Name: Sterilizzazione con radiazioni gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Scopri la sterilizzazione con irradiazione gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati di conigli. Questo metodo preserva le proprietà biomeccaniche del tessuto garantendo la sterilità necessaria per il trapianto sicuro.

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Questo documento è stato supportato dalla Sovvenzione 2018 della Società Spagnola di Chirurgia Toracica allo Studio Nazionale Multicentrico [Numero 180101 assegnato a Néstor J.Martínez-Hernández] e PI16-01315 [assegnato a Manuel Mata-Roig] dall'Instituto de Salud Carlos III. CIBERER è finanziato dal VI Piano Nazionale R&S&I 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions e dall'Instituto de Salud Carlos III, con l'assistenza del Fondo Europeo di Sviluppo Regionale.

La direttiva europea 20170/63/UE per la cura e l'uso degli animali da laboratorio è stata rispettata e il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Valencia (Legge 86/609/CEE e 214/1997 e Codice 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 del Governo di Valencia, Spagna).
1. Decellularizzazione tracheale
NOTA: Il metodo di decellularizzazione è stato riportato altrove20.
<ol><li>Eutanasia di conigli bianchi neozelandesi maschi adulti donatori (Oryctolagus cuniculus) del peso di 3,5-4,1 kg con 133 mg/kg di pentobarbital sodico, utilizzando un'iniezione di 200 mg/ml attraverso la vena marginale dell'orecchio.</li>
	<li>Garantendo condizioni asettiche, eseguire una cervicotomia longitudinale centrale, sezionare i muscoli cervicali e avvicinarsi alla trachea. Sezionare l'organo circonferenzialmente e longitudinalmente. Infine, transetto sotto il primo anello e appena sopra la carena.</li>
	<li>Con un bisturi, sezionare le trachee in pezzi di 2 cm. Con le forbici, rimuovere il tessuto connettivo circostante e lo strato di mucosa interna6.</li>
	<li>Immergere i campioni in 12 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente il 2% di sodio dodecilsolfato (SDS), il 5% di penicillina-streptomicina e il 5% di amfotericina B.</li>
	<li>Sottoporre le trachee ad agitazione costante con un agitatore magnetico a 400 giri / min per 5 settimane a temperatura ambiente. Sostituire settimanalmente la soluzione di decellularizzazione dopo uno shock osmotico di 2 ore, mediante immersione della trachea in acqua distillata.</li>
	<li>Criogenetizzare i campioni utilizzando una miscela da 12 ml di siero bovino fetale (FBS) all'80% e dimetilsolfossido (DMSO) al 20% in un contenitore di congelamento a -80 °C.</li>
	<li>Quando le trachee verranno utilizzate (dopo 13-15 giorni), scongelarle a bagnomaria a 37 °C e lavarle immergendole in PBS al termine dello scongelamento.</li>
</ol>2. Sterilizzazione
<ol><li>Irradiamento<ol><li>Introdurre i lotti di quattro pezzi tracheali di 2 cm ciascuno in un matraccio da 20 mL di metacrilato in un matraccio di coltura T25 riempito con PBS fino a raggiungere un volume totale di 30 ml. Fare attenzione a prevenire la formazione di bolle, che potrebbero causare la diffusione di energia nell'interfaccia aria-liquido.</li>
		<li>Condurre l'irradiazione utilizzando un acceleratore lineare, con fotoni di un'energia nominale di 10 MV che appiattiscono fasci liberi di filtri. Applicare un'intensità di dose di 2.400 unità di monitoraggio al minuto all'isocentro, ponendo le trachee ad una distanza sorgente-superficie di 100 cm da irradiare, con una profondità di campo di 2,5 cm per un campo di radiazione di 10 cm x 10 cm - in modo da coprire l'intero contenitore - corrispondente ad una dose di 24 Gy/min.</li>
		<li>Aumentare le dosi con ogni lotto di quattro pezzi; quattro pezzi saranno sottoposti a 0,5 kGy, da quattro a 1 kGy, da quattro a 2 kG, ecc., Fino al raggiungimento della sterilizzazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura<ol><li>Introdurre i pezzi in 30 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con FBS inattivato al 10% senza antibiotici o antimicotici.</li>
		<li>Coltivarli in un incubatore tissutale standard a 37 °C e 5% di CO 2 per2 settimane e ispezionarli ogni 24 ore. NOTA: I parametri di contaminazione sono cambiamenti nel pH del terreno di coltura e, di conseguenza, cambiamenti nel colore e nella torbidità del terreno. Le trachee sono state raccolte da lagomorfi privi di germi, che non erano malati e, quindi, ci si aspettava che fossero privi di batteri anaerobici nelle loro trachee.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi istologica
NOTA: Macchiare i pezzi usando ematossilina ed eosina21, tricroma di Masson e orceina22.
<ol><li>Colorazione DAPI<ol><li>Determinare la vitalità tissutale utilizzando DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo). Questa colorazione blu-fluorescente si lega fortemente alle regioni ricche di adenina e timina nelle sequenze di DNA e quindi consente di visualizzare il DNA tramite microscopia a fluorescenza.</li>
		<li>Incorporare i campioni di tessuto nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).</li>
		<li>Tagliare i campioni usando un criostato.</li>
		<li>Lavare il campione da tingere tre volte in acqua distillata per rimuovere l'OCT. Posizionare in un mezzo di montaggio che includa una soluzione 30 nM di DAPI.</li>
		<li>Visualizza la fluorescenza utilizzando la microscopia a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi del contenuto di DNA<ol><li>Tagliare segmenti di trachea lunghi circa 3 mm usando un bisturi.</li>
		<li>Incubare per 2 ore in proteinasi K (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Estrarre il DNA con un kit di estrazione del DNA, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Per mezzo della spettrofotometria, determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza a 260/280 utilizzando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Misurare la dimensione dei campioni di DNA estratti utilizzando la cromatografia capillare con un bioanalizzatore.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Studio biomeccanico
NOTA: La resistenza tracheale alle forze longitudinali e trasversali viene misurata mediante prove di trazione assiale e di compressione radiale23.
<ol><li>Misurazione tracheale<ol><li>Misurare la lunghezza tracheale, lo spessore della parete e il diametro esterno utilizzando una pinza Vernier.</li>
		<li>Calcola i valori medi di tre misurazioni casuali di ciascuna delle variabili.</li>
		<li>Nei test di compressione radiale, calcolare il diametro anteroposteriore rilevando il punto in cui la piastra entra in contatto con il campione.</li>
		<li>Eseguire tutti i test a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Prove di trazione<ol><li>Eseguire prove di trazione su una macchina di prova universale (UTM) per la trazione con controllo dello spostamento della macchina di prova universale (UTM), dotata di un carico di 100 N (risoluzione della forza 0,1 N, 0,001 mm di posizione e 0,1 s). La macchina di prova è dotata di sensori di forza e posizione, ed è collegata ad un computer con software appositamente progettato dal produttore23.</li>
		<li>Registra i dati ogni 0,4 s ed esporta in un foglio di calcolo.</li>
		<li>Costruire ganasce di trazione adattate al calibro medio delle trachee di coniglio da tubi cavi in polivinilcloruro (PVC) cristallino monostrato puro e atossico con un diametro esterno di 1 cm e uno spessore della parete di 1,5 mm.</li>
		<li>Sezione le condotte in segmenti lunghi 3 cm.</li>
		<li>Praticare 12 fori preformati per la sutura termino-terminale, a 2 mm dal bordo delle ganasce e separati da una distanza di 2,5 mm, per evitare distorsioni dovute alle suture.</li>
		<li>Attaccare i tubi di vetro in PVC alla trachea del coniglio mediante anastomosi termino-terminale con una sutura continua attraverso fori preformati alternati (ogni 5 mm), a 2 mm di distanza dal bordo della trachea e con una sutura monofilamento di nylon 6-0.</li>
		<li>Allungare tutti i pezzi con una velocità di spostamento di 5,0 mm/min.</li>
		<li>Registrare le variabili massima sollecitazione (σ max, in N/mm2) e deformazione (εmax, senza unità), insieme all'energia immagazzinata per unità di volume tracheale (W/Vol, in mJ/mm) e al modulo di Young (E, in MPa).</li>
	</ol></li>
	<li>Test di compressione radiale<ol><li>Eseguire test di compressione radiale su un UTM desktop di compressione, dotato di una cella di carico da 15 N (risoluzione forza 0,001 N, posizione 0,001 mm e tempo 0,1 s) per ottenere dati di forza (N), posizione (mm) e tempo (s). Registra i dati ed esporta su foglio di calcolo a intervalli di 0,5 s.</li>
		<li>Posizionare le trachee con la zona membranosa appoggiata sulla piastra inferiore. La piastra sale gradualmente verso la piastra superiore ad una velocità costante di 5 mm/min.</li>
		<li>Calcolare ogni unità per unità di lunghezza del campione (f in N/mm), rigidità (R in Mpa·mm) e l'energia per unità di superficie (W / S in mJ / mm2) necessaria per occludere completamente la trachea.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tecnica chirurgica
NOTA: La tecnica chirurgica è stata ampiamente riportata altrove20.
<ol><li>Posizionare uno stent sterile in PVC intraluminale, di dimensioni 14 Fr (che gli consenta di scivolare liberamente senza comprimere le pareti), con un margine di 3-4 mm a ciascuna estremità.</li>
	<li>Fissare lo stent con un singolo punto monofilamento di nylon 6-0 attraverso lo spazio intercartilagineo della prima cartilagine.</li>
	<li>Procedere ad anestetizzare i conigli.<ol><li>Pre-medicare i soggetti (conigli bianchi neozelandesi maschi di 3,65-4,05 kg) con analgesici intramuscolari (35 mg/kg di ketamina) con un sedativo, miorilassante e analgesico (2,5 mg/kg xilazina).</li>
		<li>Rasare la zona di incisione fuori dalla zona operatoria e pulire l'area chirurgica per rimuovere i capelli.</li>
		<li>Somministrare analgesici più profilassi antibiotica: 0,05 mg/kg di buprenorfina intramuscolare e 10 mg/kg di enrofloxacina.</li>
		<li>Metti un catetere venoso nella vena dell'orecchio marginale di ciascun coniglio.</li>
		<li>Indurre l'anestesia con un bolo endovenoso di 10 mg/kg di propofol.</li>
		<li>Monitorare i segni vitali dell'animale utilizzando un elettrocardiogramma a tre derivazioni, pulsossimetria e misurazione della pressione non invasiva. Ogni 30 minuti, applicare siero fisiologico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.</li>
		<li>Verificare il piano anestetico utilizzando il metodo del pizzicamento della punta.</li>
		<li>Mantenere l'anestesia con isoflurano inalato all'1,5%-2% della concentrazione alveolare minima senza perdere la ventilazione spontanea e fornire supporto termico al coniglio con una piastra riscaldante.</li>
	</ol></li>
	<li>Disinfettare la zona di incisione più volte con un movimento circolare con uno scrub a base di iodio. In condizioni asettiche in ogni momento e con materiale sterile, praticare un'incisione toracica centrale longitudinale di 3 cm e raccogliere lembi peduncolari bilaterali composti da fascia pettorale e una componente muscolare.</li>
	<li>Avvolgere le trachee con il lembo in quattro conigli, uno su ciascun emitorace (quindi, un totale di otto trachee).</li>
	<li>Quando l'intervento è completato, invertire l'anestesia interrompendo la somministrazione di isoflurano.</li>
	<li>Periodo post-chirurgico<ol><li>Tenere gli animali in sala operatoria fino a quando non si sono completamente ripresi dall'anestesia. Quando si sono completamente ripresi, riportateli nel loro ambiente con altri conigli.</li>
		<li>Trattare i conigli con antibiotici (0,5 ml/kg di enrofloxacina al 2,5%) e analgesici (5 mg/ml di meloxicam; 0,05 ml/kg di metacam) ogni 24 ore per 5 giorni.</li>
		<li>Lasciare gli impianti in situ per il tempo desiderato.</li>
		<li>Prima dell'eutanasia, premedicare i conigli con analgesici intramuscolari (35 mg/kg di ketamina) e un sedativo, miorilassante e analgesico (2,5 mg/kg di xilazina). Quindi eutanasia i conigli con 133 mg / kg di pentobarbital sodico usando un'iniezione di 200 mg / ml attraverso la vena dell'orecchio marginale e raccogliere le trachee.</li>
		<li>Eseguire test biomeccanici e istologici sulle trachee.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Analisi statistica
<ol><li>Regolare tutti i modelli con il metodo bayesiano sul software R, versione 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).</li>
	<li>Analizzare le variabili di studio, ad eccezione di f e R, utilizzando più modelli di regressione lineare.</li>
	<li>Per le variabili f e R , applicare modelli di regressione lineare mista. In questi modelli, oltre alle variabili di interesse legate al trattamento e alla condizione di ogni trachea, introdurre la percentuale di occlusione come effetto monotono e un termine indipendente per trachea come fattore casuale.</li>
</ol>

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</ol>

Nessuno degli autori ha alcun conflitto di interessi.

Esistono diverse strategie di sterilizzazione. La CO2supercritica penetra completamente nei tessuti, acidificando il mezzo e decostruendo il doppio strato fosfolipidico cellulare con semplice eliminazione mediante depressurizzazione dell'impianto 8,14,25. È stata utilizzata anche la radiazione ultravioletta ed è stata pubblicata la sua efficacia nella trachea dei roditori, sebbene ci siano solo pochi rapporti in lette...

La sterilizzazione di un impianto è un requisito fondamentale per la sua vitalità; Infatti, le protesi che si sono dimostrate efficaci sono quelle impiantate in zone sterili (vasi sanguigni, cuore, ossa, ecc.) 1. La trachea ha due superfici: una superficie a contatto con l'ambiente esterno, che quindi non è sterile, e una superficie verso il mediastino, che è sterile. Pertanto, dal momento in cui la trachea viene estratta, non è un organo sterile. Nonostante il successivo processo di decellularizzazione venga effettuato in condizioni di massima sterilità, non si tratta di una fase di sterilizzazione2. L'impianto di materiale estraneo comporta di per sé un rischio di infezione dovuto al microambiente probatterico che produce3e un rischio fino allo 0,014% di trasmissione della malattia dal donatore al ricevente, anche se il materiale è stato sterilizzato4. Per garantire una corretta vascolarizzazione della trachea, in quasi tutti i protocolli sperimentali di trapianto, viene prima sottoposto a impianto eterotopico 5,6,7 in una zona sterile (muscolo, fascia, omento, sottocutaneo, ecc.); Questo perché l'impianto di un elemento non sterile in questo mezzo porterebbe all'infezione dell'area3.
Ci sono una serie di possibili strategie per ottenere un impianto sterile. L'uso di CO2supercritico ha raggiunto la sterilizzazione terminale 8,9. Altri metodi, come la radiazione ultravioletta o il trattamento con sostanze come acido peracetico, etanolo, perossido di ossigeno e acqua elettrolizzata, hanno ottenuto percentuali di successo diverse nella sterilizzazione, quasi sempre a seconda dei loro dosaggi, ma hanno dimostrato di influenzare le caratteristiche biomeccaniche degli impianti. In effetti, alcune sostanze, come l'ossido di etilene, possono modificare sostanzialmente la struttura della matrice impiantata e possono persino causare effetti immunogenici indesiderati. Per questo motivo, molte di queste strategie non possono essere applicate ai modelli biologici 2,10,11,12,13.
La strategia di sterilizzazione più studiata e accettata è quella stabilita dalla norma ISO 11737-1:2006 per la sterilizzazione di dispositivi medici impiantati nell'uomo, con una dose di radiazioni gamma di 25 kGy. Tuttavia, questo regolamento si concentra solo sulla sterilizzazione di elementi inerti e non biologici14,15. Inoltre, le dosi di radioterapia nel trattamento radicale del carcinoma sono inferiori di tre ordini di grandezza rispetto a quelle utilizzate per sterilizzare i dispositivi medici1. Con questo in mente, possiamo concludere che tale dose non solo ucciderebbe il microbiota, ma distruggerebbe e altererebbe radicalmente la struttura biologica dell'impianto. C'è anche la possibilità che generi lipidi residui al momento della degradazione, che possono potenzialmente essere citotossici e accelerare la degradazione enzimatica dello scaffold 13,14,15,16,17, anche quando si utilizzano dosi basse come 1,9 kGy e con danni direttamente proporzionali alla dose di radiazioni ricevuta 17.
Pertanto, l'obiettivo di questo lavoro è cercare di identificare la dose di radiazioni che consente di ottenere un impianto sterile con effetti nocivi minimi causati dall'irradiazione 2,18,19. La strategia che abbiamo seguito prevedeva l'irradiazione di trachee decellularizzate e irradiate a diverse dosi aumentate all'interno di un intervallo di kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy, ecc.), fino a raggiungere una coltura negativa. Ulteriori test sono stati effettuati per quelle dosi che hanno raggiunto colture negative, al fine di confermare la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose minima per ottenere la sterilizzazione, è stato controllato l'impatto strutturale e biomeccanico dell'irradiazione sulla trachea. Tutte le metriche sono state confrontate con le trachee di coniglio native di controllo. La sterilizzazione del costrutto è stata poi testata in vivo impiantando le trachee nei conigli bianchi della Nuova Zelanda.

<table><tbody><tr><td>Sutura monofilamento di nylon 6-0&nbsp;</td><td>Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, Stati Uniti</td><td>SN-5698G</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Buprex. Reckitt Benckiser Sanità; Hull, Reino Unido</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>Compression desktop UTM</td><td>Microtest, Madrid, Spagna</td><td>EM1/10/FR</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania</td><td>CM3059</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientifico; Waltham, MA, USA</td><td>Kit di estrazione del DNA 11965084</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit di estrazione DNeasy Quiagen, Hilden, Germania</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina, 2,5%</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germania</td><td>0035-0002</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spagna</td><td>SH20898.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germania)</td><td>DM2500??</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento&nbsp;</td><td>Il signor Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spagna</td><td>&nbsp; 5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>isofluorano</td><td>isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spagna&nbsp;</td><td>8.43603E+12</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Imalgene. Merial; Toulouse, Francia</td><td>BOE127823</td><td></td></tr><tr><td>Acceleratore lineare&nbsp;</td><td>"Vero raggio". Varian, Palo Alto, California, USA</td><td>H191001</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Agitatore orbitale PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia</td><td>BS-010144-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam 5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germania</td><td>6283-MV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Dolethal. Vetochinolo; Madrid, Espa&ntilde; a</td><td>3.60587E+12</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>P2272</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania</td><td>G 151030</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA</td> Tubi cavi in PVC <td>S3020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italia</td><td>stent in PVC hhdddyyZ</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turchia</td><td>019 5305 1</td><td></td></tr><tr><td>R software, versione 3.5.3 R Core</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>R 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>8,17,034</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Nanodrop, Life Technologies; Isogen Scienze della vita. Utrech, Paesi Bassi</td><td>Foglio di calcolo ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microsoft Excel per Mac, versione 16.23, Redmond, WA, USA</td><td>2864993241</td><td></td></tr><tr><td>Macchina di prova universale di trazione&nbsp;</td><td>Macchine di prova, Veenendaal, Paesi Bassi</td><td>84-01</td><td></td></tr><tr><td>UTM Software</td><td>TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA&nbsp;</td><td>100-093-627 F</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montaggio medio&nbsp;</td><td>Laboratori Vettoriali, Burlingame; CA; USA</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>xilacino</td><td>xilagesico. Calier; Barcellona, Espa&ntilde; un</td><td>20102-003</td><td></td></tr></tbody></table>

sterilizzazione con radiazioni gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati

Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts

Uno dei principali aspetti chiave per garantire che un trapianto si evolva correttamente è la sterilità del terreno. Il trapianto tracheale decellularizzato comporta l'impianto di un organo che era originariamente a contatto con l'ambiente, quindi non essendo sterile fin dall'inizio. Mentre il protocollo di decellularizzazione (attraverso l'esposizione di detergenti [2% di sodio dodecilsolfato], agitazione continua e shock osmotici) è condotto in linea con misure asettiche, non prevede la sterilizzazione. Pertanto, una delle sfide principali è garantire la sterilità prima dell'impianto in vivo . Sebbene esistano protocolli di sterilizzazione con radiazioni gamma stabiliti per i materiali inorganici, non esistono tali misure per i materiali organici. Inoltre, i protocolli in vigore per i materiali inorganici non possono essere applicati ai materiali organici, poiché la dose di radiazioni stabilita (25 kGy) distruggerebbe completamente l'impianto. Questo articolo studia l'effetto di una dose di radiazioni aumentata in una trachea di coniglio decellularizzata. Abbiamo mantenuto l'intervallo di dosaggio (kGy) e testato dosi aumentate fino a trovare la dose minima alla quale si ottiene la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose, ne abbiamo studiato gli effetti sull'organo, sia istologicamente che biomeccanicamente. Abbiamo determinato che mentre 0,5 kGy non hanno raggiunto la sterilità, dosi di 1 kGy e 2 kGy lo hanno fatto, con 1 kGy, quindi, essendo la dose minima necessaria per ottenere la sterilizzazione. Gli studi microscopici non hanno mostrato cambiamenti rilevanti rispetto agli organi non sterilizzati. Le caratteristiche biomeccaniche assiali non sono state affatto alterate ed è stata osservata solo una leggera riduzione della forza per unità di lunghezza che l'organo può tollerare radialmente. Possiamo quindi concludere che 1 kGy raggiunge la completa sterilizzazione della trachea di coniglio decellularizzata con effetti minimi, se non nulli, sull'organo.

Decellularizzazione La colorazione DAPI mostra l'assenza di DNA e nessun valore di DNA superiore a 50 ng è stato rilevato in nessuna delle trachee mediante elettroforesi, con tutti i frammenti più piccoli di 200 bp20.
Coltura microbica Due degli otto pezzi sottoposti a 0,5 kGy hanno mostrato un cambiamento di colore in meno di 1 settimana. Nessuno dei pezzi irradiati a 1 kGy e 2 kGy ha mostrato alcun cambiamento di colore (<strong...

Ottenere la sterilizzazione è essenziale per il trapianto di tessuto tracheale. Qui presentiamo un protocollo di sterilizzazione che utilizza l'irradiazione gamma a basso dosaggio che è completamente tollerato dagli organi.

Sterilizzazione con radiazioni gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati

One of the main key aspects in ensuring that a transplant evolves correctly is the sterility of the medium. Decellularized tracheal transplantation ...

Questo protocollo fornisce un processo di sterilizzazione completo per qualsiasi organo non sterile senza alterarne le caratteristiche. L'obiettivo principale di questa tecnica include la possibilità di sterilizzare un organo senza alterarne le proprietà. Sebbene questa tecnica si sia concentrata sulle trachee, ha dimostrato che dosi di radiazioni gamma più basse possono sterilizzare efficacemente i materiali biologici.Un individuo può affrontare il problema definendo la dose efficace più bassa per i diversi tipi di organi. Quindi, si consiglia di iniziare con un dosaggio più basso e aumentarli fino al raggiungimento della sterilizzazione. Inizia sezionando la trachea sezionata dai conigli bianchi della Nuova Zelanda eutanasia, o Oryctolagus cuniculus, in pezzi di due centimetri.Con le forbici, rimuovere il tessuto connettivo circostante e lo strato mucoso interno. Immergere i campioni in 12 millilitri di soluzione PBS contenente SDS, 5% penicillina streptomicina e 5% amfotericina. Sottoporre le trachee a costante agitazione con un agitatore magnetico a 400 RPM per cinque settimane a temperatura ambiente.Settimanalmente, dare due ore di shock osmotico immergendo le trachee in acqua distillata prima di cambiare il mezzo. Dopo cinque settimane, criogenizzare i campioni di trachea utilizzando una miscela da 12 millilitri di 80% FBS e 20% DMSO in un contenitore di congelamento a meno 80 gradi Celsius. Dopo 13-15 giorni, scongelare le trachee a bagnomaria a 37 gradi Celsius.Quindi, lavarli con PBS. Per irradiare il campione, posizionare quattro pezzi tracheali in 20 millilitri di PBS in flaconi di coltura di metacrilato T25, evitando la formazione di bolle. Condurre l'irradiazione utilizzando un acceleratore lineare con fotoni di un'energia nominale di 10 megavolt che appiattiscono fasci senza filtro.Applicare una dose di 2.400 unità di monitoraggio al minuto e impostare altri parametri come descritto nel manoscritto. Una volta fatto, coltivare il campione in 30 millilitri di DMEM integrato con FBS inattivato al 10% senza antibiotici o antimicotici. Incubare la coltura in un incubatore tissutale standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due settimane e ispezionarla ogni 24 ore per parametri di contaminazione come pH medio, colore e variazioni di torbidità.Condurre prove di trazione su una macchina di prova universale per desktop di trazione o controllo dello spostamento UTM, dotata di sensori di forza e posizione e di un computer con software appositamente progettato. Registra i dati ogni 0,4 secondi ed esportali in un foglio di calcolo. Costruire ganasce di trazione adattate al calibro medio delle trachee di coniglio da puro polivinilcloruro cristallino non tossico monostrato o tubi cavi in PVC.Sezione le condotte in segmenti lunghi tre centimetri. Per eseguire la sutura terminale-terminale senza pregiudizi, praticare 12 fori preformati a due millimetri dal bordo delle mascelle, separati da 2,5 millimetri. Successivamente, attaccare i tubi di vetro in PVC alla trachea del coniglio mediante anastomosi termino-terminale con una sutura continua di monofilamento di nylon 6-0 attraverso fori di cinque millimetri eseguiti alternativamente presenti a due millimetri di distanza dal bordo della trachea.Allunga tutti i pezzi a una velocità di spostamento di 5,0 millimetri al minuto. Quindi, registra le variabili, come lo stress e la deformazione massimi, l'energia immagazzinata per unità di volume della trachea e il modulo di Young. Eseguire test di compressione radiale su un UTM desktop di compressione dotato di una cella di carico da 15 newton per ottenere dati di forza, posizione e tempo.Registra i dati ed esporta in fogli di calcolo a intervalli di 0,5 secondi. Posizionare le trachee con l'area membranosa appoggiata sulla piastra inferiore prima del graduale aumento della piastra verso la piastra superiore ad una velocità costante di cinque millimetri al minuto. Calcola ogni variabile per unità di lunghezza del campione, rigidità e l'energia per unità di superficie necessaria per occludere completamente la trachea.Posizionare uno stent sterile in PVC intraluminale di dimensione 14, garantendo un margine da tre a quattro millimetri a ciascuna estremità. Fissare lo stent con un singolo punto monofilamento di nylon 6-0 attraverso lo spazio intercartilagineo della prima cartilagine. In condizioni asettiche e con materiale sterile, effettuare un'incisione toracica centrale longitudinale di tre centimetri e raccogliere lembi peduncolari bilaterali composti da fascia pettorale e una componente muscolare.Avvolgere le trachee con il lembo in quattro conigli, una trachea su ciascun hemathorax. Una volta completato l'intervento chirurgico, invertire l'anestesia interrompendo la somministrazione di isoflurano. Degli otto pezzi che sono stati esposti a 0,5 kilogray di radiazioni, due pezzi hanno mostrato un cambiamento nel colore dei media entro una settimana.Tuttavia, nessuno dei pezzi che sono stati irradiati a uno o due kilogray ha mostrato alcun cambiamento nel colore dei supporti. Rispetto al controllo, non sono stati rilevati cambiamenti nel modello di distribuzione del collagene o delle fibre elastiche nei campioni analizzati irradiati a diverse dosi di radiazioni. I dati ottenuti nella prova di trazione sulle trachee irradiate sono riportati qui.Le curve di deformazione da sforzo per le trachee decellularizzate e irradiate non hanno rivelato cambiamenti rispetto alle trachee non sterilizzate. Vengono mostrati i test di compressione eseguiti sulle trachee native o sui controlli e le trachee decellularizzate, crioconservate e irradiate. I grafici corrispondenti hanno mostrato che l'irradiazione non ha modificato la percentuale di occlusione rispetto alla trachea nativa.L'irradiazione gamma ha causato una diminuzione clinicamente minima ma statisticamente significativa delle caratteristiche radio-biomeccaniche e della forza variabile per unità di lunghezza. L'esame istologico ha mostrato il tessuto connettivo altamente organizzato nella forma del pericondrio della trachea nativa. La cartilagine era intatta e non mostrava segni di necrosi.Quando si impianta un elemento radiologico in un essere vivente, la sterilità dell'impianto e il processo sterile sono fondamentali per evitare infezioni e rigetti tissutali. C'è una vasta gamma di organi da impiantare dopo la generazione di tessuti e dovrebbero essere sterili. Seguendo questo processo è possibile ottenere una sterilizzazione completa senza influire sulle caratteristiche principali dell'organo.

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