Sterilizzazione con radiazioni gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati

Questo protocollo fornisce un processo di sterilizzazione completo per qualsiasi organo non sterile senza alterarne le caratteristiche. L'obiettivo principale di questa tecnica include la possibilità di sterilizzare un organo senza alterarne le proprietà. Sebbene questa tecnica si sia concentrata sulle trachee, ha dimostrato che dosi di radiazioni gamma più basse possono sterilizzare efficacemente i materiali biologici.

Un individuo può affrontare il problema definendo la dose efficace più bassa per i diversi tipi di organi. Quindi, si consiglia di iniziare con un dosaggio più basso e aumentarli fino al raggiungimento della sterilizzazione. Inizia sezionando la trachea sezionata dai conigli bianchi della Nuova Zelanda eutanasia, o Oryctolagus cuniculus, in pezzi di due centimetri.

Con le forbici, rimuovere il tessuto connettivo circostante e lo strato mucoso interno. Immergere i campioni in 12 millilitri di soluzione PBS contenente SDS, 5% penicillina streptomicina e 5% amfotericina. Sottoporre le trachee a costante agitazione con un agitatore magnetico a 400 RPM per cinque settimane a temperatura ambiente.

Settimanalmente, dare due ore di shock osmotico immergendo le trachee in acqua distillata prima di cambiare il mezzo. Dopo cinque settimane, criogenizzare i campioni di trachea utilizzando una miscela da 12 millilitri di 80% FBS e 20% DMSO in un contenitore di congelamento a meno 80 gradi Celsius. Dopo 13-15 giorni, scongelare le trachee a bagnomaria a 37 gradi Celsius.

Quindi, lavarli con PBS. Per irradiare il campione, posizionare quattro pezzi tracheali in 20 millilitri di PBS in flaconi di coltura di metacrilato T25, evitando la formazione di bolle. Condurre l'irradiazione utilizzando un acceleratore lineare con fotoni di un'energia nominale di 10 megavolt che appiattiscono fasci senza filtro.

Applicare una dose di 2.400 unità di monitoraggio al minuto e impostare altri parametri come descritto nel manoscritto. Una volta fatto, coltivare il campione in 30 millilitri di DMEM integrato con FBS inattivato al 10% senza antibiotici o antimicotici. Incubare la coltura in un incubatore tissutale standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due settimane e ispezionarla ogni 24 ore per parametri di contaminazione come pH medio, colore e variazioni di torbidità.

Condurre prove di trazione su una macchina di prova universale per desktop di trazione o controllo dello spostamento UTM, dotata di sensori di forza e posizione e di un computer con software appositamente progettato. Registra i dati ogni 0,4 secondi ed esportali in un foglio di calcolo. Costruire ganasce di trazione adattate al calibro medio delle trachee di coniglio da puro polivinilcloruro cristallino non tossico monostrato o tubi cavi in PVC.

Sezione le condotte in segmenti lunghi tre centimetri. Per eseguire la sutura terminale-terminale senza pregiudizi, praticare 12 fori preformati a due millimetri dal bordo delle mascelle, separati da 2,5 millimetri. Successivamente, attaccare i tubi di vetro in PVC alla trachea del coniglio mediante anastomosi termino-terminale con una sutura continua di monofilamento di nylon 6-0 attraverso fori di cinque millimetri eseguiti alternativamente presenti a due millimetri di distanza dal bordo della trachea.

Allunga tutti i pezzi a una velocità di spostamento di 5,0 millimetri al minuto. Quindi, registra le variabili, come lo stress e la deformazione massimi, l'energia immagazzinata per unità di volume della trachea e il modulo di Young. Eseguire test di compressione radiale su un UTM desktop di compressione dotato di una cella di carico da 15 newton per ottenere dati di forza, posizione e tempo.

Registra i dati ed esporta in fogli di calcolo a intervalli di 0,5 secondi. Posizionare le trachee con l'area membranosa appoggiata sulla piastra inferiore prima del graduale aumento della piastra verso la piastra superiore ad una velocità costante di cinque millimetri al minuto. Calcola ogni variabile per unità di lunghezza del campione, rigidità e l'energia per unità di superficie necessaria per occludere completamente la trachea.

Posizionare uno stent sterile in PVC intraluminale di dimensione 14, garantendo un margine da tre a quattro millimetri a ciascuna estremità. Fissare lo stent con un singolo punto monofilamento di nylon 6-0 attraverso lo spazio intercartilagineo della prima cartilagine. In condizioni asettiche e con materiale sterile, effettuare un'incisione toracica centrale longitudinale di tre centimetri e raccogliere lembi peduncolari bilaterali composti da fascia pettorale e una componente muscolare.

Avvolgere le trachee con il lembo in quattro conigli, una trachea su ciascun hemathorax. Una volta completato l'intervento chirurgico, invertire l'anestesia interrompendo la somministrazione di isoflurano. Degli otto pezzi che sono stati esposti a 0,5 kilogray di radiazioni, due pezzi hanno mostrato un cambiamento nel colore dei media entro una settimana.

Tuttavia, nessuno dei pezzi che sono stati irradiati a uno o due kilogray ha mostrato alcun cambiamento nel colore dei supporti. Rispetto al controllo, non sono stati rilevati cambiamenti nel modello di distribuzione del collagene o delle fibre elastiche nei campioni analizzati irradiati a diverse dosi di radiazioni. I dati ottenuti nella prova di trazione sulle trachee irradiate sono riportati qui.

Le curve di deformazione da sforzo per le trachee decellularizzate e irradiate non hanno rivelato cambiamenti rispetto alle trachee non sterilizzate. Vengono mostrati i test di compressione eseguiti sulle trachee native o sui controlli e le trachee decellularizzate, crioconservate e irradiate. I grafici corrispondenti hanno mostrato che l'irradiazione non ha modificato la percentuale di occlusione rispetto alla trachea nativa.

L'irradiazione gamma ha causato una diminuzione clinicamente minima ma statisticamente significativa delle caratteristiche radio-biomeccaniche e della forza variabile per unità di lunghezza. L'esame istologico ha mostrato il tessuto connettivo altamente organizzato nella forma del pericondrio della trachea nativa. La cartilagine era intatta e non mostrava segni di necrosi.

Quando si impianta un elemento radiologico in un essere vivente, la sterilità dell'impianto e il processo sterile sono fondamentali per evitare infezioni e rigetti tissutali. C'è una vasta gamma di organi da impiantare dopo la generazione di tessuti e dovrebbero essere sterili. Seguendo questo processo è possibile ottenere una sterilizzazione completa senza influire sulle caratteristiche principali dell'organo.