Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Questo è un metodo semplice per monitorare i fenotipi cellulari e le caratteristiche dei nuclei R-pass. Può anche essere spesso recuperato in studi sull'intero genoma per trovare i fattori genetici che influenzano la stabilità dei nuclei R-pass. Poiché si tratta di un organismo motorio ben consolidato, questa tecnica è facile e non richiede molto tempo e fatica rispetto all'utilizzo di linee cellulari umane o modelli animali.

L'aggregazione dei nuclei R-pass è strettamente associata alla malattia di Parkinson. Le proteine o le sostanze chimiche che probabilmente influenzano la stabilità dei nuclei R-pass possono essere testate in questo modello di lievito umanizzato. Per iniziare, applicare tre singole colonie su una piastra di agar SD-URA per la selezione di cellule contenenti plasmidi alfa-sinucleina.

Quindi, inoculare i trasformanti di lievito a tre patch per ceppo in 3 millilitri di SRD-URA per la crescita selettiva del lievito contenente i plasmidi con il 2% di raffinosio per l'inibizione dell'induzione di alfa-sinucleina sotto il promotore Gal1 e lo 0,1% di glucosio. Incubare la coltura inoculata a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto. Il giorno successivo, inoculare le cellule coltivate durante la notte in 3 millilitri di SRD-URA fresco fino a raggiungere una densità ottica di 0,2 a 600 nanometri.

Quindi, incubare la coltura per sei ore a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto. Misurare la densità ottica a 600 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Successivamente, diluire i campioni a una densità ottica di 0,5 a 600 nanometri con acqua distillata sterile nella corsia 1 di una piastra a 96 pozzetti per equalizzare il numero di cellule in ciascuna coltura.

Eseguire diluizioni seriali 5 volte delle cellule di lievito aggiungendo 160 microlitri di acqua distillata sterile alle cinque corsie successive e garantire un volume totale di 40 microlitri quando si diluiscono in serie le celle in ciascuna corsia. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri da ciascun pozzetto per individuare i campioni sulle piastre di agar SD-URA per i controlli e sulle piastre di agar SG-URA per monitorare la tossicità. Incubare le piastre maculate capovolte a 30 gradi Celsius per quattro giorni.

Scatta immagini delle lastre ogni 24 ore fino al quarto giorno e poi analizza i dati confrontando le differenze di crescita tra i ceppi individuati ad occhio. Inoculare i tre trasformanti di lievito rattoppati per ceppo in tre millilitri di SRD-URA e incubare a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto durante la notte. Il giorno successivo, misurare la densità ottica delle cellule coltivate durante la notte a 600 nanometri e inoculare le cellule in un totale di 200 microlitri di SD-URA e SG-URA freschi in piastre da 96 pozzetti.

Regolare il volume finale, comprese le celle, a 200 microlitri e regolare la densità ottica iniziale della cella a 0,05 a 600 nanometri. Regolare le impostazioni del programma nella piastra del microtitolo. Impostare la temperatura target a 30 gradi Celsius, il tempo di intervallo a 15 minuti, la durata dello scuotimento a 890 secondi, l'ampiezza di scuotimento a 5 millimetri e la misurazione come assorbanza a 600 nanometri.

Incubare la piastra per 2-3 giorni affinché tutti i ceppi raggiungano la fase stazionaria in un lettore di micropiastre. Analizzare i dati tracciando la curva di crescita. Inoculare i trasformanti di lievito rattoppati in 3 millilitri di SRD-URA e coltivarli durante la notte a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto.

Il giorno successivo, reinoculare le cellule coltivate durante la notte in 3 millilitri di SRD-URA fresco a una densità ottica di 0,003 a 600 nanometri, quindi incubare la coltura a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto, fino a quando la densità ottica raggiunge 0,2. Quindi aggiungere 300 microlitri di galattosio al 20% e quindi incubare per altre 6 ore a 30 gradi Celsius sotto agitazione a 200 rotazioni al minuto. Raccogliere un millilitro di coltura cellulare mediante centrifugazione a 800 g per 5 minuti e scartare il surnatante.

Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 30 microlitri di acqua distillata. Preparare un tampone di gel di agarosio su un vetrino. Risospendere le cellule e caricare cinque microlitri della risospensione cellulare sul vetrino e coprire le cellule usando il tampone di agarosio tagliato per l'esame.

Per eseguire l'imaging microscopico con un obiettivo 100x, utilizzare l'opzione di acquisizione dello schermo per generare immagini utilizzando il programma e selezionare il campo luminoso per mettere a fuoco la cella con un obiettivo 100x utilizzando olio ad immersione. Passare a un filtro a fluorescenza GFP e regolare il tempo di esposizione dell'immagine tra 50 millisecondi e 300 millisecondi per ottenere un'immagine chiara bilanciando il rapporto segnale/rumore. Apri il file di immagine e analizza i dati contando le celle in base al numero di fuochi nelle celle utilizzando il software di analisi delle immagini.

L'espressione della sinucleina sotto il promotore Gal1 nel vettore PRS426 ha mostrato un significativo ritardo della crescita sulla piastra di agar contenente galattosio come induttore. La differenza nella crescita per espressione della sinucleina è stata osservata anche nelle colture liquide. In entrambe le condizioni di coltura, la sinucleina wild-type e le varianti con mutazioni E46K o A53T hanno mostrato difetti di crescita dovuti alla tossicità della sinucleina.

Tuttavia, la variante della sinucleina A30p, che non forma aggregati, ha mostrato un fenotipo non tossico. I ceppi che mostravano una grave citotossicità mostravano focolai di aggregati di sinucleina, ma nella variante A30p, una forma meno tossica di sinucleina era diffusa in tutte le cellule. Per ottenere risultati riproducibili, è importante utilizzare la cellula nella stessa fase di crescita in ogni esperimento, in particolare quando si monitorano i fenotipi associati alla sinucleina.

Come abbiamo mostrato nei dati del microscopio fluorescente, la sinucleina può formare aggregati più grandi. Pertanto, può essere semplicemente frazionato mediante centrifugazione e può essere quantificato mediante western blotting utilizzando anticorpi specifici per la sinucleina. Questa tecnica è applicabile per lo screening ad alto rendimento per trovare nuovi fattori genetici e composti chimici che influenzano l'aggregazione della sinucleina.

Quindi, speriamo di trovare nuovi candidati terapeutici per la malattia di Parkinson.