Name: Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Impara la microscopia a foglio di luce per l'imaging non distruttivo della coclea in topi e ossa temporali umane. Questo metodo consente di valutare le alterazioni patologiche e la perdita di neuroni spiraliformi legate all'invecchiamento.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del National Institute on Deafness and Other Communication Disorders del National Institutes of Health, della Kellogg Foundation e da donazioni private di Bridget Sperl e John McCormick. TSLIM è stato sviluppato con l'eccellente assistenza di Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg e Julian Wuester dell'Università Tecnica di Illmenau, Germania, sotto la supervisione dei loro mentori (Stefan Sinzinger e Rene Theska) e James Leger.

Tutte le procedure e l'uso di animali vivi sono stati esaminati e approvati (ID protocollo # 2010-38573A) dal Comitato istituzionale di cura e uso dell'Università del Minnesota (IACUC) e gli investigatori che utilizzano questi animali sono stati accuratamente addestrati e testati dai veterinari delle risorse animali di ricerca (RAR) prima di avere accesso alle strutture per animali. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine.
1. Rimozione della coclea per la fissazione e l'elaborazione dei tessuti per l'imaging
<ol><li>Eutanasia di un topo usando l'inalazione di CO2 . Decapitare il topo con le forbici e fare un'incisione dorsale-ventrale attraverso il cervello per emisecare il cranio. Rimuovere il cervello, identificare la bulla rotonda nella parte baso-ventrale del cranio, aprire la bulla con rongeurs e visualizzare e rimuovere la coclea.</li>
	<li>Fissaggio: eseguire questa procedura sotto una cappa aspirante e utilizzando un microscopio a dissezione con ingrandimento 5x. Indossare guanti e indumenti protettivi. Forare la finestra ovale e rimuovere le staffe con un plettro affilato. Inserire un plettro nella finestra rotonda per forare la membrana.</li>
	<li>Coprire la finestra rotonda aperta con la punta tagliata di un set per infusione attaccato a una siringa da 1 mL riempita con 2 mL di formalina. Infondere lentamente formalina attraverso gli spazi perilinfatici della coclea per un periodo di 2 minuti, notando che la formalina sta uscendo dalla coclea attraverso la finestra ovale aperta. Tagliare il tessuto in eccesso dalla coclea e immergere in una bottiglia contenente il 10% di formalina e posizionare su un rotatore durante la notte.</li>
	<li>Decalcificazione: Risciacquare la coclea in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno e immergerla in un flacone contenente una soluzione al 10% di acido disodico etilendiamminotetraacetico (EDTA) con rotazione per 4 giorni, cambiando la soluzione ogni giorno.</li>
	<li>Disidratazione: perfondere la coclea con PBS 3x e immergere per 15 minuti tra un cambio e l'altro. Disidratare la coclea con concentrazioni crescenti di etanolo 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; per 30 minuti in ogni concentrazione. NOTA: È importante rimuovere tutto l'EDTA prima della disidratazione poiché l'EDTA precipita nell'etanolo. Inoltre, le coclee possono essere lasciate in qualsiasi concentrazione di etanolo superiore al 70% durante la notte.</li>
	<li>Colorazione: Colorare l'intera coclea per immersione in una soluzione di isotiocinato di Rhodamina B (5 μg/ml in etanolo al 100%) durante la notte con rotazione. Rimuovere il colorante in eccesso dalla coclea con due cambiamenti di etanolo al 100%, 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Pulizia: Trasferire la coclea colorata in due cambi di soluzione di Spalteholz12 (5:3 metil salicilato:benzil benzoato), 30 minuti ogni cambio e lasciare per una notte nella soluzione di compensazione con rotazione. Le coclee possono essere lasciate in soluzione di Spalteholz indefinitamente.</li>
</ol>2. Imaging delle coclee
<ol><li>Attaccare le coclee a un'asta del campione all'estremità ovale e rotonda della membrana della finestra in modo che la soluzione di compensazione rimanga all'interno della coclea e non si formino bolle (Figura 2). Bisogna fare attenzione a non lasciare che si formino bolle all'interno della coclea in quanto sono difficili da rimuovere e se lasciate nel tessuto, causeranno artefatti di imaging.</li>
	<li>Utilizzare una colla attivante UV per fissare la coclea bagnata all'asta del campione asciutto (Figura 2). Attaccare la coclea alle estremità ovali e rotonde della finestra. Polimerizzare la colla UV per 10 secondi spostandosi intorno alla coclea con la luce UV. NOTA: Un attacco allentato della coclea all'asta del campione causerà difetti di imaging. Questa asta è prodotta appositamente per questo protocollo (vedi Santi et al.8 per i dettagli) ed è specifica per il nostro microscopio a foglio di luce.</li>
	<li>Sospendere la coclea nella camera di imaging riempita con la soluzione di Spalteholz per l'imaging. La camera del campione è una cella fluorometrica al quarzo otticamente trasparente (Video 1).</li>
	<li>Fissare l'asta del campione a un supporto rotante anch'esso collegato allo stadio di traslazione XZ. La maggior parte delle pile sono ottenute traslando il campione nei piani XZ, ma è anche possibile ottenere pile rotazionali.</li>
	<li>Sezionamento ottico TSLIM: utilizzare un laser blu o verde per l'eccitazione a seconda del tipo di colorazione al fluorocromo. Posizionare il foglio luminoso al centro del tessuto per la messa a fuoco e determinare l'ingrandimento che verrà utilizzato per illuminare l'intera larghezza della coclea. Quindi, utilizzare un programma progettato su misura per spostare il campione attraverso il foglio luminoso attraverso il campione sull'asse X (cucendo l'immagine) e in passi Z per creare una pila di immagini 2D in tutta la coclea.</li>
	<li>Per la prima immagine, la vita del fascio del foglio luminoso è posizionata sul bordo del campione e il programma scansiona l'intera larghezza del campione raccogliendo colonne di dati (vedi cucitura dell'immagine; Santi et al.8) che sono la larghezza del parametro confocale (Figura 3) per produrre un'immagine 2D composita di massima risoluzione su tutta la larghezza del campione. Il programma automatizza la cucitura delle immagini per ogni Z-step fino a quando il campione non è completamente ripreso.</li>
	<li>Elaborazione delle immagini: trasferire lo stack di immagini su un altro computer e caricarlo in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sezionamento ottico mediante microscopia a foglio di luce per l'esame delle strutture cocleari non è meccanicamente distruttivo come altri metodi istologici più tradizionali e fornisce una visione digitale completa delle strutture cocleari l'una rispetto all'altra. Metodi precedenti come i preparati superficiali dell'organo di Corti14 hanno fornito una mappa della perdita di cellule ciliate lungo la lunghezza della membrana basilare, ma la perdita di SGN non poteva essere valutata poiché il tes...

La coclea è l'organo sensoriale periferico per l'udito nei mammiferi. Ha una complessa anatomia a spirale di cellule sensoriali e di supporto ripetute che sono anatomicamente specializzate per rilevare le vibrazioni sonore e trasmetterle al cervello per la percezione dell'udito. I principali elementi sensoriali sono le cellule ciliate interne ed esterne e le loro fibre nervose innervanti i cui corpi cellulari compongono il ganglio a spirale, che risiede all'interno del canale di Rosenthal (Figura 1). Queste strutture sensoriali e neurali sono disposte tonotopicamente in modo tale che i suoni ad alta frequenza siano trasdotti nella base cocleare e i suoni a bassa frequenza siano trasdotti nell'apice2 della coclea. Una mappa anatomica di questa distribuzione cellulare sensoriale lungo la lunghezza della spirale della membrana basilare di supporto è chiamata citococleogramma3 e può essere confrontata con la perdita dell'udito in funzione della frequenza come raffigurato in un audiogramma.
Il labirinto membranoso della coclea, che è circondato da ossa dense, rende tecnicamente difficile esaminare più di una struttura cocleare alla volta. Pertanto, la logica per lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce è quella di produrre sezioni seriali ben allineate della coclea completa in modo che tutte le strutture cocleari possano essere esaminate l'una rispetto all'altra nelle ricostruzioni 3D. Voie et al.4 e Voie e Spelman5 progettarono il primo microscopio a foglio di luce, chiamato microscopio OPFOS (orthogonal plane fluorescence optical sectioning), per sezionare otticamente l'intera coclea. Tuttavia, questo microscopio non è mai stato sviluppato commercialmente; quindi, il nostro obiettivo era quello di costruire un microscopio a foglio leggero chiamato microscopio laser a foglio sottile (TSLIM; Figura 2). I dettagli di progettazione e costruzione di TSLIM sono stati precedentemente pubblicati8. TSLIM ha apportato diversi miglioramenti rispetto all'OPFOS, tra cui l'utilizzo di una fotocamera digitale a bassa illuminazione rispetto a una telecamera CCD per la raccolta di immagini, microposizionatori codificati otticamente per un movimento accurato e riproducibile del campione attraverso il foglio luminoso, l'uso di una camera del campione otticamente trasparente disponibile in commercio e la colorazione della rodamina in etanolo piuttosto che nella soluzione di compensazione per prevenire la precipitazione delle macchie all'interno del tessuto. Lo sviluppo commerciale di microscopi a foglio di luce come SPIM6 si è concentrato sull'imaging ad alta risoluzione di piccoli campioni trasparenti vivi, ma non sono adatti per l'imaging cocleare intero in quanto mancano di un'adeguata distanza di lavoro. Una rassegna dello sviluppo di altri microscopi a foglio di luce è stata pubblicata da Santi7. Il vantaggio principale di TSLIM rispetto ad altri metodi istologici per esaminare la coclea è quello di sezionare otticamente i tessuti per la ricostruzione 3D preservando l'integrità del campione in modo che possa essere utilizzato da altri metodi istologici. Un altro vantaggio dell'imaging TSLIM è che solo un sottile foglio di luce prodotto da un laser viene esposto al tessuto, rispetto all'esposizione all'intero spessore del tessuto al laser come nella microscopia confocale. La pulizia del tessuto per ridurre al minimo la dispersione della luce e il fatto che solo una piccola parte del tessuto sia esposta al laser si traduce in uno sbiadimento minimo del fluorocromo (fotosbiancamento) con l'imaging laser a foglio di luce. Tuttavia, il processo di fissazione, disidratazione e compensazione altera la morfologia delle strutture cocleari e provoca il restringimento dei tessuti rispetto al tessuto vivente. La quantità effettiva di restringimento tissutale che si verifica non è stata determinata.
TSLIM è stato sviluppato da Shane Johnson e otto studenti tedeschi di ingegneria ottica (vedi Riconoscimenti). I dettagli costruttivi di TSLIM sono stati forniti da Santi et al.8 e una versione di scansione (sTSLIM) da Schröter et al.9. TSLIM funziona come microtomo non distruttivo per i campioni a sezione ottica e come microscopio per raccogliere sezioni seriali 2D attraverso l'intera larghezza e spessore della coclea. TSLIM può visualizzare campioni piccoli (mm) e grandi (cm) di spessore. Le lenti sono montate ad aria per consentire lunghe distanze di lavoro con obiettivi di raccolta di 1x e 2x su un microscopio a dissezione. Il microscopio a dissezione ha anche un'ottica zoom che consente a TSLIM di risolvere le strutture subcellulari e sinaptiche sulle cellule. TSLIM è dotato di un laser blu (473 nm) e verde (532 nm) per l'illuminazione che consente di utilizzare una varietà di sonde fluorescenti per l'imaging. L'obiettivo di TSLIM è quello di produrre sezioni ottiche 2D ben allineate attraverso un'intera coclea per una ricostruzione digitale completa dei tessuti cocleari. Poiché si tratta di un metodo fluorescente, i ligandi e l'immunoistochimica possono anche essere utilizzati per identificare specifiche strutture cocleari.
Inizialmente, una lente cilindrica è stata utilizzata per produrre due fogli di luce gaussiani opposti, ma ha prodotto artefatti di imaging di assorbimento. A causa del lavoro di Keller et al.10, la lente cilindrica fissa è stata sostituita da uno specchio galvanometrico a scansione per produrre il foglio luminoso9. Inoltre, poiché il centro del foglio luminoso è il più sottile alla vita del fascio, le immagini 2D di sTSLIM vengono prodotte raccogliendo un composito di colonne di dati sull'asse X attraverso la larghezza del campione (Figura 3). Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Buytaert e Dircks11. Il software personalizzato TSLIM per guidare e raccogliere immagini è stato sviluppato utilizzando un programma grafico per il controllo dello strumento. Il foglio luminoso viaggia attraverso il campione e illumina un piano fluorescente all'interno del tessuto. Questo piano fluorescente viene proiettato ortogonalmente attraverso il campione trasparente e viene raccolto da un microscopio a dissezione. I microposizionatori codificati otticamente consentono di scansionare attraverso la vita del fascio nell'asse X per raccogliere una singola immagine 2D composita e, successivamente, il microposizionatore dell'asse Z sposta il campione su un piano più profondo all'interno del tessuto per ottenere una pila di immagini 2D sezionate seriali (Video 1, Figura 4). Una pila di immagini traslazionali viene raccolta attraverso l'intera larghezza, spessore e lunghezza della coclea e non è richiesta la cucitura delle immagini (Video 2). Lo stack di immagini viene trasferito su un altro computer e caricato in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D. Le pile di immagini contengono tutte le informazioni digitali sulla morfologia di una coclea alla risoluzione del microscopio. Tuttavia, se è richiesta una risoluzione più elevata, la coclea intatta può essere ulteriormente elaborata con metodi istologici distruttivi come il sezionamento del microtomo, la scansione e la microscopia elettronica a trasmissione.
Il programma di rendering 3D viene utilizzato per segmentare diverse strutture cocleari per il rendering 3D e l'analisi quantitativa. Per la segmentazione, ogni struttura in ogni immagine 2D della pila viene tracciata utilizzando un colore diverso da una tavoletta grafica e una penna (Figura 5). Ad oggi, sono state segmentate 20 diverse strutture cocleari (Figura 6). Dopo la segmentazione, è possibile eseguire una varietà di analisi 3D. Ad esempio, il software di rendering 3D può virtualmente resezionare la coclea in qualsiasi piano lungo il centroide della struttura. Il video 3 mostra il sezionamento tangenziale all'organo di Corti, che rivela le cellule ciliate lungo la lunghezza della membrana basilare. Questo processo richiede innanzitutto la segmentazione manuale della struttura di interesse. Successivamente, il centroide della struttura viene calcolato in base all'adattamento dei minimi quadrati dei punti spline posizionati lungo il centro della struttura dalla sua base al suo apice, consentendo così un'approssimazione della lunghezza della struttura (Video 4). Un processo simile chiamato scheletratura può essere utilizzato per visualizzare la larghezza radiale della struttura lungo la sua lunghezza utilizzando una mappa a colori (Video 4). Il volume totale di ogni struttura viene calcolato dal programma dopo la segmentazione, ma le distanze relative possono anche essere quantificate e visualizzate con mappe a colori in un software di rendering 3D (Figura 7). Le strutture segmentate possono anche essere esportate per produrre rendering di modelli in plastica solida ingranditi (Figura 8). Inoltre, il conteggio semi-automatico delle celle può essere eseguito anche utilizzando il software di rendering 3D (Figura 9). L'immunoistochimica e il legame del ligando possono essere utilizzati per colorare specifiche strutture cocleari e queste strutture possono essere isolate da altre strutture cocleari per la valutazione morfometrica come la produzione di un citococleogramma (Figura 10). Lunghezza, larghezza, superficie, volume e numero di tutte le strutture cocleari possono essere determinati dai modelli 3D, rendendo questo approccio ideale per mappare i danni cocleari alle menomazioni funzionali. In particolare, i danni cocleari dovuti all'invecchiamento, traumi indotti dal rumore o altri insulti possono essere mostrati e quantificati in ricostruzioni cocleari 3D da sezioni ottiche 2D. Una volta che una coclea è stata digitalizzata ci sono numerosi algoritmi di imaging che possono essere utilizzati per valutare il danno cocleare di qualsiasi tessuto all'interno della coclea nel registro anatomico ad altri tessuti cocleari.

<table><tbody><tr><td>Software di rendering 3D Amira</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Indirizzo: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>benzil benzoato (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td>Indirizzo: Casella postale, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>Bondic&nbsp;</td><td></td><td>Indirizzo: 235 Industrial Parkway S., Unità 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada</td></tr><tr><td>Etanolo 95% e 100%</td><td>Università del Minnesota</td><td></td><td>Indirizzo: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td>Indirizzo: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Programma grafico LabVIEW e Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Indirizzo: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>salicilato di metile (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td>Indirizzo: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione Olympus MVX10</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>Indirizzo: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Isotiocinato di rodamina B, (283924)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td>Indirizzo: Casella postale, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Cella flurometrica Starna (3-G-20)</td><td>Celle Starna Indirizzo</td><td></td><td>: Casella postale 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

La sordità è la menomazione sensoriale più comune, che colpisce circa il 5% o 430 milioni di persone in tutto il mondo secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità1. L'invecchiamento o presbiacusia è una causa primaria di perdita dell'udito neurosensoriale ed è caratterizzata da danni alle cellule ciliate, ai neuroni gangliari spiralati (SGN) e alla stria vascolare. Queste strutture risiedono all'interno della coclea, che ha una complessa anatomia a forma di spirale di tessuti membranosi sospesi nel fluido e circondati da osso. Queste proprietà rendono tecnicamente difficile indagare e quantificare i cambiamenti istopatologici. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un microscopio a foglio luminoso (TSLIM) in grado di visualizzare e digitalizzare l'intera coclea per facilitare lo studio delle relazioni struttura-funzione nell'orecchio interno. Le sezioni seriali ben allineate dell'intera coclea si traducono in una pila di immagini per il rendering tridimensionale (3D) del volume e la segmentazione delle singole strutture per la visualizzazione 3D e l'analisi quantitativa (cioè lunghezza, larghezza, superficie, volume e numero). Le coclee richiedono passaggi di elaborazione minimi (fissazione, decalcificazione, disidratazione, colorazione e pulizia ottica), tutti compatibili con la successiva imaging ad alta risoluzione mediante scansione e microscopia elettronica a trasmissione. Poiché tutti i tessuti sono presenti nelle pile, ogni struttura può essere valutata singolarmente o in relazione ad altre strutture. Inoltre, poiché l'imaging utilizza sonde fluorescenti, l'immunoistochimica e il legame del ligando possono essere utilizzati per identificare strutture specifiche e il loro volume o distribuzione 3D all'interno della coclea. Qui abbiamo usato TSLIM per esaminare le coclee di topi anziani per quantificare la perdita di cellule ciliate e neuroni gangliari a spirale. Inoltre, sono state utilizzate analisi avanzate (ad esempio, analisi dei cluster) per visualizzare le riduzioni locali dei neuroni ganglio spirale nel canale di Rosenthal lungo il suo volume 3D. Questi approcci dimostrano la capacità della microscopia TSLIM di quantificare le relazioni struttura-funzione all'interno e tra le coclee.

Poiché il tema di questo numero speciale è l'imaging degli effetti dell'invecchiamento nella coclea, verranno utilizzate come esempi una coclea giovane (3 mesi, HS2479, topo ceppo CBA) e di età (23 mesi, HS2521, topo ceppo C57). Va notato che TSLIM è in grado di visualizzare una varietà di campioni, tra cui coclee di esseri umani, mammiferi, altri roditori e pesci, nonché altri organi come il cervello.
Johnson et al. 13 hanno pubblicato un articolo sugli SGN in topi CBA...

È stato sviluppato un microscopio a foglio di luce per visualizzare e digitalizzare l'intera coclea.

Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Abbiamo sviluppato un microscopio a foglio di luce in grado di digitalizzare l'intera coclea. Questo microscopio ha obiettivi montati sull'aria con una lunga distanza di lavoro che possono visualizzare piccole coclee di topo fino a un grande osso temporale umano. Seziona serialmente la coclea con un raggio laser senza causare alcuna distruzione meccanica.Il nostro metodo di imaging può essere utilizzato per valutare i cambiamenti patologici nella coclea, come la perdita di cellule ciliate e neuroni ganglio spirale a causa dell'invecchiamento. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo, fai un'incisione dorsale-ventrale attraverso il cervello per emisecare il cranio. Rimuovere il cervello e identificare la bulla rotonda nella parte basoventrale del cranio.Apri la bulla con i rongeur. Quindi, visualizzare e rimuovere la coclea. Sotto un microscopio a dissezione a cinque volte l'ingrandimento, forare la finestra ovale e rimuovere le staffe con un plettro affilato.Quindi, inserire un plettro nella finestra rotonda per forare la membrana. Per eseguire la fissazione, coprire la finestra rotonda aperta con la punta tagliata di un set di infusione che è collegato a una siringa da un millilitro riempita con due millilitri di formalina. Infondere lentamente la formalina attraverso gli spazi perilinfatici di una coclea per un periodo di due minuti, assicurandosi che la formalina stia uscendo dalla coclea attraverso la finestra ovale aperta.Tagliare il tessuto in eccesso dalla coclea. Immergerlo in un flacone contenente il 10% di formalina e posizionarlo su un rotatore durante la notte. Per la decalcificazione, sciacquare la coclea in PBS tre volte per cinque minuti ciascuna.Immergere in un flacone contenente il 10% di soluzione di EDTA. Incubarlo per quattro giorni con rotazione, cambiando la soluzione ogni giorno. Quindi, perfondere la coclea con PBS tre volte e immergere per 15 minuti tra le modifiche per rimuovere tutto l'EDTA.Dopo il lavaggio, disidratare la coclea con concentrazioni crescenti di etanolo per 30 minuti in ciascuna concentrazione. Colorare l'intera coclea per immersione in soluzione di rodamina B durante la notte con rotazione. Rimuovere il colorante in eccesso dalla coclea con due cambiamenti di etanolo al 100% con incubazione per cinque minuti per ogni cambiamento.Trasferire la coclea colorata in due cambi di soluzione di Spalteholz per 30 minuti in ogni cambio. Lasciare per una notte nella soluzione di compensazione con rotazione. Attaccare la coclea a un'asta del campione all'estremità ovale e rotonda della membrana della finestra.Assicurarsi che la soluzione di compensazione rimanga all'interno della coclea e che non si formino bolle. Attaccare le estremità ovali e rotonde della coclea bagnata all'asta del campione asciutto usando la colla attivante UV. Polimerizzare la colla UV per 10 secondi spostandosi intorno alla coclea con una luce UV.Sospendere la coclea nella camera di imaging in una cella fluorometrica al quarzo otticamente trasparente riempita con soluzione di Spalteholz con l'asta del campione attaccata a un supporto rotante anch'esso collegato allo stadio di traslazione X/Z. Quindi, utilizzare un programma progettato su misura per spostare il campione attraverso il foglio luminoso nei passi dell'asse X e Z e creare una pila di immagini 2D in tutta la coclea. Per elaborare l'immagine, trasferire lo stack di immagini su un altro computer e caricarlo in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D.Il rendering diretto del volume di una coclea di topo mostrava le finestre ovali e rotonde, l'organo di Corti con cellule ciliate, il canale di Rosenthal era segmentato e il volume reso e mostrava neuroni gangliari a spirale, o SGN, lungo la sua lunghezza. Utilizzando TSLIM, la coclea di un topo giovane di tre mesi e di un topo di 23 mesi è stata ripresa e contata per gli SGN. I conteggi delle cellule SGN in funzione della distanza del canale di Rosenthal raffigurati in un grafico lineare hanno mostrato SGN maggiori nell'animale più giovane nel mezzo e nelle estremità apicali della coclea rispetto all'animale più anziano.Questa apparente perdita di SGN è stata visualizzata utilizzando l'analisi dei cluster e il software di rendering 3D. Le differenze di densità SGN sono state rappresentate su una scala di colori in cui i cluster ad alta densità sono gialli e il blu rappresenta le regioni a bassa densità. L'analisi dei cluster ha chiaramente rappresentato le regioni a bassa densità cellulare lungo la lunghezza del canale di Rosenthal.La microscopia a foglio luminoso è progettata per produrre una pila ben allineata di immagini da cui è possibile produrre rendering di volumi 3D di strutture. I programmi di rendering 3D consentono la valutazione quantitativa delle strutture e delle relazioni anatomiche tra le diverse strutture. Tuttavia, poiché i programmi di rendering 3D offrono molti parametri utente diversi, esiste una curva di apprendimento significativa per utilizzare questi programmi in modo efficace.

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Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell'arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l'imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

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Le ciglia primarie influenzano varie vie di segnalazione. La coclea dei mammiferi è ideale per esaminare la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP). La disfunzione delle ciglia colpisce la crescita cocleare, il patterning cellulare e l'orientamento delle cellule ciliate, le letture della PCP. Il nostro obiettivo è analizzare la segnalazione della PCP nella coclea murina attraverso l'analisi fenotipica, l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a scansione.

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