Test preclinici di farmaci in tessuti muscolari ingegnerizzati 3D scalabili

La nostra piattaforma utilizza tessuti muscolari ingegnerizzati 3D e hardware di rilevamento magnetico per misurare la contrattilità su 24 pozzetti contemporaneamente. Ciò fornisce un metodo di produttività più elevato per valutare nuove terapie in vitro utilizzando tessuti muscolari umani. Il nostro metodo di fusione migliora la coerenza e la riproducibilità nella fabbricazione di tessuti muscolari ingegnerizzati in 3D.

Abbiamo progettato una piastra di colata consumabile a 24 pozzetti dotata di hardware di rilevamento magnetico per misurazioni e analisi della contrattilità sulla nostra piattaforma. Questo metodo può fornire preziose informazioni sulla modellizzazione in vitro della malattia, sulla scoperta di farmaci e sulla terapia genica per qualsiasi malattia muscolare che colpisce la contrattilità. Attualmente stiamo incorporando i motoneuroni nei nostri costrutti 3D per creare anche un modello di giunzione neuromuscolare.

Per iniziare, posizionare un kit di fusione di tessuto pre-refrigerato su un blocco freddo o ghiaccio all'interno del cappuccio di coltura cellulare. Appoggiare la piastra di colata piatta sul ghiaccio. Aggiungere trombina al mezzo di base per ottenere la soluzione di trombina e spostare il reticolo post dalla piastra di colata a una nuova piastra sterile a 24 pozzetti.

Pipettare 50 microlitri di soluzione di trombina in ciascun pozzetto pre-raffreddato della piastra di colata e riposizionare il reticolo sul kit. Mettere da parte il kit di fusione sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 500 millilitri di mezzo RPMI, 10 millilitri di B27 e 2,5 grammi di acido aminocaproico, o ACA, per preparare il mezzo EMT cardiaco.

Estrarre il mezzo EMT che verrà utilizzato per lanciare i tessuti e aggiungere 10 inibitori micromolari ROCK ad esso. Preparare il mezzo EMT scheletrico aggiungendo 50 millilitri di terreno F10 e 0,25 grammi di acido aminocaproico, o ACA, per i mioblasti primari. Utilizzare 0,1 grammi di ACA per mioblasti derivati da IPSC.

Quindi, filtrare sterile il mezzo di colata contenente ACA. Riscaldare il reagente di dissociazione di grado di coltura cellulare e un volume uguale di EMT medio a 37 gradi Celsius. Questo mezzo EMT riscaldato sarà utilizzato per diluire il reagente di dissociazione.

Lavare le cellule con PBS e aggiungere il reagente di dissociazione riscaldato per sollevare le cellule. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando le cellule si sono sollevate e controllare le colture ogni due o tre minuti toccando il lato della piastra. Una volta che le cellule si sono sollevate, trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri.

Triturare con una pipetta P-1000 per garantire una sospensione a cella singola. Lavare la piastra e il pallone con un ulteriore mezzo EMT per raccogliere le celle rimanenti e aggiungerle al tubo conico. Ancora una volta, triturare le cellule per garantire una sospensione a singola cellula.

Aggiungere il mezzo EMT per terminare il processo di dissociazione e quindi prelevare campioni delle sospensioni cellulari per la conta cellulare. Eseguire la conta delle cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro in tripano blu. Ruotare le cellule a 200 G per quattro minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri del mezzo base EMT per rimuovere il reagente di dissociazione residuo.

Dopo aver centrifugato nuovamente per quattro minuti, aspirare il surnatante e preparare le sospensioni cellulari alle densità appropriate. Calcolare i volumi di ciascuna soluzione cellulare necessaria per comporre il numero desiderato di tessuti e pipettare i volumi calcolati di cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere 10 microlitri di fibrinogeno per EMT alla sospensione cellulare e posizionarla sul ghiaccio.

Assicurarsi che ogni EMT abbia 90 microlitri di sospensione cellulare, 10 microlitri di fibrinogeno e 50 microlitri di soluzione di trombina nel costrutto tissutale finale. In una cappa di coltura cellulare, rimuovere il coperchio del kit di fusione del tessuto e posizionare la piastra di colata con il reticolo post disteso sul ghiaccio. Mescolare la miscela di fibrinogeno cellulare e aspirare 100 microlitri con una pipetta P-200.

Aggiungere 100 microlitri della miscela ai pozzetti preparati con 50 microlitri di soluzione di trombina e triturare cinque volte per mescolare bene. Non spingere la pipetta oltre il primo stop e rimuovere la punta dopo la triturazione per evitare di creare bolle. Mescolare la sospensione cellulare nel tubo conico prima di colare ogni tessuto.

Tenere contemporaneamente il reticolo e la piastra del pozzo di lancio usando il dito puntatore e il pollice di una mano per evitare qualsiasi movimento del reticolo o lasciare la piastra piatta sul ghiaccio e scuotere il secchiello del ghiaccio per vedere nella piastra di fusione. Ripetere con una punta P-200 fresca per ogni tessuto fino a quando tutti i tessuti sono fusi. Trasferire con cura il kit seminato nell'incubatore e incubare a 37 gradi Celsius per 80 minuti.

Quindi, preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con due millilitri per pozzetto del mezzo EMT per i tessuti cardiaci e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per riscaldare il mezzo. Dopo l'incubazione di 80 minuti, aggiungere delicatamente un millilitro di mezzo EMT sul bordo dei pozzetti di colata e incubare per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti di incubazione, sollevare con attenzione il reticolo post e trasferire i tessuti dalla piastra di colata a una piastra a 24 pozzetti preparata con il mezzo riscaldato.

Infine, riportare le piastre con i tessuti all'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius. La produzione di EMT infruttuosa può variare da guasti catastrofici come il distacco del tessuto dai pali, a difetti strutturali più sottili come bolle d'aria e deposizione di tessuto diseguale attorno a entrambi i pali. Il costrutto EMT un giorno dopo il casting è mostrato qui.

I tessuti muscolari scheletrici sono stati trasferiti in un mezzo di differenziazione a partire dal giorno zero della fusione cellulare e della compattazione dell'idrogel. Dal settimo giorno al giorno 28, lo stesso EMT ha mostrato una lunghezza complessiva leggermente più corta tra i due pali e una larghezza minore se misurata attraverso la sezione centrale dell'EMT. Quattro piastre di tessuti sono state monitorate per 21 giorni confrontando il diametro EMT durante la compattazione.

I punti temporali mostrano dimensioni EMT coerenti tra le piastre. La compattazione massima viene raggiunta il giorno 21 quando il rimodellamento della matrice viene stabilizzato. L'immunoistochimica degli EMT è raffigurata qui.

Gli EMT sono stati fissati il giorno 10 della cultura e incorporati nella paraffina. Le sezioni trasversali sottili sono state colorate con anticorpi contro la catena pesante della miosina e la distrofina prima dell'imaging. Queste immagini grafiche rappresentano la forza di contrazione assoluta media misurata dagli EMT cardiaci e dagli EMT scheletrici nel tempo.

Il trattamento con doxorubicina acuta e cronica nei tessuti cardiaci ingegnerizzati è mostrato qui. Tre diverse concentrazioni di dose di Dox sono state somministrate in bolo o somministrate continuamente ai tessuti cardiaci ingegnerizzati nel corso di 27 giorni. La risposta alla dose di BDM nei tessuti muscolari scheletrici ingegnerizzati è presentata in questa figura.

La frequenza del battito cardiaco o la frequenza delle contrazioni cessa in modo dose-dipendente in tandem con una cessazione della forza contrattile che indica cardiotossicità quando gli EMT sono esposti a questo composto. Le cose più importanti da ricordare quando si colano i tessuti sono di mantenere tutto freddo in ogni momento, comprese le sospensioni cellulari e i reagenti e di mantenere il reticolo post completamente fermo una volta iniziata la fusione.