Name: Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e limaging 3D di organoidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi utilizzando piastre microtesturizzate compatibili con la microscopia confocale. Questo metodo facilita lo screening farmacologico e la ricerca sul cancro.

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La ricerca è supportata dal progetto CALIPSO sostenuto dalla National Research Foundation, Ufficio del Primo Ministro, Singapore, nell'ambito del suo programma Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. riconosce il supporto dello sperimentatore NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding e ANR ADGastrulo. A.B. e G.G. riconoscono il sostegno del finanziamento di base dell'MBI. A.B. riconosce Andor Technologies per il prestito del microscopio BC43.

NOTA: La prima parte di questo protocollo descrive in dettaglio la microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare. Uno stampo primario originale con cavità piramidali può essere prodotto internamente - se sono disponibili strutture di micro-fabbricazione - o esternalizzato a società esterne. Lo stampo primario utilizzato in questo lavoro è prodotto internamente, con fasi del processo di fabbricazione descritte altrove11,13. Un protocollo di base per la microfabbricazione dello stampo è disponibile nel file supplementare 1. CRITICO: Le operazioni nelle fasi da 1 a 6 devono essere condotte in un ambiente privo di polvere. Una cappa a flusso laminare o una camera bianca, se disponibile, sono preferibili. In tutti questi passaggi, è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI), come guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
1. Dadini di muffa PDMS
<ol><li>Tagliare piccole porzioni dello stampo PDMS fino alla dimensione richiesta per il dispositivo finale (ad esempio, 1 cm x 1 cm [Figura 1B]). Tagliarli parallelamente alle direzioni XY dell'array. CRITICO: Quando si taglia lo stampo PDMS in dadi da 1 cm x 1 cm, eseguire i tagli in singoli passaggi; utilizzando una lama di rasoio unilaterale, applicare pressione e tagliare il PDMS in un unico passaggio. Questo per prevenire la formazione di piccole particelle di PDMS, che possono depositarsi sulla superficie dello stampo e influire sulla qualità delle fasi di replica (fase 3).</li>
</ol>2. Preparazione di substrati PDMS piatti
<ol><li>Pesare ~ 15-20 g di resina base PDMS e 1,5-2 g del suo agente reticolante (cioè un rapporto di 10: 1), mescolarli accuratamente e degassare in un barattolo sottovuoto per ~ 20 minuti.</li>
	<li>Versare lentamente il PDMS degassato su una capsula di Petri di plastica larga 15 cm (diametro).</li>
	<li>Polimerizzare il PDMS mantenendo la piastra di Petri in forno impostato a 65°C per 2 ore. Dopo aver atteso il completamento della polimerizzazione, un film PDMS piatto di ~ 1,5 mm di spessore (contenuto nella capsula di Petri) è pronto per l'uso (Figura 2A).</li>
	<li>Utilizzando una lama affilata, tagliare pezzi di 2 cm x 2 cm dal PDMS (Figura 2B-D). NOTA: lo spessore esatto di questo foglio PDMS non è critico; ~ 1-2 mm è un intervallo adatto. La dimensione per il taglio dovrebbe essere maggiore dello stampo strutturato ma non molto più grande, il che comporterebbe uno spreco di materiale.</li>
</ol>3. Produzione dello strato testurizzato in adesivo polimerizzabile UV
<ol><li>Posizionare un dado di stampo PDMS (come preparato al punto 1) a faccia in giù sopra il taglio PDMS piatto (come preparato al punto 2) (Figura 3A,B). NOTA: assicurarsi che le sporgenze piramidali nello stampo siano orientate verso il substrato PDMS piatto e che solo la superficie superiore delle piramidi troncate sia in contatto. Valutare il posizionamento corretto con un microscopio ottico (Figura 3C,D).</li>
	<li>Su un lato dello stampo, usando una pipetta, far cadere una piccola quantità (due gocce, circa 0,1-0,2 ml) di adesivo polimerizzabile UV (Figura 4A). NOTA: Quando il liquido entra in contatto con il bordo dello stampo, la capillarità guiderà il liquido a riempire la cavità tra lo stampo stesso e il taglio piatto di PDMS utilizzato come substrato.<ol><li>Seguire la progressione del liquido all'interno della cavità, ad esempio, utilizzando un microscopio ottico invertito con un obiettivo di ingrandimento 10x (Figura 4B,C).</li>
	</ol></li>
	<li>Esporre l'adesivo polimerizzabile UV alla luce UV per polimerizzarlo. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata (ad esempio, una scatola UV-LED con una densità di potenza di 35 mW / cm 2;2 min al 50% di potenza in questo protocollo per polimerizzare completamente l'adesivo).</li>
	<li>Utilizzando la quantità eccessiva di adesivo su un bordo, tenere l'adesivo polimerizzato sul substrato PDMS piatto premendo delicatamente con un dito (Figura 5A,B). Nel frattempo, utilizzare una pinzetta per pizzicare un angolo dello stampo vicino allo stesso bordo tenuto premuto e staccarlo lentamente assicurandosi che anche il film strutturato non venga sollevato. NOTA: La Figura 5C mostra il risultato di una corretta procedura di rimozione dello stampo; La figura 5E-G mostra la procedura errata.</li>
	<li>Tagliare l'adesivo in eccesso e il substrato PDMS in eccesso utilizzando una lametta per lasciare lo strato adesivo polimerizzato e testurizzato piatto sul PDMS con PDMS in eccesso su un solo bordo (Figura 5D), che sarà necessario nel passaggio 5.</li>
</ol>4. Preparazione del substrato di copertura
NOTA: Come substrato per il dispositivo finale, vengono utilizzati coprivetrini standard arrotondati 1,5H con diametro di 25 mm. Prima di poter essere utilizzati, devono essere puliti per rimuovere polvere e / o residui organici dalla loro superficie.
<ol><li>Pulizia del coprislip<ol><li>Immergere i coperchi in acqua saponata per 5 minuti durante l'applicazione degli ultrasuoni (40 kHz, 110 W di potenza sonica).</li>
		<li>Lavare i vetrini di copertura in acqua deionizzata pulita (DI), prima per immersione e infine con acqua corrente DI da un rubinetto. Asciugare i coperchi con una pistola a gas N2 .</li>
		<li>Immergere le copertine in un bagno di acetone per 5 minuti; passare immediatamente a un bagno di 2-propanolo (IPA) per altri 5 minuti.</li>
		<li>Risciacquare i coprivetrini con alcool isopropilico pulito usando un flacone da spremere. Asciugare i coperchi con la pistola a gas N2 . NOTA: I coprivetrini puliti con questa procedura possono essere conservati in un contenitore chiuso fino al momento del bisogno. Conservali in un armadio asciutto per evitare che l'umidità si depositi sulla loro superficie.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando è pronto per essere utilizzato, trattare un coprislip pulito con un breve processo al plasma O 2 per migliorarne l'idrofilia: O2 20 sccm, pressione 3 mbar, 60 W al generatore di corrente RF e durata 60 s.</li>
	<li>Subito dopo l'attivazione del plasma, procedere con lo spin-coating del sottile strato di adesivo polimerizzabile ai raggi UV posizionando il coprislip sul mandrino sottovuoto di uno spin-coater standard e versando una piccola goccia di adesivo al centro del vetrino (Figura 6). Eseguire il processo di spin-coating: stesura per 5 s a 500 giri/min, rivestimento a 3.000 giri/min per 45 s (con accelerazione e decelerazione impostate a 100 giri/min).<ol><li>Se lo spin-coating non è disponibile, utilizzare il seguente modo alternativo per produrre un film sottile di adesivo UV sui vetrini:<ol><li>Su un vetrino pulito, far cadere ~0,1 mL di adesivo polimerizzabile UV usando una pipetta (Figura 7A).</li>
			<li>Prendere un secondo coprivetrino e posizionarlo sopra il primo per far sì che l'adesivo liquido si diffonda uniformemente tra i due vetrini (Figura 7B-D).</li>
			<li>Una volta che l'adesivo spalmabile ha raggiunto i bordi dei vetrini, separarli delicatamente facendo scorrere uno sull'altro. Una volta separati, entrambi i vetrini sono completamente rivestiti con un sottile strato di adesivo liquido (Figura 7E). NOTA: Il rivestimento potrebbe non essere uniforme e liscio solo se la separazione non viene eseguita con un movimento regolare e continuo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Prestampaggio di adesivo polimerizzabile UV<ol><li>Dopo lo spin-coating, pre-stampare l'adesivo mediante esposizione ai raggi UV. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata (qui, è stata utilizzata una scatola UV-LED con una densità di potenza di 35 mW / cm2 per 1 minuto al 50% di potenza). CRITICO: L'adesivo utilizzato qui è una colla ottica. Vedi la discussione per i punti chiave relativi alle dosi energetiche per la sua cura.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Trasferimento del film testurizzato sul substrato finale
<ol><li>Prendere una delle pellicole testurizzate, preparate al punto 3) e metterla a contatto con il coprislip rivestito con adesivo (preparato al punto 4). Assicurarsi che il contatto tra l'adesivo parzialmente polimerizzato sul vetrino e il film testurizzato sia il più uniforme possibile (Figura 8A-C). CRITICO: In questa fase, l'adesivo sul coprislip dovrebbe essere abbastanza solido da evitare il riflusso, che riempirebbe le cavità piramidali del film testurizzato quando messo a contatto, ma anche essere abbastanza plastico e adesivo da poter ottimizzare il contatto premendo delicatamente sul film testurizzato.</li>
	<li>Esporre i vetrini alla luce UV fino a quando lo strato adesivo rivestito sul vetrino non è completamente polimerizzato. Ciò sigillerà il film testurizzato sul coprislip e fornirà un isolamento a prova di perdite tra le cavità piramidali.</li>
	<li>Infine, staccare il substrato piatto PDMS (Figura 8D-F). Utilizzando una pinzetta, pizzicare il PDMS su un angolo del bordo in cui è stato lasciato il materiale in eccesso dopo il taglio (passo 3.5). In questo modo, lo strato di pellicola testurizzata viene lasciato adesivo al coprivetrino con accesso aperto nella parte superiore per la semina cellulare. CRITICO: Quando si stacca il PDMS piatto, il film testurizzato deve rimanere ben attaccato al vetrino. I fallimenti di adesione sono facilmente confermati se la pellicola testurizzata può essere staccata dal vetrino dopo l'esposizione finale ai raggi UV senza alcuno sforzo.</li>
</ol>6. Passivazione a lungo termine del copricostume della coltura cellulare per la coltura cellulare
NOTA: La passivazione si ottiene generando un rivestimento conforme e continuo di un copolimero biomimetico con una struttura simile al gruppo polare dei fosfolipidi nella membrana cellulare. Questo rivestimento conforme impedisce l'adesione delle cellule al dispositivo di coltura cellulare
<ol><li>Preparare una soluzione con 0,5% (p/v) del copolimero biomimetico disciolto in etanolo puro. Conservare la soluzione a 4 °C per un uso futuro.</li>
	<li>Posizionare il coprifoglietto della coltura cellulare in una capsula di Petri da 35 mm e coprirlo completamente con la soluzione di copolimerio biomimetico.</li>
	<li>Dopo 5 minuti, rimuovere il coprislip di coltura cellulare dal contenitore con la soluzione di copolimerio biomimetico e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente all'interno del piatto finale in una cappa di biosicurezza (>1 h). NOTA: Un rivestimento più spesso può essere prodotto aumentando la concentrazione del copolimero biomimetico nella soluzione di rivestimento; i risultati di un rivestimento più spesso sono visibili al microscopio a campo chiaro (Figura 9A).</li>
</ol>7. Semina cellulare
<ol><li>Degasaggio e sterilizzazione<ol><li>Poco prima della semina cellulare, erogare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) nelle piastre di coltura cellulare (tipicamente 1 ml per una capsula di Petri da 35 mm). Degasare il piatto con il PBS sterile utilizzando un dispositivo ad ultrasuoni per ~ 10 minuti, seguito da diversi cicli di pipettaggio per rimuovere tutte le bolle. CRITICO: Se l'aria è intrappolata all'interno delle cavità piramidali, impedirà alle cellule di entrarvi. Per assicurarsi che non ci sia aria intrappolata nella piramide prima della semina cellulare, si raccomanda di garantire visivamente (sotto un microscopio a campo chiaro da banco con ingrandimento 10x o 20x) l'assenza di aria in queste cavità (Figura 10).</li>
		<li>Sostituire il PBS con terreno di coltura sterile e sterilizzare la piastra con luce UV per 30 minuti sotto un cappuccio di coltura cellulare. NOTA: Da questo passaggio in poi, il piatto deve essere considerato sterile e manipolato utilizzando tecniche sterili. Un modo alternativo per rimuovere l'aria intrappolata dal dispositivo di coltura cellulare è utilizzare un barattolo sottovuoto con una pompa per vuoto.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sospensione cellulare NOTA: Le cellule possono essere seminate come aggregati a cella singola o piccola ed entrare nei pozzetti del campione attraverso l'apertura superiore. Nel corso del tempo, le cellule inserite si aggregano e crescono all'interno dei pozzetti campione in sferoidi di dimensioni maggiori della dimensione dell'apertura. Come modelli di linee cellulari convalidati, utilizzare cellule tumorali HCT116 (CCL-247 ATCC) o MCF7 (HTB-22 ATCC) mantenute nel terreno di coltura raccomandato (linee guida ATCC).<ol><li>Preparare una sospensione cellulare (ad esempio, utilizzando un processo di tripsinizzazione seguendo le linee guida ATCC). Seguire le raccomandazioni sulla preparazione della tripsinizzazione / sospensione cellulare per le cellule di interesse.</li>
		<li>Contare e regolare la concentrazione cellulare a 0,5 × 106 cellule/ml nel terreno di coltura raccomandato.</li>
	</ol></li>
	<li>Erogazione cellulare<ol><li>Rimuovere il tampone PBS dal piatto di coltura cellulare da 35 mm e quindi erogare 1 mL della sospensione cellulare regolata. Vedere la Figura 11A per un'immagine al microscopio ottico di una procedura di semina cellulare con adeguata densità e omogeneità cellulare.</li>
		<li>Rimettere il piatto di coltura cellulare nell'incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2 e 100% umidità) per 10 minuti. Circa 80-100 cellule entreranno in ogni cavità piramidale. NOTA: È possibile aumentare il numero di cellule per piatto di coltura cellulare aumentando la concentrazione cellulare o il tempo trascorso prima della rimozione della sospensione cellulare. Tipicamente, la formazione di sferoidi richiede diverse ore (a seconda del tipo di cellula) dopo la semina cellulare e può essere seguita con un microscopio a campo luminoso (obiettivi da 4x a 40x; Figura 11). Da qui, il terreno di coltura, le matrici extracellulari e i fattori di crescita di differenziazione possono essere modificati o aggiunti al piatto di coltura cellulare contenente gli sferoidi secondo i tipici protocolli di differenziazione che potrebbero durare alcuni giorni, settimane o mesi.</li>
		<li>Dopo l'incubazione di 10 minuti, recuperare il piatto di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare delicatamente la sospensione cellulare per rimuovere le cellule non intrappolate. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a un piatto da 35 mm e rimetterlo nell'incubatore cellulare. CRITICO: In questa fase, poiché gli sferoidi non si sono ancora formati, è molto importante evitare forti aspirazioni o erogazioni che comporteranno la perdita delle cellule. Il controllo visivo con un microscopio a campo chiaro da banco è altamente raccomandato in questa fase.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Immunocolorazione e imaging
<ol><li>Fissazione e colorazione NOTA: Diverse procedure classiche di fissazione e immunocolorazione sono completamente compatibili con il piatto di coltura cellulare. Un protocollo tipico è descritto qui.<ol><li>Fissare gli organoidi/sferoidi nella capsula di coltura cellulare per 20 minuti in paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Permeabilizzare gli organoidi per 24 ore in soluzione tensioattiva all'1% in PBS sterile a 4 °C su uno shaker orbitale e incubare per 24 ore in tampone bloccante (albumina sierica bovina al 2% [BSA] e tensioattivo all'1% in PBS sterile) a 4 °C su uno shaker orbitale.</li>
		<li>Incubare i campioni con anticorpi primari di interesse ad una diluizione compresa tra 1/50 e 1/200 (o secondo le raccomandazioni del produttore) in tampone anticorpale (2% BSA e 0,2% tensioattivo in PBS sterile) a 4 °C per 48 h.</li>
		<li>Risciacquare i campioni 3 volte con tampone di lavaggio su uno shaker orbitale (3% NaCl e tensioattivo 0,2% in PBS sterile) e incubare con i corrispondenti anticorpi secondari nel tampone anticorpale di diluizione (diluizione tra 1/100 e 1/300 o secondo le raccomandazioni del produttore), 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e 0,2 μg/mL Alexa Fluor 647 o 488 Phalloidin a 4 °C per 24 ore su uno shaker orbitale, seguito da cinque fasi di risciacquo con PBS. Facoltativamente, montare i campioni utilizzando un agente clearing solubile in acqua preriscaldato a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging NOTA: In questa fase, gli organoidi nella piastra del micropozzetto possono essere considerati come un normale piatto di coltura contenente campioni fissi e colorati per l'imaging: qualsiasi procedura di imaging standard può essere utilizzata senza alcun adattamento o modifica richiesta. La figura 12 illustra un risultato rappresentativo di immagini e ricostruzione 3D ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante, con un obiettivo aereo 40x (apertura numerica 0,75).<ol><li>Utilizzare il software costruttore per il processo di acquisizione automatica delle immagini con le seguenti impostazioni: tempo di esposizione = 50 ms, con uno stadio motorizzato z per acquisire uno z-stack (1 μm Z-step, per un'altezza totale di 70 μm).</li>
		<li>Esegui la ricostruzione 3D utilizzando il software di analisi delle immagini.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Rilascio e raccolta degli organoidi
NOTA: Lo strato adesivo testurizzato del piatto di coltura cellulare può essere staccato dal coprislip per rilasciare gli sferoidi/organoidi viventi (prima della fissazione) contenuti all'interno delle cavità piramidali per l'analisi delle cellule con altre procedure come il sequenziamento dell'RNA, approcci -omici, esperimenti in vitro e trapianto in vivo .
<ol><li>Con il campione ancora nella capsula di Petri e in un cappuccio di biosicurezza, utilizzare una lama come un bisturi per tagliare un angolo dello strato adesivo strutturato.</li>
	<li>Con una pinzetta, pizzicare lo strato adesivo testurizzato sul bordo tagliato e staccarlo delicatamente dal vetrino, ma tenerlo immerso nel mezzo (alcuni organoidi potrebbero rimanere con lo strato adesivo, Figura 13).</li>
	<li>Risciacquare 3 volte con terreno di coltura e raccogliere gli organoidi mediante pipettaggio.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
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<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

Una domanda di brevetto internazionale è stata pubblicata con il numero di pubblicazione WO 2021/167535 A1.

La procedura per la fabbricazione del piatto di coltura a micropozzetto, che consente la coltura e la differenziazione di organoidi ad alta densità, è stata descritta in questo articolo. A causa della geometria e della disposizione delle microcavità, migliaia di sferoidi possono essere coltivati e colorati in una singola piastra per lunghi periodi di tempo (diverse settimane o più) con quasi nessuna perdita di materiale. A titolo di confronto, un'area di 4 mm x 2 mm sulla piastra di coltura cellulare può contenere tanti ...

Nelle colture cellulari 3D organotipiche, di seguito denominate organoidi, le cellule staminali si differenziano e si auto-organizzano in strutture spaziali che condividono forti somiglianze morfologiche e funzionali con organi reali. Gli organoidi offrono modelli preziosi per studiare la biologia umana e lo sviluppo al di fuori del corpo 1,2,3. Un numero crescente di modelli sono in fase di sviluppo che imitano il fegato, il cervello, i reni, i polmoni e molti altri organi 2,4,5. La differenziazione negli organoidi è diretta dall'aggiunta di fattori di crescita solubili e di una matrice extracellulare in una precisa sequenza temporale. Tuttavia, in netto contrasto con gli organi, lo sviluppo degli organoidi è piuttosto eterogeneo.
Oltre alle numerose sfide biologiche6,7, le colture organoidi pongono anche sfide tecnologiche in termini di metodi di coltura cellulare, caratterizzazione della trascrittomica e imaging. Lo sviluppo degli organi in vivo avviene in un ambiente biologico che si traduce in un'auto-organizzazione altamente stereotipata delle disposizioni cellulari. Qualsiasi alterazione fenotipica può essere utilizzata come proxy per diagnosticare uno stato patologico. Al contrario, gli organoidi si sviluppano in vitro in microambienti minimamente controllati compatibili con le condizioni di coltura cellulare, con conseguente grande variabilità nel percorso di sviluppo e nella formazione della forma per ogni singolo organoide.
Un recente studio8 ha dimostrato che l'imaging quantitativo della forma organoide (descrittori fenotipici) accoppiato alla valutazione di alcuni marcatori genetici consente la definizione di paesaggi di sviluppo fenotipici. Probabilmente, la capacità di mettere in relazione la diversità dell'espressione genomica negli organoidi con il loro comportamento fenotipico è un passo importante verso lo sfruttamento del pieno potenziale delle colture organotipiche. Pertanto, richiede lo sviluppo di approcci di imaging dedicati e ad alto contenuto che consentano la caratterizzazione delle caratteristiche organoidi su scale subcellulari, multicellulari e organoidi intere in 3D 9,10.
Abbiamo sviluppato una versatile piattaforma di screening ad alto contenuto (HCS) che consente una coltura organoide semplificata (da cellule staminali embrionali umane isolate [hESC], cellule staminali pluripotenti indotte umane [hIPSC] o cellule primarie a organoidi differenziati 3D, multicellulari) e imaging 3D rapido e non invasivo. Integra un dispositivo di coltura cellulare 3D miniaturizzato di nuova generazione, chiamato chip JeWells (il chip di seguito), che contiene migliaia di micropozzetti ben disposti affiancati da specchi a 45 ° che consentono immagini rapide, 3D e ad alta risoluzione mediante microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo11. Compatibile con qualsiasi microscopio invertito standard, commerciale, questo sistema consente l'imaging di 300 organoidi in 3D con risoluzione subcellulare in <1 h.
La microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare parte da uno stampo micro strutturato esistente, che contiene centinaia di micropiramidi (Figura 1A) con base quadrata e pareti laterali a 45° rispetto alla base. La figura 1C mostra le immagini al microscopio elettronico (EM) di tali strutture. Lo stampo stesso è realizzato in poli(dimetilsilossano) (PDMS) e può essere realizzato come un calco replica di uno stampo primario (non mostrato qui) con caratteristiche corrispondenti (come cavità) utilizzando procedure litografiche molli standard. Lo stampo primario può essere prodotto con diverse procedure. Quello utilizzato per questo protocollo è stato realizzato utilizzando l'incisione a umido al silicio come riportato in Galland et al. 11; La procedura per la fabbricazione dello stampo primario non è critica per questo protocollo. Le piramidi sono disposte in una matrice quadrata, con lo stesso passo per le direzioni X e Y (in questo caso il passo è di 350 μm).
A titolo illustrativo, sono stati pubblicati12 esperimenti proof-of-concept per dimostrare che il chip consente una coltura a lungo termine (mesi) e protocolli di differenziazione, definendo con precisione il numero di cellule iniziali nei pozzi. Lo sviluppo individuale di un gran numero di organoidi può essere monitorato automaticamente in tempo reale utilizzando microscopi a fluorescenza standard a campo chiaro e 3D a foglio di luce. Inoltre, gli organoidi possono essere recuperati per eseguire ulteriori indagini biologiche (ad esempio, analisi trascrittomica). Questo documento delinea i protocolli dettagliati per la fabbricazione dei vetrini di copertura della coltura cellulare, la procedura di semina e colorazione per la microscopia a fluorescenza, nonché il recupero degli organoidi.

<table><tbody><tr><td>2-Propanolo</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 Microscopio confocale da banco</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>Microscopio confocale a disco rotante</td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di mordenzatura all'ossido tamponato</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq acqua</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H, rotondo diametro 25 mm</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>software Imaris Software</td> di <td>analisi delle immagini</td><td>BitPlane</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico a trasmissione invertita Nikon</td><td></td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>Omogeneizzatore ad ultrasuoni</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>copolimero bio-mimetico</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>Adesivo UV polimerizzabile</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina</td><td>Thermofisher scientifico&nbsp;</td><td>A12379</td><td>Alexa Fluor</td></tr><tr><td>Phosphate Soluzione tampone</td><td>Thermofisher scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Photo Resist AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Plasma tool</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>Per trattamento al plasma O2</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td> agente <td>di pulizia solubile in acqua</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante/agitatore RCT</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento di incisione ionica reattiva</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td> Terreno <td>di</td> coltura <td>11875093 Invitrogen</td><td>per cellule HCT116</td></tr><tr><td>Kit di elastomeri siliconici Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsilossano o, in breve, PDMS</td></tr><tr><td>Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>tensioattivo</td></tr><tr><td>tripsina EDTA</td><td>Thermofisher 15400054</td><td></td><td></td>scientifico</tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>Sorgente luminosa UV-LED, lunghezza d'onda 365 nm, 35 mW/cm2 maschera UV di densità di potenza</td></tr><tr><td> allineatore</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3d di organoidi

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

La caratterizzazione di un gran numero di colture organotipiche tridimensionali (3D) (organoidi) a diverse scale di risoluzione è attualmente limitata da approcci di imaging standard. Questo protocollo descrive un modo per preparare chip di coltura organoidi microfabbricati, che consentono l'imaging live 3D multiscala su uno strumento intuitivo che richiede manipolazioni minime e in grado di produrre fino a 300 organoidi / h. Questi chip di coltura sono compatibili con obiettivi sia ad aria che ad immersione (aria, acqua, olio e silicone) e con una vasta gamma di microscopi comuni (ad esempio, disco rotante, scanner puntiforme confocale, campo largo e campo chiaro). Inoltre, possono essere utilizzati con modalità light-sheet come la tecnologia di microscopia a luce singola (SPIM) a obiettivo singolo (soSPIM). 
Il protocollo qui descritto fornisce passaggi dettagliati per la preparazione dei trucioli di coltura microfabbricati e la coltura e la colorazione degli organoidi. È necessario solo un breve periodo di tempo per familiarizzare e materiali di consumo e attrezzature possono essere facilmente trovati nei normali laboratori biologici. Qui, le capacità di imaging 3D saranno dimostrate solo con microscopi standard commerciali (ad esempio, disco rotante per la ricostruzione 3D e microscopia a campo largo per il monitoraggio di routine).

La figura 8F mostra l'aspetto tipico di un copricostume per coltura cellulare dopo una fabbricazione riuscita. Lo strato adesivo polimerizzabile ai raggi UV appare piatto e aderisce bene al vetrino. Il trasferimento dello strato adesivo sul vetrino potrebbe non riuscire se lo strato sul vetrino è sovrapolimerizzato o se la rimozione del substrato PDMS piatto viene eseguita in modo errato (come mostrato nella Figura 8G,H). In entrambi i casi, il ...

Questo documento presenta un protocollo di fabbricazione per un nuovo tipo di substrato di coltura con centinaia di microcontenitori per mm2, in cui gli organoidi possono essere coltivati e osservati utilizzando la microscopia ad alta risoluzione. Anche i protocolli di semina cellulare e immunocolorazione sono dettagliati.

Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Questo protocollo dimostra un piatto di coltura cellulare microtexture progettato per la crescita di centinaia di organoidi con conoscenza del materiale e pienamente compatibile con la microscopia. La nostra tecnica consente in modo efficiente di generare migliaia di organoidi, pienamente compatibili con l'imaging a lungo termine e la coltura cellulare a lungo termine. Questo protocollo è di forte interesse per applicazioni biomediche come la pipeline di screening dei farmaci e i domini di ricerca sul cancro.La tecnica presentata in questo protocollo è facile da padroneggiare dopo alcuni tentativi da parte di chiunque abbia esperienza con le procedure di laboratorio e la microscopia ottica. Per iniziare, tagliare piccole porzioni dello stampo PDMS fino alla dimensione richiesta per il dispositivo finale. Tagliarli parallelamente alle direzioni XY dell'array.Posizionate uno dei dadi dello stampo PDMS preparati a faccia in giù sulla sezione PDMS piatta. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere circa 0,1-0,2 millilitri di adesivo polimerizzabile UV su un lato dello stampo. Seguire la progressione del liquido all'interno della cavità utilizzando un microscopio ottico invertito con i

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L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.

Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Qui, forniamo protocolli dettagliati, robusti e complementari per eseguire la colorazione e l'imaging a risoluzione subcellulare di modelli di coltura cellulare tridimensionale fissi che vanno da 100 μm a diversi millimetri, consentendo così la visualizzazione della loro morfologia, composizione del tipo di cellula e interazioni.

Colorazione e imaging ad alta risoluzione di modelli organoidi e sferoidi tridimensionali

Un protocollo dettagliato è presentato qui per descrivere un modello organoide in vitro da cellule epiteliali nasali umane. Il protocollo ha opzioni per le misurazioni che richiedono apparecchiature di laboratorio standard, con possibilità aggiuntive per attrezzature e software specializzati.

Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani

Questo protocollo descrive un metodo semi-automatico per screening di farmaci organoidi a medio-alto rendimento e un software di analisi delle immagini automatizzato indipendente dal microscopio per quantificare e visualizzare risposte multiparametriche a singolo organoide per catturare l'eterogeneità intratumorale.

Screening multiparametrico di farmaci organoidi tumorali mediante imaging a cellule vive a campo ampio per analisi di massa e organoidi singoli

Il presente studio descrive le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la lavorazione, la colorazione, l'etichettatura e l'esame di interi sferoidi e organoidi sotto vari microscopi, mentre rimangono intatti in un idrogel all'interno di un dispositivo multiuso.

Coltivazione, congelamento, lavorazione e imaging di interi organoidi e sferoidi mentre sono ancora in un idrogel

Questo protocollo documenta la fabbricazione e l'assemblaggio di SPOT, una piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività, nei formati da 96 e 384 pozzetti. Descrive inoltre in dettaglio il processo di semina per SPOT, sia manuale che utilizzando un gestore di liquidi disponibile in commercio.

Produzione riproducibile di SPOT come piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging tridimensionale e ad alta risoluzione, label-free di organoidi utilizzando l'olotomografia a bassa coerenza. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione della coltura di organoidi, l'acquisizione di immagini e l'analisi computazionale delle immagini, consentendo la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche strutturali e delle risposte ai farmaci negli organoidi viventi.

Imaging 3D ad alta risoluzione e analisi con apprendimento automatico senza marcatura di organoidi intestinali tramite olotomografia a bassa coerenza

Descriviamo pipeline di imaging confocale e tracciamento applicati a due strategie di reporter: organoidi mosaici per risolvere il comportamento delle singole cellule e organoidi fate reporter per il monitoraggio delle transizioni cellulari in organoidi intestinali umani e murini.

Imaging a cellule vive e tracciamento a singola cellula per monitorare la dinamica clonale e le transizioni del destino negli organoidi intestinali umani e murini

Abbiamo sviluppato un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema in vitro SNC assone-glia di ricerca interazione. La piattaforma è in grado di condurre fino a sei esperimenti indipendenti, in parallelo ed è stato fabbricato utilizzando una nuova concezione macro / micro metodo ibrido fabbricazione.

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

Scopri una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi utilizzando piastre microtesturizzate compatibili con la microscopia confocale. Questo metodo facilita lo screening farmacologico e la ricerca sul cancro.

Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi

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