Un dispositivo di terapia fotodinamica costruito internamente e basato su diodi emettitori di luce per migliorare la citotossicità delle verteporfine in un modello di coltura cellulare 2D

La terapia fotodinamica, PDT, offre diversi vantaggi al trattamento del cancro e la sua efficacia dipende da una fonte di luce per attivare un fotosensibilizzatore. Nonostante i recenti progressi nel campo, vi è una mancanza di accesso a un dispositivo costoso e riproducibile per PTD per modelli in vitro. Al fine di soddisfare questa domanda, questo lavoro descrive un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire saggi PDT su colture cellulari, chiamato PhotoAct.

Per iniziare la costruzione, ha visto tre millimetri di spessore pannelli in fibra a media densità, MDF, per ottenere pezzi con le seguenti dimensioni. Costruisci due scatole con le seguenti dimensioni. Forare il retro della scatola più grande per installare un connettore jack barile.

Perforare anche la parte superiore della scatola più grande, la parte superiore e la parte inferiore della scatola più piccola per fornire un passaggio per i cavi elettrici. Dipingi tutte le superfici interne con inchiostro nero per favorire un'incidenza della luce omogenea. Collegare in parallelo tre nastri LED con 10 LED ciascuno sulla superficie interna superiore della scatola più piccola.

Inoltre, installare un sensore di luminosità al centro della superficie interna inferiore della scatola più piccola. Stampa la struttura dell'unità di controllo utilizzando il file di stampa 3D supplementare. Installare tutti i componenti, il pulsante di accensione, i potenziometri, il touchpad di avvio del tempo, i LED, il sensore di luminosità, l'LCD, il cicalino e l'alimentatore e le parti di una scheda controller ESP-32 montata all'interno dell'unità di controllo.

Caricare il codice di programmazione disponibile in file supplementare ed eseguire un test per verificare che tutte le connessioni funzionino. Montare le scatole e fissarle insieme per evitare spazi vuoti e di conseguenza interferenze di illuminazione esterna e perdita immediata di luce. Collegare l'unità di controllo montata all'area forata nella parte superiore del prototipo.

Costruire una porta d'ingresso dello stesso materiale nelle seguenti dimensioni e fissarla sulla scatola esterna con cerniere e nastri Velcro per garantire la chiusura della camera e saggi ininterrotti. Installare anche una maniglia per manipolare la porta d'ingresso con facilità e precisione. Fissare quattro piedini in gomma nella parte inferiore del prototipo per garantire una maggiore stabilità durante le operazioni.

Coltivare la linea cellulare HeLa in Modified Eagle Medium low glucose di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di gentamicina. Conservare i palloni di coltura al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Gestire e ispezionare la coltura cellulare fino a raggiungere l'80-90% della confluenza.

Avviare il protocollo di vitalità cellulare con il processo di semina. Rimuovere il mezzo dal matraccio con coltura cellulare HeLa confluente. Lavare il matraccio con tampone fosfato salino, PBS, e staccare la coltura con tripsina seguendo i dettagli evidenziati.

Contare le cellule risospese con un emocitometro e seminarle in una micropiastra multi-pozzetto a concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto. Preparare due piastre per le condizioni di trattamento buio e luce e incubarle per 24 ore per l'attacco cellulare. Per procedere con il trattamento con un fotosensibilizzante, rimuovere il mezzo da entrambe le piastre e trattare le cellule con 100 microlitri di concentrazioni crescenti di Verteporfina.

Mantenere le cellule in trattamento per 24 ore per consentire l'internalizzazione della verteporfina. Dopo l'incubazione, rimuovere il trattamento, lavare le cellule con PBS e aggiungere terreno senza farmaci. Coprire una micropiastra con un foglio di alluminio per proteggerla dall'esposizione alla luce e incubarla per 24 ore.

Questa micropiastra offrirà dati di controllo per ulteriori analisi dei risultati PDT. L'altra micropiastra sarà utilizzata in condizioni di esposizione alla luce presso il PhotoAct. Per azionare l'apparecchiatura, collegarla alla presa e accenderla, premendo il pulsante di accensione.

Posizionare la micropiastra multipozzetto nella camera PDT e chiudere l'apparecchiatura fissando la porta frontale con i nastri Velcro laterali. Per impostare l'apparecchiatura, utilizzare i potenziometri per regolare la configurazione RGB dell'emissione luminosa. Premere il touchpad più/meno per regolare la configurazione dell'ora e impostare la durata del test.

Controllare se sul display sono visualizzate le informazioni corrette sul test e apportare le modifiche finali, se necessario. Premere il touchpad di avvio per avviare il test. Un cicalino a un segnale acustico deve essere sentito all'inizio dell'esperimento.

Durante l'esperimento, le informazioni sui progressi possono essere osservate sul display, come l'irradianza e il tempo rimanente. Non aprire lo sportello anteriore né modificare alcuna configurazione durante il test PDT. Alla fine del test, deve essere sentito un cicalino a quattro bip e il sistema elettronico spegnerà tutti i LED.

Un messaggio finito e la quantità finale di energia espansa durante l'esperimento possono essere osservati sul display. Il valore finale della fluenza viene calcolato in base all'equazione evidenziata. Coprire la micropiastra che ha subito l'esposizione alla luce e procedere con l'incubazione di 24 ore.

Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il mezzo da entrambe le piastre, lavare il monostrato di cellule con PBS e aggiungere la soluzione MTT. Incubare entrambe le placche in condizioni di buio e luce per quattro ore per consentire la formazione di cristalli di formazan. Rimuovere accuratamente la soluzione MTT e sciogliere i cristalli viola con una soluzione di DMSO ed etanolo.

Dopo la completa dissoluzione dei cristalli, effettuare la misura dell'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a 595 nanometri. Il prodotto finale è costituito da una camera buia con la sua superficie interna superiore dotata di un set di 30 diodi emettitori di luce diffusa, LED, programmati per emettere spettri distinti di luce visibile. Si stabilisce un'incidenza della luce omogenea grazie alla bassa riflettività delle superfici interne e alla distribuzione uniforme della configurazione dei LED.

L'interfaccia di installazione è user-friendly e la condizione sperimentale consolidata era riproducibile. Come prova di concetto, il dispositivo è stato utilizzato per migliorare l'effetto citotossico di Verteporfina in coltura cellulare HeLa 2D dopo l'esposizione alla luce. Come mostrato nella figura, il valore GI50 era 3,1 micromolare per la condizione di luce.

e 13,8 micromolari per la condizione di oscurità Pertanto, l'aumento di oltre quattro volte dell'efficienza confrontando le condizioni conferma l'uso di Verteporfin come fotosensibilizzatore e l'applicabilità di PhotoAct sui saggi PDT. Per convalidare l'uso del prototipo descritto in questo lavoro, è stato utilizzato un dispositivo PDT commerciale nelle stesse condizioni sperimentali, tra cui fotosensibilizzatore, celle e fluenza, e i risultati sono stati confrontati. Come mostrato nella figura, entrambi i dispositivi fotoattivarono Verteporfina allo stesso modo, migliorando l'effetto citotossico.

Infine, la morte cellulare mediata da ROS innescata da Verteporfina dopo l'esposizione alla luce è stata confermata mediante citometria a flusso utilizzando il test DCFDA. In sintesi, il dispositivo è stato facilmente costruito con componenti a basso costo disponibili in commercio con un costo totale inferiore a 50. Gli altri principali vantaggi del dispositivo includono la portabilità, la bassa richiesta di manutenzione, la capacità di irradiare più tipi di piastre di coltura, l'uso simultaneo di un massimo di quattro unità per test, l'irradiazione accurata e riproducibile, l'interfaccia di configurazione user-friendly e semplice che non richiede la connessione a computer o altre macchine.

Inoltre, viene presentato un diagramma di flusso decisionale per fornire un approccio sistematico alla risoluzione dei problemi per trovare e correggere problemi o errori durante l'operazione. Questi risultati permettono di estendere i benefici di PhotoAct per facilitare la PDT alla ricerca scientifica, esplorando il meccanismo d'azione dei fotosensibilizzatori e le loro applicazioni cliniche.