Isolamento di piccoli follicoli preantrali dall'ovaio bovino utilizzando una combinazione di frammentazione, omogeneizzazione e filtrazione seriale

Questo protocollo consente l'isolamento efficiente e ripetibile dei follicoli pre-antrali in fase iniziale da un singolo ovaio bovino e crea nuove opportunità per lo studio della follicologenesi ovarica in una specie non bovina. Utilizzando un numero maggiore di follicoli da una singola ovaia, questa tecnica consente trattamenti in vivo prima del prelievo ovarico o l'ottenimento di più campioni nel tempo dallo stesso animale tramite biopsia ovarica. L'isolamento e la crioconservazione dei follicoli pre-antrali in fase iniziale possono essere un'opzione preziosa per la conservazione della fertilità nelle giovani donne sottoposte a trattamento gonadotossico come la chemioterapia, nonché per la conservazione del germoplasma da specie in via di estinzione.

A dimostrare la procedura saranno Stephanie McDonnell, Amanda Morton e Juliana Candelaria, dottorande del mio laboratorio. Per iniziare, trasferire le ovaie in laboratorio a PBS caldo e sterile contenente Pen-Strep e selezionare ovaie con molti piccoli follicoli antrali e nessun corpo lutezio prominente. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo in eccesso e grasso dalle ovaie usando le forbici.

Trasferire un'ovaia sul tagliere sulla carta da banco. Usando un bisturi, tagliare l'ovaio a metà longitudinalmente da un sito di attacco del legamento al sito di attacco opposto. Tenere una metà dell'ovaia sul tagliere da lavorare e riposizionare l'altra metà dell'ovaio in PBS caldo contenente Pen-Strep.

Per rimuovere il midollo, tagliare lungo la curvatura dell'ovaio a circa 2 millimetri di distanza dalla superficie senza tagliare la corteccia con il midollo esposto rivolto verso l'alto. Tagliare attraverso il taglio per rimuovere la maggior parte del midollo. Capovolgere l'ovaio a metà in modo che l'epitelio sia rivolto verso l'alto e utilizzare il bisturi per finire di tagliare il midollo lontano dalla corteccia e tagliare via qualsiasi tessuto connettivo bianco rimanente attorno al bordo del pezzo ovarico collegato ai legamenti.

Una volta rimossa la maggior parte del midollo, utilizzare il bisturi per tagliare la corteccia a circa 1 millimetro di spessore mentre si manipola il bisturi con piccoli movimenti avanti e indietro per radere via il resto del midollo, quindi tagliare ogni corteccia ovarica metà in due pezzi. Conservare i pezzi di corteccia in PBS caldo contenente Pen-Strep fino al momento di tritare. Trasferire un singolo pezzo della corteccia nella capsula di Petri sul tritatutto e bagnare il tessuto con tre o quattro gocce di PBS caldo contenente Pen-Strep.

Mentre si tiene fermo il pezzo di tessuto con un paio di pinze, premere una volta il pulsante Reset per avviare il trituratore di tessuti. Dopo che l'intero pezzo della corteccia è stato tagliato a strisce, utilizzare la manopola del supporto della lama per sollevare la lama dalla piastra di Petri e la pinza per rimuovere qualsiasi tessuto dalla lama. Dopo aver ruotato il supporto della piastra di 90 gradi, di nuovo, premere il pulsante Reset e passare interamente la lama attraverso le strisce di tessuto.

Utilizzare la manopola del supporto della lama per sollevare la lama dalla piastra di Petri e la pinza per rimuovere qualsiasi tessuto dalla lama come dimostrato in precedenza. Utilizzando una pipetta di trasferimento e PBS caldo contenente Pen-Strep, lavare il tessuto tritato in un tubo conico da 50 millilitri preriscaldato. Riportare il tubo conico nell'acqua o nel bagno di perline per mantenere caldo il tessuto tritato mentre si ripete la procedura di taglio con le altre tre metà dell'ovaio.

Per ottenere i migliori risultati di taglio, utilizzare il driver del dado per rimuovere il dado dal braccio di taglio e rimuovere la rondella e la chiusura della lama. Usando una pinza, rimuovere la lama dal braccio di taglio. Capovolgerlo in modo che il bordo inutilizzato sia rivolto verso la piastra di Petri e riposizionarlo sul braccio di taglio.

Dopo essersi assicurati che l'unità omogeneizzatore sia collegata e che la velocità sia impostata sulla seconda barra, inserire la sonda del generatore da 10 millimetri nell'unità in base alle specifiche del produttore. Quindi, impostare un timer per 1 minuto e inserire la sonda nel tubo conico da 50 millilitri contenente il tessuto della corteccia tritato da un'ovaia e abbastanza PBS contenente Pen-Strep per riempire il tubo alla linea da 25 millilitri. La profondità a cui è inserita la sonda deve essere 1/3 dell'altezza del liquido misurata dal fondo della camera.

Una volta avviato il timer, accendere l'omogeneizzatore, assicurandosi che la parte inferiore della sonda non tocchi il tubo e tenere fermo il tubo mentre l'omogeneizzatore è acceso. Dopo 1 minuto di omogeneizzazione, rimuovere la sonda dal tubo, quindi rimuovere qualsiasi tessuto connettivo che ostruisce i fori di sfiato nello spazio tra il coltello del rotore e il tubo rotore o i pezzi di corteccia bloccati nella sonda usando una pinza e rimetterli nel tubo. Versare il tessuto disperso nell'imbuto ricoperto di garza, inserito nel pallone Erlenmeyer e sciacquare il contenuto del tubo nell'imbuto usando PBS caldo.

Infine, sciacquare la garza con PBS caldo. Forzare il liquido in piccoli frammenti a passare attraverso i fori del panno ruotando la garza attorno ai frammenti di tessuto verso il basso e schiacciando fino a quando tutto il liquido e il tessuto in eccesso vengono rimossi dalla garza. Dopo aver riaperto la garza sull'imbuto, sciacquare la garza con PBS contenente Pen-Strep usando una pipetta di trasferimento e, di nuovo, spremere eventuali frammenti di tessuto residui attraverso il panno.

Utilizzando un emostato, tenere il filtro cellulare da 300 micrometri su un becher da 200 millilitri e versare il filtrato nel pallone Erlenmeyer attraverso il filtro cellulare. Se il filtro cellulare si intasa di tessuto, picchiettarlo delicatamente contro il becher e capovolgere il colino e toccare i grandi detriti di tessuto sulla carta da banco. Risciacquare il contenuto del matraccio con PBS caldo contenente Pen-Strep fino a quando non rimangono frammenti di tessuto e versarlo nel filtro cellulare.

Successivamente, tenendo il filtro cellulare da 40 micrometri con un emostatico su un secondo becher da 200 millilitri, versare tutto il filtrato iniziale presente nel primo becher da 200 millilitri attraverso il filtro, quindi sciacquare il contenuto del becher usando PBS caldo contenente Pen-Strep fino a quando non rimangono frammenti di tessuto e versarlo nel filtro cellulare. Dopo aver inserito l'ago da 18 gauge sulla siringa da 20 millilitri, riempire la siringa con il mezzo di lavaggio del follicolo. Con un emostato, tenere il filtro cellulare da 40 micrometri capovolto su una capsula di Petri quadrata e utilizzare la siringa per lavare il contenuto del filtro cellulare nel piatto.

Trasferire la capsula di Petri quadrata su uno stereoscopio con un palcoscenico caldo impostato a 38,5 gradi Celsius con un ingrandimento impostato tra 1,25 e 3,2x. Dopo aver identificato i follicoli dalla capsula di Petri quadrata, trasferire il follicolo per lavare le gocce medie usando la micropipetta. Il numero totale di follicoli pre-antrali isolati per replica utilizzando l'omogeneizzazione tissutale di 6 minuti mostra una media di 41 follicoli per replica, che vanno da 11 a 135 follicoli.

La valutazione dello stadio di sviluppo di 476 follicoli isolati ha mostrato che la maggior parte erano nella fase primaria di sviluppo, misurando da 40 a 79 micrometri in uno strato di cellule cuboidali della granulosa. L'omogeneizzazione della corteccia ovarica per 6 minuti ha prodotto un numero maggiore di follicoli pre-antrali rispetto a 5 minuti di omogeneizzazione alla stessa velocità. L'espressione del recettore FSH del marcatore delle cellule granulari e del marcatore delle cellule germinali DAZL nei follicoli è stata valutata utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa dimostrando che sia i follicoli primari che quelli secondari iniziali esprimevano il recettore FSH e i trascritti DAZL.

La localizzazione immunofluorescente di CX37 in follicoli pre-antrali isolati sia allo stadio primario che all'inizio del secondario mostra che CX37 era localizzato nel plasma O, essendo assente dal nucleo del sito O e dalla membrana delle cellule della granulosa. Nella nostra esperienza, la corretta dissezione di un sottile strato di tessuto corticale, il taglio del tessuto alla giusta dimensione e la corretta omogeneizzazione sono passaggi critici per garantire il rilascio di follicoli vitali dal tessuto. I follicoli pre-antrali isolati possono essere utilizzati per rispondere a domande come la regolazione della crescita del follicolo pre-antrale e la natura delle interazioni tra le cellule della granulosa e l'ovocita, facilitando così lo sviluppo di condizioni di coltura più efficienti.