Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani

Il protocollo qui dimostrato consente la marcatura e l'isolamento di specifiche linee cellulari presenti nei follicoli ovarici a partire dalle prime fasi antrali, consentendo così l'analisi e la coltura ad alta risoluzione. Questo approccio altamente preciso utilizza combinazioni di anticorpi coniugati fluorofori per colpire i marcatori di superficie cellulare che sono espressi in modo robusto e specifico tra le linee discrete di granulosa, stroma e teca. Inizia posizionando l'ovaia in una capsula di Petri sterile e versa un mezzo refrigerato con esso per idratare il tessuto, assicurandoti che l'ovaio sia semi-immerso nel mezzo.

Rimuovere eventuali punti di sutura o altro materiale e sezionare il tessuto circostante residuo lontano dall'ovaio. Per isolare i follicoli antrali, identificare i singoli follicoli e scegliere follicoli sani. Escludere eventuali follicoli pieni di sangue, scuri o non simmetrici.

Isolare i follicoli antrali scelti dall'ovaio usando bisturi, mantenendo intatto l'antro e asportando il tessuto corticale che comprende il follicolo. Posizionare ciascun follicolo antrale intatto asportato in un pozzetto della piastra a sei pozzetti. Utilizzando un righello posto sotto il piatto, determinare il diametro del follicolo a scopo descrittivo.

Utilizzando un bisturi, tagliare in due il follicolo antrale intatto per valutare la cavità antrale e aggiungere sei millilitri di mezzo di distacco di cellule enzimatiche prima di incubare la piastra in un incubatore umidificato per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere sei millilitri di terreno disponibile contenente il 20% di siero bovino fetale, o FBS, e lavare con il terreno mediante ripetuti pipettaggi vigorosi sui follicoli bisecati con una micropipetta P-1000. Quindi, raccogliere il mezzo e passarlo attraverso un filtro da 100 millimetri.

Dopo aver centrifugato il surnatante filtrato a 300 G e quattro gradi Celsius per tre minuti prima, aspirare il surnatante. Mettere il tessuto rimanente in una miscela di 100 unità per millilitro di collagenasi e un'unità per millilitro di dispasi diluita in una soluzione salina bilanciata prima di 30 minuti di incubazione. Interrompere meccanicamente il tessuto triturando e pipettando vigorosamente due volte dopo 10 e 20 minuti.

Una volta fatto, recuperare il tessuto e lavare tramite pipettaggio, attraverso una punta di micropipetta P-1000 e filtrare attraverso un filtro da 100 millilitri. Centrifugare il tessuto teso a 300 G e quattro gradi Celsius per tre minuti prima di mettere il pellet cellulare arricchito con le cellule theca e le cellule stroma su ghiaccio per l'etichettatura e FACS. Per identificare le cellule della granulosa e le cellule della teca, risospendere i pellet cellulari in una soluzione bloccante contenente anticorpi direttamente coniugati e incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo aver lavato e centrifugato le cellule, risospendere le cellule in tampone FACS contenente 4-6 diamidino-2-fenilindolo, o DAPI, ed eseguire la sospensione cellulare attraverso uno strumento FACS per catturare una piccola popolazione di cellule, utilizzando l'intensità fluorescente degli anticorpi coniugati fluorofori per il gating. Bisecare il resto dell'ovaio. Asportare il midollo usando forbici sottili e bisturi curvi, evitando danni alla corteccia ovarica.

Continuare l'elaborazione e l'assottigliamento della corteccia ovarica raschiando delicatamente fino a quando rimane un midollo minimo. Dividere il tessuto corticale in strisce larghe da due a tre millimetri lungo la lunghezza dell'ovaio. Per il congelamento del tessuto ovarico, inserire una striscia corticale in ciascun flaconcino criogenico refrigerato contenente la soluzione congelante.

Agitare i flaconcini criogenici contenenti le strisce corticali su una piastra rotante per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Nucleato formazione di cristalli di ghiaccio toccando ogni flaconcino di crio con una punta di cotone brevemente immersa in azoto liquido. Le cellule ovariche sono state raccolte e le frazioni cellulari sono state selezionate dai follicoli antrali FACS a oltre il 95% di purezza.

CD99 specificamente marcato cellule granulosa in PVRL1, o nectina, era sempre più localizzato nel compartimento cellulare della granulosa dell'oophorus man mano che i follicoli antrali aumentavano di dimensioni. Si è visto che gli anticorpi contro l'endoglina o CD55 demarcavano specificamente tutte le cellule dello stroma e della teca e che l'alanina aminopeptidasi era specificamente espressa dalle cellule androgene della teca. Le cellule sono state marcate con un anticorpo diretto contro CD99 per identificare le cellule della granulosa e gli anticorpi contro CD45 sono stati utilizzati per escludere le cellule ematopoietiche.

Gli anticorpi contro PVRL1 hanno separato la popolazione cellulare della granulosa in compartimenti oophorus e murali. Dopo la digestione enzimatica con collagenasi dispasi, i preparati cellulari marcati con anticorpi contro CD55, CD34 e alanina aminopeptidasi hanno permesso la cattura di tutte le cellule stroma o teca o cellule androgene di teca con l'esclusione delle cellule endoteliali dalle popolazioni di cellule teca. Prestare particolare attenzione per evitare di interrompere l'antro dei follicoli durante l'isolamento iniziale del follicolo tagliando entro un margine di sicurezza attorno ai bordi del follicolo.

A valle di questa procedura, le cellule possono essere utilizzate per analisi molecolari o diagnostiche o in alternativa coltivate in vitro per studi tossicologici, analisi sperimentali o ricapitolazione del microambiente follicolare. Ad oggi, questi metodi sono stati utilizzati per modellare i disturbi endocrini che coinvolgono l'ovaio e per identificare nuove sottopopolazioni di cellule associate al follicolo.