Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Abbiamo sviluppato un microscopio a foglio di luce in grado di digitalizzare l'intera coclea. Questo microscopio ha obiettivi montati sull'aria con una lunga distanza di lavoro che possono visualizzare piccole coclee di topo fino a un grande osso temporale umano. Seziona serialmente la coclea con un raggio laser senza causare alcuna distruzione meccanica.

Il nostro metodo di imaging può essere utilizzato per valutare i cambiamenti patologici nella coclea, come la perdita di cellule ciliate e neuroni ganglio spirale a causa dell'invecchiamento. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo, fai un'incisione dorsale-ventrale attraverso il cervello per emisecare il cranio. Rimuovere il cervello e identificare la bulla rotonda nella parte basoventrale del cranio.

Apri la bulla con i rongeur. Quindi, visualizzare e rimuovere la coclea. Sotto un microscopio a dissezione a cinque volte l'ingrandimento, forare la finestra ovale e rimuovere le staffe con un plettro affilato.

Quindi, inserire un plettro nella finestra rotonda per forare la membrana. Per eseguire la fissazione, coprire la finestra rotonda aperta con la punta tagliata di un set di infusione che è collegato a una siringa da un millilitro riempita con due millilitri di formalina. Infondere lentamente la formalina attraverso gli spazi perilinfatici di una coclea per un periodo di due minuti, assicurandosi che la formalina stia uscendo dalla coclea attraverso la finestra ovale aperta.

Tagliare il tessuto in eccesso dalla coclea. Immergerlo in un flacone contenente il 10% di formalina e posizionarlo su un rotatore durante la notte. Per la decalcificazione, sciacquare la coclea in PBS tre volte per cinque minuti ciascuna.

Immergere in un flacone contenente il 10% di soluzione di EDTA. Incubarlo per quattro giorni con rotazione, cambiando la soluzione ogni giorno. Quindi, perfondere la coclea con PBS tre volte e immergere per 15 minuti tra le modifiche per rimuovere tutto l'EDTA.

Dopo il lavaggio, disidratare la coclea con concentrazioni crescenti di etanolo per 30 minuti in ciascuna concentrazione. Colorare l'intera coclea per immersione in soluzione di rodamina B durante la notte con rotazione. Rimuovere il colorante in eccesso dalla coclea con due cambiamenti di etanolo al 100% con incubazione per cinque minuti per ogni cambiamento.

Trasferire la coclea colorata in due cambi di soluzione di Spalteholz per 30 minuti in ogni cambio. Lasciare per una notte nella soluzione di compensazione con rotazione. Attaccare la coclea a un'asta del campione all'estremità ovale e rotonda della membrana della finestra.

Assicurarsi che la soluzione di compensazione rimanga all'interno della coclea e che non si formino bolle. Attaccare le estremità ovali e rotonde della coclea bagnata all'asta del campione asciutto usando la colla attivante UV. Polimerizzare la colla UV per 10 secondi spostandosi intorno alla coclea con una luce UV.

Sospendere la coclea nella camera di imaging in una cella fluorometrica al quarzo otticamente trasparente riempita con soluzione di Spalteholz con l'asta del campione attaccata a un supporto rotante anch'esso collegato allo stadio di traslazione X/Z. Quindi, utilizzare un programma progettato su misura per spostare il campione attraverso il foglio luminoso nei passi dell'asse X e Z e creare una pila di immagini 2D in tutta la coclea. Per elaborare l'immagine, trasferire lo stack di immagini su un altro computer e caricarlo in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D.

Il rendering diretto del volume di una coclea di topo mostrava le finestre ovali e rotonde, l'organo di Corti con cellule ciliate, il canale di Rosenthal era segmentato e il volume reso e mostrava neuroni gangliari a spirale, o SGN, lungo la sua lunghezza. Utilizzando TSLIM, la coclea di un topo giovane di tre mesi e di un topo di 23 mesi è stata ripresa e contata per gli SGN. I conteggi delle cellule SGN in funzione della distanza del canale di Rosenthal raffigurati in un grafico lineare hanno mostrato SGN maggiori nell'animale più giovane nel mezzo e nelle estremità apicali della coclea rispetto all'animale più anziano.

Questa apparente perdita di SGN è stata visualizzata utilizzando l'analisi dei cluster e il software di rendering 3D. Le differenze di densità SGN sono state rappresentate su una scala di colori in cui i cluster ad alta densità sono gialli e il blu rappresenta le regioni a bassa densità. L'analisi dei cluster ha chiaramente rappresentato le regioni a bassa densità cellulare lungo la lunghezza del canale di Rosenthal.

La microscopia a foglio luminoso è progettata per produrre una pila ben allineata di immagini da cui è possibile produrre rendering di volumi 3D di strutture. I programmi di rendering 3D consentono la valutazione quantitativa delle strutture e delle relazioni anatomiche tra le diverse strutture. Tuttavia, poiché i programmi di rendering 3D offrono molti parametri utente diversi, esiste una curva di apprendimento significativa per utilizzare questi programmi in modo efficace.