazione a freddo prolungata dei cuori dei donatori porta a una riduzione della funzione cardiaca sia nel ventricolo sinistro che nel ventricolo destro utilizzando questo protocollo. 
Gli studi sul rigetto acuto e cronico dopo trapianto di cuore si concentrano ampiamente sull'immunobiologia14. Gli effetti delle cellule native sulla PGD durante la conservazione a freddo sono meno studiati. La PGD si verifica nel ~10%-20% dei trapianti di cuore e rappresenta il 66% delle morti premature entro 30 giorni dal trapianto. In particolare, l'incidenza della PGD a carico del ventricolo sinistro rispetto al ventricolo destro differisce dopo il trapianto11. Senza il contributo delle risposte cellulari del ricevente, questo metodo ex vivo si concentra sui contributi delle cellule cardiache native alla PGD dopo la conservazione a freddo dei cuori dei donatori. Ulteriori studi possono incorporare le risposte del ricevente in un modello di trapianto di cuore murino. 
In questo protocollo, la perfusione di Langendorff di cuori di donatori conservati a freddo si è concentrata sulle risposte cardiache native alla perfusione di cristalloidi caldi senza infiltrare l'immunità cellulare. Per ottenere risultati riproducibili, sono stati standardizzati diversi passaggi critici. I cuori di topo sono stati arrestati utilizzando una soluzione di HTK e conservati in HTK ghiacciato, in modo simile alla pratica clinica. Il volume di perfusione e il tempo di infusione della soluzione HTK per ogni cuore sono stati attentamente monitorati con un timer. Il cuore del donatore è stato conservato in provette prerefrigerate su ghiaccio contenente HTK in una stanza a 4 °C. Il tempo di incannulamento è standardizzato a ~3 minuti prima della perfusione. Tutti questi passaggi hanno fatto sì che la durata della conservazione a freddo fosse la variabile principale dello studio. 
Un periodo di contrattilità cardiaca irregolare per ~ 20 minuti è stato comunemente osservato all'inizio della perfusione. Questo periodo di equilibrio e recupero è stato facilitato dal graduale riscaldamento e ossigenazione dei tessuti cardiaci. Ci si aspettava un periodo relativamente stabile dopo i primi 20 minuti. Il palloncino è stato inserito nella cavità ventricolare a ~18 minuti dopo il periodo di equilibrio iniziale. Abbiamo iniziato a registrare l'emodinamica dopo che il cuore è stato stabile per ~ 25 minuti, una volta inserito il palloncino. La perfusione con il tampone KH ha mantenuto stabili le prestazioni cardiache per ~1,5-2 ore. Abbiamo quindi scelto di registrare l'emodinamica per 20 minuti in ciascuno dei ventricoli sinistro e destro.
Ci sono diverse limitazioni della perfusione retrograda per lo studio della PGD dei cuori dopo la conservazione a freddo. Innanzitutto, a causa delle dimensioni del palloncino e della mancanza di spazio in ciascuna cavità ventricolare (in particolare, il ventricolo destro), l'inserimento simultaneo di due palloncini sia nel ventricolo sinistro che nel ventricolo destro è molto impegnativo. Pertanto, misuriamo la funzione di RV e LV in sequenza. È importante notare che il setto interventricolare contribuisce in modo significativo alla funzione ventricolare sinistra e destra. Il setto contribuisce al ~50% della funzione ventricolare destra, quindi c'è dipendenza interventricolare15. È anche importante notare che, mentre le procedure per la riperfusione del cuore murino nel dispositivo Langendorff richiedono ~ 3 minuti, l'impianto chirurgico del cuore umano nel campo chirurgico relativamente caldo richiede ~ 45 minuti. In confronto, il cuore murino in questo sistema di Langendorff incorre in meno tempo ischemico. Questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si considera la traduzione clinica.
Dal momento che abbiamo usato il tampone KH per perfondere il cuore senza sangue, questo potrebbe anche avere una minore efficienza nella consegna di ossigeno. Tuttavia, la funzione cardiaca è relativamente stabile durante le prime 1,5-2 ore di perfusione, consentendo così misurazioni emodinamiche affidabili. Sfortunatamente, attualmente non esistono modelli di perfusione cardiaca funzionanti per questi cuori murini più piccoli e l'effetto del carico ventricolare non può essere valutato in questo sistema. Nonostante ciò, il sistema di perfusione è altamente riproducibile e meno laborioso e dispendioso in termini di tempo rispetto ai modelli di trapianto. È anche meno costoso degli studi sui trapianti, il che può renderlo più adatto per lo screening di diverse opzioni terapeutiche e vari percorsi molecolari. Con modifiche alle soluzioni di conservazione con l'aggiunta di farmaci candidati, questa piattaforma può essere utilizzata per valutare gli effetti degli agenti farmacologici sulla riduzione della PGD sia nel ventricolo sinistro che nel ventricolo destro.

Il trapianto di cuore migliora la sopravvivenza e la qualità della vita nei pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale1. Purtroppo, la carenza di donatori di cuore limita il numero di pazienti che potrebbero beneficiare di questa terapia e limita la capacità dei medici di abbinare in modo ottimale i donatori ai riceventi 2,3,4. Inoltre, il nuovo sistema di assegnazione ha contribuito a tempi ischemici più lunghi e ha aumentato significativamente il ricorso a donatori marginali dal 20185. Di conseguenza, l'età media dei donatori di cuore e il tempo ischemico aumentano nel tempo, portando a un tasso più elevato di disfunzione primaria del trapianto (PGD) nonostante i significativi miglioramenti nelle strategie per la conservazione del cuore 6.
La PGD può interessare il ventricolo sinistro, destro o entrambi e rimane una complicanza pericolosa per la vita che rappresenta la principale causa di morte prematura dopo il trapianto di cuore. Lo studio dei meccanismi della PDG e lo sviluppo di strategie per una migliore conservazione del cuore sono considerazioni importanti, dato il potenziale impatto salvavita sui riceventi cardiaci. Pertanto, i modelli sperimentali che consentono una valutazione robusta e affidabile della funzione cardiaca del donatore dopo un tempo di conservazione prolungato sono essenziali per aumentare la nostra comprensione della PGD e facilitare lo sviluppo di nuove terapie. La capacità di valutare con precisione la funzione cardiaca nel cuore del topo consente l'accesso a un vasto repertorio di modelli murini transgenici in grado di identificare con precisione i meccanismi della PGD.
Negli studi fisiologici e farmacologici, il modello di perfusione retrograda di Langendorff è ampiamente utilizzato per valutare la funzione cardiaca7. In particolare, le prestazioni cardiache vengono rilevate da un palloncino in silicone collegato a un trasduttore di pressione all'interno della cavità ventricolare sinistra (LV). Una caratteristica fondamentale della PGD è l'inadeguata contrazione e rilassamento del muscolo ventricolare. Precedenti studi di Langendorff si sono concentrati sull'utilizzo di un palloncino ventricolare sinistro per produrre risultati affidabili e riproducibili nella valutazione funzionaledel ventricolo sinistro 8,9,10. Tuttavia, l'uso di un palloncino intracavitario per valutare la funzione ventricolare destra (RV) utilizzando il sistema a palloncino è meno ben riconosciuto.
Dato un tasso significativo di PGD che coinvolge il RV dopo il trapianto11, i metodi sperimentali per studiare sia la funzione del ventricolo sinistro che quella del ventricolo destro aiuterebbero a determinare i meccanismi molecolari e fisiologici che contribuiscono alla PGD del ventricolo destro. Questo protocollo mostra che i palloncini in silicone intracavitari possono fornire valutazioni affidabili della funzione del ventricolo sinistro e del ventricolo destro nello stesso cuore murino12. Per valutare il potenziale utilizzo del sistema di Langendorff nello studio PGD, abbiamo esaminato le funzioni cardiache con diversi periodi di conservazione e abbiamo riscontrato una diminuzione della funzione cardiaca in contrazione e rilassamento con la conservazione a freddo prolungata dei cuori murini. È interessante notare che il ventricolo sinistro ha una riduzione funzionale maggiore rispetto al ventricolo sinistro. In sintesi, il protocollo qui descritto può essere utilizzato per valutare l'effetto di un farmaco candidato e delle vie molecolari sulla funzione del ventricolo sinistro e del ventricolo destro. La possibilità di utilizzare questo metodo su cuori murini faciliterà l'esecuzione di studi meccanicistici dettagliati.

<table><tbody><tr><td>Sutura di seta 4-0</td><td>Braintree Scientific SUTS108</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura di seta 6-0</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS104</td><td></td></tr><tr><td>Farina per tutti gli usi</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Aghi ipodermici per uso generale e PrecisionGlide 22 G</td> Siringa <td>Fisher scientific</td><td>14-826-5A</td><td></td></tr><tr><td>BD con punte Luer-Lok (senza ago)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Sciroppo di mais</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK Soluzione</td><td>Essential Pharmaceuticals LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393/14394</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL provette coniche</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Henseleit tampone</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Nusil dispersioni siliconiche</td><td>Avantor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione</td><td>Radnoti</td><td>130101BEZ</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td></td><td>Sigma S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Sigma</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della funzione biventricolare murina ex vivo in un modello di langendorff

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

La disfunzione primaria del trapianto (PGD) rimane la principale causa di morte prematura dopo il trapianto di cuore. Il tempo ischemico prolungato durante la conservazione a freddo è un importante fattore di rischio per la PGD e una valutazione affidabile della funzione cardiaca è essenziale per studiare le risposte funzionali del cuore del donatore dopo la conservazione a freddo. Il video di accompagnamento descrive una tecnica per valutare la funzione ventricolare destra e sinistra dei murini utilizzando la perfusione ex vivo basata su un modello di Langendorff dopo conservazione a freddo per diverse durate. In breve, il cuore viene isolato e conservato in una soluzione fredda di istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK). Quindi, il cuore viene perfuso con un tampone di Kreb in un modello di Langendorff per 60 minuti. Un palloncino di silicone viene inserito nel ventricolo sinistro e destro e vengono registrati i parametri funzionali cardiaci (dP/dt, relazioni pressione-volume). Questo protocollo consente la valutazione affidabile della funzione cardiaca dopo diversi protocolli di conservazione del cuore. È importante sottolineare che questa tecnica consente lo studio delle risposte di conservazione cardiaca in modo specifico nelle cellule cardiache native. L'uso di cuori murini molto piccoli consente l'accesso a una vasta gamma di topi transgenici per studiare i meccanismi della PGD.

I cuori di topo adulto C57Bl/6, di 3 mesi di età, sono stati raccolti e montati sul sistema Langendorff. Il cuore del donatore è stato conservato in HTK per 0 e 8 ore e poi perfuso con tampone KH ossigenato. Un palloncino in silicone collegato a un trasduttore di pressione è stato utilizzato per misurare la contrazione e il rilassamento della funzione LV e RV.
Le pressioni aortiche sono state mantenute nell'intervallo 70-80 mmHg. La frequenza cardiaca era paragonabile nei cuori di topo con 0 e 8 ore di conservazione. La funzione del ventricolo sinistro e del ventricolo destro è stata esaminata misurando la pressione sistolica e diastolica. dP/dt, una derivata per calcolare il rapporto di variazione della pressione, è stata calcolata per determinare la dinamica della pressione. Il numero assoluto di dP/dt max e dP/dt min potrebbe rappresentare il livello di contrazione e rilassamento muscolare. A 0 ore di conservazione, il ventricolo sinistro presentava una pressione sistolica più elevata rispetto al ventricolo destro (Figura 2C e Figura 3A). Il ventricolo sinistro ha mostrato una maggiore contrazione e rilassamento muscolare rispetto al ventricolo destro dopo una perfusione di 0 ore di accumulo (Figura 2C e Figura 3B,C). Tuttavia, dopo 8 ore di conservazione a freddo, sia il ventricolo sinistro che il ventricolo destro hanno mostrato una significativa riduzione funzionale rispetto a un basale di 0 ore (Figura 2A-D e Figura 3B,C). Le diminuzioni della contrazione cardiaca sono state più gravi nel ventricolo sinistro. Dopo 8 ore di conservazione, la contrazione e il rilassamento del ventricolo sinistro sono stati del 25,1% e del 30,7% del basale di 0 ore, mentre il ventricolo destro aveva il 32,5% e il 29,1% di funzione rispetto al basale di 0 ore (Figura 3B,C). Questi risultati hanno mostrato che la PGD del ventricolo sinistro dopo conservazione prolungata ha avuto una riduzione della contrazione cardiaca più significativa rispetto al ventricolo destro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figura 1: Montaggio e incannulamento del cuore del topo . (A) Configurazione generale della configurazione di perfusione. 1. Serbatoio di perfusione. 2. Camera di ossigenazione. 3. Camera di intrappolamento dell'aria. 4. Camera del cuore. 5. Interruttore di valore per portata e pressione costanti. 6 e 7. Afflusso di ossigeno. (B) Cuori cannulati con il camper nella parte anteriore. (C) Posizione del camper da tagliare per l'apertura della sua cavità. (D) Picchiettare il tubo del palloncino con la cannula. Abbreviazione: RV = ventricolo destro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figura 2: Confronto tra la funzione del ventricolo sinistro e del ventricolo sinistro. (A) Registrazione del tracciamento dei dP/dt massimi e minimi nel ventricolo destro e del ventricolo sinistro nel cuore del donatore con 0 ore di conservazione. (B) La registrazione di dP/dt max e min nel ventricolo destro e LV nel cuore del donatore con 8 ore di conservazione. (C,D) Dettagli di dP/dt, pressione ventricolare, frequenza cardiaca e pressione di perfusione nel ventricolo sinistro e nel ventricolo destro a 0 h e 8 h. Abbreviazioni: RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro; dP/dt = relazione pressione-tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figura 3: Confronto tra la funzione del ventricolo sinistro e del ventricolo destro dopo l'immagazzinamento e la perfusione. (A) Pressione sistolica e diastolica del ventricolo sinistro e del ventricolo destro dopo 0 h e 8 h di conservazione. (B) dP/dt max e (C) dP/dt min del ventricolo sinistro e del ventricolo destro dopo perfusione con 0 h e 8 h di conservazione. Questa cifra è tratta da Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui viene presentato un protocollo per quantificare in modo affidabile la funzione ventricolare destra e sinistra dei cuori dei donatori dopo la conservazione a freddo utilizzando un sistema di perfusione ex vivo .

Valutazione della funzione biventricolare murina ex vivo in un modello di Langendorff

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Con il protocollo descritto, possiamo confrontare il ventricolo sinistro del cuore del donatore e la funzione del ventricolo dopo la conservazione, e possiamo esaminare la differenza della biologia della conservazione in entrambi i ventricoli durante questo processo di conservazione. Questa tecnica utilizza un sistema di perfusione ex vivo per esaminare le funzioni cardiache dopo la conservazione. Fornisce uno strumento robusto e affidabile per lo screening di nuovi trattamenti per migliorare le funzioni cardiache del donatore dopo la conservazione.Iniziate con la preparazione dell'impasto come descritto nel testo e modellate un pezzettino di pasta di forma ovale per ottenere la testa. Attaccalo all'estremità di un filo di spaghetti asciutto. Immergere la testa nella soluzione zuccherina già preparata e rimuoverla lentamente una volta che è ben ricoperta da un sottile film di soluzione.Quindi, appendere il filo di spaghetti su un blocco di polistirolo espanso o altri supporti per consentire la formazione di una copertura uniforme e lucida sulla testa e asciugarlo per una notte. Il giorno successivo, immergere lo stampo in elastomero siliconico disperso in xilene e riposizionare il filo di spaghetti nel blocco di polistirene espanso a 37 gradi Celsius per due ore o fino a quando non si asciuga. Ripeti questo passaggio ancora una volta.Quindi, metti lo stampo nell'acqua per separare e raccogliere il palloncino. Conservare il palloncino in azide di sodio allo 0,02%. Ora, taglia una punta a due estremità smussate da un ago calibro 22 e monta un'estremità smussata sul palloncino in silicone mentre l'altra estremità smussata su un tubo in PE.Usa una sutura di seta 4-0 per legare il palloncino in posizione sull'ago. Prendi il topo C57Black/6 e inietta per via intraperitoneale 200 unità di eparina nell'addome dell'animale per l'anticoagulazione. Dopo aver confermato la corretta anestesia con un pizzicotto del dito del piede, praticare un'incisione proprio sotto lo sterno.E usando le forbici, apri il petto tagliando il diaframma nelle costole. Quindi, piegare la parete toracica anteriore per esporre completamente il torace prima di praticare un taglio in corrispondenza dell'aorta discendente vicino all'arco aorta. Ora, trasferisci il cuore, i polmoni e il timo del topo in istidina-triptofano-chetoglutarato ghiacciato, o tampone HTK, per isolare gli organi.Esporre l'aorta rimuovendo il tessuto connettivo. Collega l'estremità dell'aorta a un ago calibro 22 e legalo con una sutura di seta 6-0. Assicurarsi che la cannula sia sopra la radice aortica, in modo da non interferire con la valvola aortica.Perfondere l'aorta per circa 10 minuti con 10 millilitri di tampone HTK, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius. A seconda del tipo di esperimento, conservare il cuore in una provetta da 50 millilitri con HTK ghiacciato per otto ore o eseguire immediatamente la profusione. Per eseguire la profusione, collegare il cuore montato sull'ago alla cannula nell'apparecchio di Langendorff e legarlo con una sutura di seta.Avviare la profusione in modalità a flusso costante a tre millilitri al minuto, quindi dopo essere passati a una modalità a pressione costante a 70-80 millimetri di mercurio, regolare la velocità di perfusione a circa sei millilitri al minuto. Quindi, collegare un palloncino in silicone sgonfio riempito d'acqua a un trasduttore di pressione e a una siringa piena d'acqua utilizzando un rubinetto a tre vie. Dopo 15-20 minuti di un periodo di equilibrio successivo alla perfusione precedente, tagliare l'atrio destro, o AR, e inserire il palloncino nel ventricolo destro, o RV, attraverso l'AR. Usa del nastro adesivo per tenere il palloncino all'interno del camper e riduci al minimo l'area aperta dell'AR per aiutare a vincolare il palloncino nel ventricolo.Dopo 20 minuti di raccolta dati funzionali per il ventricolo destro, tagliare l'atrio sinistro, o LA, e inserire un palloncino sgonfio pieno d'acqua nel ventricolo sinistro, o LV, attraverso il LA. Utilizzare del nastro adesivo per tenere il palloncino all'interno del LV.To calibrare il trasduttore di pressione, riempire prima una siringa da 10 millilitri con soluzione salina calda e collegare la siringa alla cupola attraverso un rubinetto a tre vie. Aprire il rubinetto e riempire lentamente la cupola con soluzione fisiologica prima di chiudere tutti i rubinetti e rimuovere la siringa. Quindi, collegare la cupola riempita al trasduttore collegando il manometro alla terza estremità del rubinetto a tre vie.Nel software di registrazione, dal menu a tendina del canale di collegamento al trasduttore, selezionare l'opzione Bridge Amp. Fare clic su 0 prima di avviare la registrazione per impostare la lettura del trasduttore a zero millimetri di mercurio. Dopo alcuni secondi di registrazione, spingere lentamente la siringa e aumentare la pressione a 100.Fare clic su Interrompi per terminare la registrazione. Nella finestra di dialogo Conversione unità, selezionare l'area di registrazione per zero millimetri di mercurio e fare clic sulla freccia fino a 1 prima di digitare zero millimetri di mercurio. Allo stesso modo, selezionare l'area di registrazione per 100 millimetri di mercurio.Fare clic sulla freccia fino a 2 e digitare 100 millimetri di mercurio. A questo punto, fare clic su OK per calibrare il trasduttore. Al termine della calibrazione, rinominare il canale corrispondente al trasduttore di pressione con il palloncino come Pressione ventricolare o Pressione LV e avviare la registrazione quando il cuore è collegato al sistema.Dopo aver inserito il palloncino nel ventricolo, regolare il volume d'acqua nel palloncino utilizzando una siringa micrometrica attraverso il rubinetto a tre vie per mantenere la pressione diastolica finale a 5-10 millimetri di mercurio. Quindi, rinominare un canale vuoto come dP/dt e mantenere il canale sorgente derivato come pressione del ventricolo. Questo canale registra il rapporto tra la variazione di pressione nella cavità ventricolare durante la contrazione.Selezionare il periodo di misurazione stabile prima di passare all'impostazione nel modulo della pressione sanguigna. Quindi, selezionare LV Pressure come canale di ingresso e fare clic su selezione prima di premere OK. A questo punto, fare clic su Visualizzazione classificatore per rimuovere eventuali cicli cardiaci anomali e su Visualizza tabella per generare le tabelle per la media dei dP/dt massimi e dei dP/dt minimi per il periodo selezionato. Quando il cuore del topo è stato conservato in tampone HTK per zero ore prima della perfusione, è stata registrata una pressione sistolica più elevata per il ventricolo sinistro rispetto al ventricolo sinistro. Inoltre, rispetto al ventricolo destro, il ventricolo sinistro ha anche mostrato una contrazione muscolare significativamente maggiore, così come il rilassamento.Tuttavia, quando la perfusione è stata eseguita sul cuore dopo averlo sottoposto a otto ore di conservazione a freddo, sia il ventricolo sinistro che il ventricolo destro hanno mostrato una significativa riduzione funzionale rispetto allo stadio di zero ore. Le diminuzioni sono state osservate essere più gravi nel ventricolo sinistro rispetto al ventricolo destro. La contrazione e il rilassamento del ventricolo sinistro dopo otto ore di conservazione sono stati del 25,1% e del 30,7% della funzione corrispondente alla conservazione a zero ore, mentre il RV ha mostrato il 32,5% e il 29,1% della funzione, rispetto alla linea di base a zero ore. L'indicazione di una disfunzione primaria del trapianto di ventricolo sinistro dopo una conservazione prolungata è risultata più significativa di quella del ventricolo destro. La qualità della conservazione dipende in gran parte dalla perfusione di HTK.È importante assicurarsi che la perfusione sia costante per confrontare con precisione i diversi trattamenti. Con una misurazione precisa della funzione di conservazione del cuore di un donatore, questo metodo può essere facilmente adattato ai farmaci di screening che possono migliorare la funzione cardiaca del donatore e quindi convalidare ulteriormente utilizzando un modello di trapianto eterotopico.

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Valutazione della funzione biventricolare murina ex vivo in un modello di Langendorff

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