Name: Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri la trasduzione mediata dal fago φBB-1 in Borrelia burgdorferi, alternativa all'elettroporazione per l'introduzione di DNA. Questo metodo facilita la manipolazione genetica di ceppi difficili da trasformare.

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L'autore desidera ringraziare Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor per la loro utile discussione e Vareeon (Pam) Chonweerawong per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Biomediche e dalle borse di ricerca della facoltà a Christian H. Eggers della School of Health Sciences della Quinnipiac University.

L'autore non ha nulla da rivelare.

L'uso della trasduzione potrebbe rappresentare un metodo per superare almeno alcune delle barriere biologiche e tecniche associate all'elettrotrasformazione di B. burgdorferi 1,4,13,37. In molti sistemi, il batteriofago può spostare il DNA dell'ospite (non profago) tra le cellule batteriche mediante trasduzione generalizzata o specializzata 22,23,24,49,50.<...

Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica del batterio spirochetale Borrelia burgdorferi ha aggiunto un valore incommensurabile alla comprensione della natura della malattia di Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi ha un genoma insolitamente complesso composto da un piccolo cromosoma lineare e plasmidi sia lineari che circolari 5,6. La perdita spontanea di plasmidi, il riarrangiamento intragenico (spostamento di geni da un plasmide all'altro all'interno dello stesso organismo) e il trasferimento genico orizzontale (HGT, il movimento del DNA tra due organismi) hanno dato origine a una quantità vertiginosa di eterogeneità genetica tra B. burgdorferi (per un esempio, vedi Schutzer et al.7). I genotipi risultanti (o "ceppi") sono tutti membri della stessa specie, ma hanno differenze genetiche che influenzano la loro capacità di trasmettere e infettare diversi ospiti di mammiferi 8,9,10,11. In questa relazione, il termine "ceppo" sarà utilizzato per riferirsi a B. burgdorferi con un particolare background genetico di derivazione naturale; Il termine "clone" sarà utilizzato per riferirsi a un ceppo che è stato geneticamente modificato per uno scopo particolare o come risultato di manipolazione sperimentale.
La cassetta degli attrezzi molecolare disponibile per l'uso in B. burgdorferi include marcatori selezionabili, segnalatori genici, vettori shuttle, mutagenesi dei trasposoni, promotori inducibili e marcatori controselezionabili (per una revisione, vedi Drektrah e Samuels12). L'uso efficace di queste metodologie richiede l'introduzione artificiale di DNA eterologo (estraneo) in un ceppo di interesse di B. burgdorferi. In B. burgdorferi, l'introduzione del DNA eterologo è ottenuta quasi esclusivamente tramite elettroporazione, un metodo che utilizza un impulso di elettricità per rendere una membrana batterica transitoriamente permeabile a piccoli pezzi di DNA introdotti nei mezzi1. La maggior parte delle cellule (stimate in ≥99,5%) vengono uccise dall'impulso, ma le cellule rimanenti hanno un'alta frequenza di trattenere il DNA eterologo13. Sebbene sia considerato uno dei metodi più efficienti per introdurre il DNA nei batteri, la frequenza di elettroporazione in B. burgdorferi è molto bassa (che va da 1 trasformante in 5 × 104 a 5 × 106 cellule)13. Gli ostacoli al raggiungimento di frequenze di trasformazione più elevate sembrano essere sia tecnici che biologici. Gli ostacoli tecnici al successo dell'elettroporazione di B. burgdorferi includono sia la quantità di DNA (>10 μg) necessaria sia il requisito che le spirochete siano esattamente nella corretta fase di crescita (mid-log, tra 2 × 10 7 cellule·mL−1 e 7 × 107 cellule·mL−1) durante la preparazione di cellule elettrocompetenti12,13. Queste barriere tecniche, tuttavia, possono essere più facili da superare rispetto alle barriere biologiche.
I ricercatori della malattia di Lyme riconoscono che i cloni di B. burgdorferi possono essere divisi in due grandi categorie rispetto alla loro capacità di essere manipolati geneticamente13,14. Gli isolati adattati in laboratorio ad alto passaggio sono spesso facilmente trasformabili, ma di solito hanno perso i plasmidi essenziali per l'infettività, si comportano in modo fisiologicamente aberrante e non sono in grado di infettare un ospite di mammifero o persistere all'interno di un vettore zecca12,13. Mentre questi cloni sono stati utili per sezionare la biologia molecolare della spirocheta all'interno del laboratorio, sono di scarso valore per lo studio della spirocheta nel contesto biologico del ciclo enzootico. Gli isolati infettivi a basso passaggio, invece, si comportano in maniera fisiologica riflettente uno stato infettivo e possono completare il ciclo infettivo ma di solito sono recalcitranti all'introduzione di DNA eterologo e sono, quindi, difficili da manipolare per lo studio12,13. La difficoltà nel trasformare gli isolati a basso passaggio è legata ad almeno due diversi fattori: (i) gli isolati a basso passaggio spesso si raggruppano strettamente, in particolare nelle condizioni di alta densità richieste per l'elettroporazione, bloccando così molte cellule dalla piena applicazione della carica elettrica o dall'accesso al DNA nei mezzi13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica almeno due diversi sistemi di modificazione della restrizione trasmessa da plasmidi (R-M) che possono essere persi negli isolati ad alto passaggio14,16. I sistemi R-M si sono evoluti per consentire ai batteri di riconoscere ed eliminare il DNA estraneo17. Infatti, diversi studi su B. burgdorferi hanno dimostrato che l'efficienza di trasformazione aumenta quando la fonte del DNA è B. burgdorferi piuttosto che Escherichia coli13,16. Sfortunatamente, acquisire l'alta concentrazione di DNA necessaria per l'elettroporazione da B. burgdorferi è una prospettiva costosa e dispendiosa in termini di tempo. Un'altra potenziale preoccupazione quando si elettroporano e si selezionano isolati a basso passaggio è che il processo sembra favorire i trasformanti che hanno perso il plasmide associato alla virulenza critica, lp2514,18,19; pertanto, l'atto stesso di manipolare geneticamente isolati di B. burgdorferi a basso passaggio tramite elettroporazione può selezionare cloni che non sono adatti per analisi biologicamente rilevanti all'interno del ciclo enzootico20. Dati questi problemi, un sistema in cui il DNA eterologo potrebbe essere elettrotrasformato in cloni di B. burgdorferi ad alto passaggio e quindi trasferito in isolati infettivi a basso passaggio con un metodo diverso dall'elettroporazione potrebbe essere una gradita aggiunta alla crescente collezione di strumenti molecolari disponibili per l'uso nella spirocheta della malattia di Lyme.
Oltre alla trasformazione (l'assorbimento del DNA nudo), ci sono altri due meccanismi attraverso i quali i batteri assumono regolarmente DNA eterologo: la coniugazione, che è lo scambio di DNA tra batteri in contatto fisico diretto tra loro, e la trasduzione, che è lo scambio di DNA mediato da un batteriofago21. Infatti, la capacità del batteriofago di mediare l'HGT è stata utilizzata come strumento sperimentale per sezionare i processi molecolari all'interno di un certo numero di sistemi batterici22,23,24. B. burgdorferi non è naturalmente competente per l'assorbimento del DNA nudo, e ci sono poche prove che B. burgdorferi codifichi l'apparato necessario per promuovere una coniugazione di successo. Precedenti studi hanno descritto, tuttavia, l'identificazione e la caratterizzazione preliminare di φBB-1, un batteriofago temperato di B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 racchiude una famiglia di plasmidi da 30 kb trovati in B. burgdorferi25; I membri di questa famiglia sono stati designati CP32. Coerentemente con il ruolo di φBB-1 nella partecipazione all'HGT tra i ceppi di B. burgdorferi, Stevenson et al. hanno riportato un cp32 identico trovato in due ceppi con cp32 altrimenti disparati, suggerendo una recente condivisione di questo cp32 tra questi due ceppi, probabilmente tramite trasduzione29. Ci sono anche prove di una significativa ricombinazione tramite HGT tra i cp32 in un genoma 30,31,32,33 altrimenti relativamente stabile. Infine, la capacità di φBB-1 di trasdurre sia cp32s che DNA vettoriale shuttle eterologo tra cellule dello stesso ceppo e tra cellule di due ceppi diversi è stata dimostrata in precedenza27,28. Alla luce di questi risultati, φBB-1 è stato proposto come un altro strumento da sviluppare per la dissezione della biologia molecolare di B. burgdorferi.
L'obiettivo di questo rapporto è quello di dettagliare un metodo per indurre e purificare il fago φBB-1 da B. burgdorferi, oltre a fornire un protocollo per eseguire un saggio di trasduzione tra cloni di B. burgdorferi e selezionare e selezionare potenziali trasduttori.

<table><tbody><tr><td>Unità filtranti da 1 L (PES, 0,22 & micro; </td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>provetta da 12 mm x 75 mm (tappo a doppia posizione) (polipropilene)</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>contiene 4 mL con basso volume vuoto (per induzione)</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 15 mL (polipropilene)</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; non più prontamente disponibile, non ho testato offerto un sostituto</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur da 5,75" (con tappo di cotone/vetro borosilicato/non sterile)</td><td>Autoclave Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 50 ml (polipropilene)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td></td>assoluto</tr><tr><td>Agarosio LE</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Bacto TC Yeastolate</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (grado di sostituzione del siero)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio (per biologia molecolare)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>ATTENZIONE: sostanze organiche volatili; utilizzare solo in una cappa chimica</td></tr><tr><td>CMRL-1066 senza L-Glutammina (polvere)</td> <td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>grado di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di reagente gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio (destrosio anidro)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0,22 &micro; </td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>per filtrare, sterilizzare antibiotici e altre soluzioni di piccolo volume</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; utilizzare solo in una cappa chimica</td></tr><tr><td>N-acetil-D-glucosamina</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotidi (primer per PCR)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (kit di estrazione genomica totale)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (100 mm & 15 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser camera di conteggio</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser coperchio camera di conteggio</td><td>vetro Hausser scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000 (PEG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero di coniglio non sterile in tracce emolizzato giovane (NRS)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>inattivato a caldo secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>Cuvette semi-micro trasparenti UV</td><td>USA Scientific</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di</td> <td>sodioThermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Fisher Scientific Soluzione</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di solfato di streptomicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804-500G</td><td>Citrato di sodio per BSK</td></tr></tbody></table>

manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di lyme spirochete borrelia burgdorferi

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

L'introduzione di DNA estraneo nella spirocheta Borrelia burgdorferi è stata ottenuta quasi esclusivamente mediante trasformazione mediante elettroporazione. Questo processo ha efficienze notevolmente inferiori nella spirocheta della malattia di Lyme rispetto ad altri batteri Gram-negativi meglio caratterizzati. Il tasso di successo della trasformazione dipende fortemente dall'avere quantità concentrate di DNA di alta qualità da background specifici ed è soggetto a una significativa variabilità da ceppo a ceppo. Mezzi alternativi per introdurre DNA estraneo (cioè vettori navetta, reporter fluorescenti e marcatori di resistenza agli antibiotici) in B. burgdorferi potrebbero essere un'importante aggiunta all'armamentario di strumenti utili per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. I batteriofagi sono stati ben riconosciuti come meccanismi naturali per il movimento del DNA tra i batteri in un processo chiamato trasduzione. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per utilizzare l'onnipresente fago borreliale φBB-1 per trasdurre il DNA tra cellule di B. burgdorferi dello stesso background genetico e di diversi background genetici. Il DNA trasdotto include sia DNA borreliale che DNA eterologo sotto forma di piccoli vettori navetta. Questa dimostrazione suggerisce un potenziale uso della trasduzione mediata dai fagi come complemento all'elettroporazione per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. Questo rapporto descrive i metodi per l'induzione e la purificazione del fago φBB-1 da B. burgdorferi, l'uso di questo fago nei saggi di trasduzione e la selezione e lo screening di potenziali trasduttori.

L'uso del batteriofago per spostare il DNA tra ceppi di B. burgdorferi più facilmente trasformabili o cloni che sono recalcitranti all'elettrotrasformazione rappresenta un altro strumento per la continua indagine molecolare dei determinanti della malattia di Lyme. Il saggio di trasduzione qui descritto può essere modificato secondo necessità per facilitare il movimento del DNA tra eventuali cloni di interesse utilizzando uno o due antibiotici per la selezione di potenziali trasduttori. La trasduzione sia del DNA...

La capacità dei batteriofagi di spostare il DNA tra le cellule batteriche li rende strumenti efficaci per la manipolazione genetica dei loro ospiti batterici. Presentata qui è una metodologia per indurre, recuperare e utilizzare φBB-1, un batteriofago di Borrelia burgdorferi, per trasdurre DNA eterologo tra diversi ceppi della spirocheta della malattia di Lyme.

Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Questo protocollo è significativo perché descrive un altro importante strumento per sezionare la biologia molecolare dell'agente della malattia di Lyme Borrelia burgdorferi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizzando la trasduzione fagica, fornisce un metodo alternativo per introdurre il DNA nella Borrelia burgdorferi senza richiedere l'applicazione di un impulso elettrico, come nell'elettroporazione. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per fornire ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari utilizzati da Borrelia burgdorferi per persistere nel suo ciclo enzootico e, infine, causare la malattia di Lyme negli esseri umani.Per iniziare, inoculare 150 microlitri del clone appropriato di Borrelia burgdorferi in 15 millilitri di BSK in provette coniche sterili strettamente coperte per il protocollo di trasduzione. Quindi, integrare il terreno con la concentrazione appropriata di antibiotici o una combinazione di antibiotici per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo all'interno del clone Borrelia burgdorferi e incubare il campione a 33 gradi Celsius. Dopo che la coltura è cresciuta, centrifugare il volume appropriato di coltura a 6.000 G per 10 minuti.Dopo aver decantato il surnatante, risospendere il pellet in quattro millilitri a BSK fresco e trasferire il campione nel tubo sterile più piccolo disponibile per contenere il campione con uno spazio minimo sulla testa. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di agente induttore alla concentrazione raccomandata sulla base di un volume di coltura di quattro millilitri per indurre la produzione di fagi, tappare strettamente il tubo e mescolare accuratamente. Incubare il campione a 33 gradi Celsius per due o quattro ore.Quindi, trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare il campione a 6.000 G per 10 minuti. Dopo aver travasato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 15 millilitri di BSK.Integrare la coltura preparata con la concentrazione antibiotica appropriata descritta nel manoscritto, mentre si incuba il campione a 33 gradi Celsius per 72-96 ore. Per preparare soluzioni per la precipitazione PEG, preparare 500 millilitri di cloruro di sodio a cinque molari, 500 millilitri di PEG al 40% e 100 millilitri di mezzo di sospensione come descritto nel manoscritto. Per sterilizzare, autoclavare la soluzione, raffreddare prima dell'uso e conservare la temperatura ambiente o quattro gradi Celsius.Per la precipitazione PEG del fago dal clone del donatore Borrelia burgdorferi, dopo 72-96 ore di incubazione, centrifugare i campioni a 8.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e smaltire il pellet cellulare. Aggiungere cloruro di sodio a cinque molari ad una concentrazione finale di un molare.Dopo aver mescolato bene, rotola delicatamente a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare i campioni a 8.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver decantato il surnatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri come dimostrato in precedenza, aggiungere la soluzione 40% PEG-8000 al surnatante a una concentrazione finale del 10% Mescolare bene e mettere su ghiaccio per più di un'ora, fino a una notte.Centrifugare i campioni a 8.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius come dimostrato in precedenza. Scartare il surnatante e rimuovere quanto più liquido in eccesso possibile senza perdere alcun pellet, che contiene le particelle fagiche. Risospendere il pellet in un volume minimo di mezzo di sospensione utilizzando il mezzo di sospensione per lavare il lato della bottiglia e raccogliere eventuali particelle fagiche.Trattare il campione di fago recuperato con un volume uguale di cloroformio in base al volume di risospensione. Mescolare bene il campione e centrifugare a 8.000 g per 10 minuti. Quindi, rimuovere lo strato acquoso in un tubo pulito, evitando uno qualsiasi degli strati di interfaccia spessi.Dopo aver determinato il volume recuperato, dopo il primo trattamento con cloroformio, trattare nuovamente il campione con una quantità di cloroformio pari al 10% di tale volume. Trasferire lo strato acquoso in un tubo pulito facendo attenzione ad evitare qualsiasi interfaccia o strati organici. Utilizzare immediatamente il fago o conservarlo a quattro gradi Celsius.Dopo aver preparato le colture di Borrelia burgdorferi da utilizzare come riceventi nei saggi di trasduzione come dimostrato in precedenza, centrifugare il volume di coltura a 6.000 G per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 14,5 millilitri di BSK fresco. Aggiungere meno o uguale a 500 microlitri di campione di fago precipitato con PEG alla coltura del clone ricevente.Dopo aver mescolato bene, incubare a 33 gradi Celsius per 72-96 ore. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida dopo miscelazione con fago precipitato con PEG come descritto nel manoscritto. A seconda del background del clone ricevente, controllare che le colonie appaiano all'interno dell'agarosio sulle piastre di selezione dopo 10-21 giorni di incubazione.Scegli almeno da 5 a 10 colonie che crescono sulla piastra in presenza di entrambi gli antibiotici usando pipetta borosilicata sterilizzata da 5,75 pollici con tappo di cotone e inoculali in 1,5 millilitri di BSK con l'antibiotico appropriato. L'amplificazione PCR dei geni è stata eseguita su 10 dei cloni che codificano la resistenza alla kanamicina e alla gentamicina. Il gene di resistenza alla kanamicina potrebbe essere amplificato dal donatore c1673 e dai potenziali trasduttori, ma non dal ricevente c1706.Allo stesso modo, il gene di resistenza alla gentamicina potrebbe essere amplificato dal ricevente c1706 e dai potenziali trasduttori ma non dal donatore, rappresentando eventi di trasduzione. Dimostrare che la cassetta di resistenza alla kanamicina è stata trasdotta da 5BB1 dal donatore al ricevente. Lo sfondo dei trasduttori è stato determinato utilizzando marcatori specifici del ceppo.Il clone c1673 e lo sfondo CA-112A codificano ampliconi specifici quattro, cinque e sei, mentre c1706, che ha uno sfondo B31 ad alto passaggio, non lo fa. Allo stesso modo, ai trasduttori uno e due mancavano gli ampliconi quattro, cinque e sei, dimostrando che i cloni hanno il background c1706 e hanno acquisito il gene di resistenza alla kanamicina da c1673. Per la precipitazione PEG del fago, eseguire attentamente tutti i passaggi per massimizzare la resa del fago e trattare accuratamente il fago risospeso con cloroformio per rimuovere il più possibile i contaminanti PEG e dei terreni di coltura prima dell'uso e dello stoccaggio dei fagi.Una volta che il saggio di trasduzione è stato eseguito con successo e il transduttore verificato, questi cloni sono quindi disponibili per rispondere alle domande che richiedono Borrelia burgdorferi geneticamente modificata. Si spera che lo sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori di manipolare geneticamente i ceppi di Borrelia burgdorferi per i quali l'introduzione del DNA tramite elettroporazione è attualmente difficile.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.

Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All&#39;interno della Gut Tick

Fonte: Eggers, C. H. Manipolazione genetica mediata dai fagi della spirocheta Borrelia burgdorferi della malattia di Lyme. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra la preparazione di una coltura di Borrelia burgdorferi geneticamente modificata ingegnerizzata con DNA batteriofago dormiente che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici. Dopo la selezione e l'incubazione degli antibiotici, un induttore chimico innesca il danno al DNA, portando all'escissione, alla replicazione e...

Preparazione e induzione di colture di Borrelia burgdorferi per la produzione di particelle virali

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Phage Purification from Borrelia burgdorferi

La malattia di Lyme è la più comunemente riportati vector-borne malattia in Nord America. L'agente eziologico, Borrelia burgdorferi è un batterio spirocheta trasmessa da zecche ixodid. Trasmissione e rilevamento di un'infezione in modelli animali è ottimizzata dall'utilizzo di alimentazione tick, che descriveremo qui.

Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Nested PCR è una tecnica sensibile, specifica e semplice che può essere applicata a tick che DNA estratti per sonda per Borrelia burgdorferi, l'agente eziologico della malattia di Lyme. L'esperimento PCR iniziale utilizza gli iniettori di gene-specific per generare ampliconi lunghi, che poi diventano modelli per una successiva reazione utilizzando primers interna.

Rilevare il malattia di Lyme Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in segni di graduazione utilizzando la PCR annidata

I saggi di trascrizione in vitro possono decifrare i meccanismi di regolazione trascrizionale in Borreliella burgdorferi. Questo protocollo descrive i passaggi per purificare la RNA polimerasi di B. burgdorferi ed eseguire reazioni di trascrizione in vitro . Gli approcci sperimentali che utilizzano saggi di trascrizione in vitro richiedono una purificazione e una conservazione affidabili della RNA polimerasi attiva.

Componenti essenziali di Borreliella (Borrelia) burgdorferi Saggi di trascrizione in vitro

La coltura in vitro è un metodo di rilevamento diretto per la presenza di batteri viventi. Questo protocollo descrive i metodi per la coltura di diverse spirochete Borrelia, comprese quelle del complesso Borrelia burgdorferi sensu lato, della febbre recidivante delle specie Borrelia e della Borrelia miyamotoi.  Queste specie sono esigenti e a crescita lenta, ma possono essere coltivate.

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Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

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La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

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