In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

La tecnologia di silenziamento epigenetico che abbiamo sviluppato appartiene a un'arena più ampia di tecnologie, che sono le tecnologie di silenziamento genico. Prima di iniziare a sviluppare la necessità di silenziamento epigenetico, c'erano due molte alternative nel campo. Uno è il knock-down genico per interferenza dell'RNA, e l'altro era la distruzione genica da parte delle nucleasi artificiali.

E la distruzione genica da parte delle nucleasi artificiali funziona a livello del DNA. Quindi hai il tuo gene bersaglio che vuoi inattivare e fornisci alla cellula alcune nucleasi artificiali, che inducono una doppia rottura della stringa. Questo tipo di rottura della doppia stringa può eseguire la somma degenerazionale, la mutazione frameshift, che alla fine impone o la degenerazione della proteina non funzionale, o contemporaneamente la degradazione trascrizionale.

Quindi il silenziamento epigenetico funziona veicolando la cellula, i cosiddetti repressori di trascrizione ingegnerizzati. Si tratta di alcune piccole proteine che sono in grado di legarsi al DNA bersaglio, per poi imporsi solo sul gene bersaglio, il cosiddetto marx epigenetico. Si tratta di alcune modificazioni chimiche che, una volta depositate sul DNA, possono portare alla compattazione della cromatina.

La compattazione della cromatina porta quindi all'inibizione della trascrizione, quindi non si ha più l'espressione del gene bersaglio. E, cosa molto importante, questo tipo di stato repressivo della trascrizione può essere prolungato dalle cellule. Per identificare le linee cellulari che esprimono il gene bersaglio da silenziare, sfogliare il gene bersaglio in The Human Protein Atlas e navigare attraverso la sezione Linea cellulare per identificare le linee cellulari rappresentative del tessuto somatico di interesse.

Dalle linee cellulari identificate, dare priorità a quelle per le quali sono disponibili protocolli di rilascio genico transitorio efficienti. Successivamente, aprire un visualizzatore genico e identificare la regione del gene bersaglio per integrare la cassetta di espressione del fluoroforo. Quindi usa CHOPCHOP per identificare e selezionare GNRA, che taglierà nella regione bersaglio nel primo introne del gene Beta-2M.

Successivamente, progettare un modello di donatore per il sito di taglio GNRA, costituito da un braccio di omologia sinistro, una cassetta di espressione di transgeni liberi da promotore e un braccio di omologia destra. Fornire il sistema di nucleasi CRISPR Cas9 e il modello del donatore all'interno della linea cellulare K-562 attraverso la nucleofezione, secondo le istruzioni del produttore. Coltiva le cellule K-562 per almeno 14 giorni.

Monitorare i livelli di espressione del reporter fluorescente nel tempo utilizzando un citometro a flusso. Attivare il canale dell'erina FICO per misurare l'intensità di fluorescenza del reporter tdTomato. Sfoglia il gene bersaglio nell'UCSC Genome Browser ed estrai la sequenza nucleotidica delle regioni che potenzialmente regolano la sua attività trascrizionale, come le isole CpG e i siti arricchiti per l'acetilazione di H3K27.

Incolla le sequenze selezionate nello strumento online CHOPCHOP e seleziona la repressione come scopo dei GNRA da recuperare. CHOPCHOP fornirà un elenco di GNRA mappati sulla sequenza genetica di interesse ed elencati in base a un punteggio, considerando il numero di corrispondenze fuori bersaglio e l'efficienza prevista sul bersaglio. Selezionare almeno 10 GNRA per sequenza di destinazione.

Provare a selezionare GNRA che coprano l'intera regione da integrare senza corrispondenze complete con altre sequenze intergeniche in tutto il genoma. Dopo aver trasformato i plasmidi che codificano per l'ETRS in cellule di E.coli chimicamente competenti, esaminare le colonie per la presenza del plasmide portante dell'ETR mediante digestione dell'enzima di restrizione e sequenziamento di Sanger. Per clonare i GNRA all'interno della spina dorsale di phU6 GNRA, in primo luogo, generare oligo utilizzando un software di progettazione di biologia molecolare.

Aggiungere una sequenza di cinque nucleotidi a monte del proto spaziatore ed etichettare questo oligo lungo 25 nucleotidi. Allo stesso modo, aggiungere una sequenza di cinque nucleotidi del complemento inverso del proto spaziatore e una citosina a valle di esso, per generare un oligo lungo 25 nucleotidi ed etichettarlo. Ottenere questi oligo sintetizzati come oligo di DNA a singolo filamento privi di sali risospesi in acqua a 100 micromolari.

Aggiungere un microlitro di ciascun oligo a due microlitri di tampone di ricottura e 16 microlitri di acqua. Eseguire l'oligoricottura ponendo la soluzione in un termociclatore a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi raffreddare gradualmente a 25 gradi Celsius per 45 minuti.

Diluire un microlitro degli oligo ricotto con 99 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi legare un microlitro di questa diluizione con 50 nanogrammi di plasmide phU6 GNRA, precedentemente digerito con l'enzima di restrizione Bsa1. Trasformati 20 microlitri di cellule di E.coli chimicamente competenti con due microlitri di prodotto di legatura.

Scegliere più colonie per la produzione di DNA plasmidico e confermare il successo della clonazione del proto spacer mediante sequenziamento Sanger. Per fornire i DTR basati su GNRA e CRISPR dCas9 nella linea cellulare reporter in array, in primo luogo, preparare provette separate contenenti 500 nanogrammi di ciascuno dei plasmidi e aggiungere 125 nanogrammi di diversi plasmidi codificanti GNRA da testare. Includere una condizione di nucleofezione priva di GNRA ed ETR come campione trattato con simulazione.

Preparare almeno tre repliche tecniche per campione. Pellet cinque volte 10 alla quinta cellula Beta-2M tdTomato K-562 per provetta e nucleoffettare loro con la miscela plasmidico. Risospendere le cellule in 200 microlitri di terreno di coltura cellulare di mammifero RPMI 1640 precedentemente riscaldato e posizionarle nell'incubatrice.

Utilizzare la citometria a flusso per misurare la percentuale di cellule silenziate in diversi momenti dopo la consegna degli ETR. Utilizzare celle di tipo selvaggio senza la sequenza di rivestimento Flora 4. Consente di impostare la soglia di celle reporter negative.

Utilizzare il campione trattato in modo simulato per impostare il gate per le celle positive reporter. Identificare i primi tre GNRA in termini di efficienza di silenziamento a lungo termine. Utilizzare i fatti per selezionare le sottopopolazioni reporter negative mantenute stabilmente in quei campioni.

Eseguire anche i fatti dei campioni trattati simulati con lo stesso trattamento per consentire un corretto confronto nelle analisi successive. Un reporter fluorescente tdTomato è stato integrato nel primo introne del gene Beta-2M umano mediante riparazione diretta alla tomoologia indotta da CRISPR Cas9. Le cellule K-562 reporter positive compaiono nel campione trattato dopo l'integrazione.

Dopo la somministrazione transitoria della combinazione tripla ETR, insieme ai GNRA, è stata eseguita un'analisi di citometria a flusso longitudinale per valutare l'espressione del reporter fluorescente. È stato osservato un picco nella repressione del reporter alle analisi acute, che è stata parzialmente riassorbita a causa della diluizione mitotica dei plasmidi codificanti ETR nel tempo. L'efficace deposizione della metilazione di CpG sul locus bersaglio da parte della combinazione GNRA dell'ETR è stata evidente dalla repressione permanente del reporter in una frazione considerevole di cellule trattate.

Diversi GNRA hanno mostrato un'efficienza di silenziamento variabile a lungo termine. Uno dei passi più importanti per ottenere un silenziamento permanente ed efficiente dell'epigenoma è l'identificazione di un singolo gRNA efficace. Per fare ciò, qualsiasi tipo di applicazione, deve iniziare con l'identificazione delle sequenze più reattive, tra cui promoter e answer in eventuali altri siti per regolatori trascrizionali.

Una volta identificata quale potrebbe essere la regione più reattiva ed efficace, chiunque dovrebbe progettare diversi tipi di gRNA singolo, un test come singolo o combinazione di gRNA singolo. Una delle applicazioni più ovvie dell'editing dell'epigenoma è sicuramente la traduzione preclinica in qualsiasi guadagno di mutazione funzionale, in cui il silenziamento di questo gene potrebbe essere utile per curare specifiche malattie. In alternativa, dovremmo comunque tenere a mente che la capacità di modificare in modo specifico la regolazione epigenetica di un dato promotore potrebbe essere uno strumento super utile sia per la scienza clinica che per la scienza traslazionale di base.