Name: Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Scopri l'ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo. Questa tecnica consente studi di meiosi oocitaria con alta precisione spaziale e minima fototossicità.

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Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Balboula per il loro prezioso aiuto e discussioni. Gli autori ringraziano Melina Schuh per aver gentilmente condiviso il costrutto mCherry-Cep192. Questo studio è stato supportato da R35GM142537 (NIGMS, NIH) a AZB.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Università del Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Nel presente studio sono stati utilizzati topi femmina reporter Cep192-eGFP di età compresa tra 6 e 8 settimane. Per generare topi reporter Cep192-eGFP , è stata utilizzata la riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR / Cas9 per integrare il gene reporter EGFP nel genoma del topo CF-1. Il reporter EGFP è stato fuso al C-terminus di Cep192 (una componente integrante degli MTOC)15. Per mantenere la colonia di topi, sono stati utilizzati topi reporter omozigoti Cep192-eGfp . Tutti gli animali sono stati tenuti in gabbie (fino a quattro animali / gabbia) a 21 ° C e 55% di umidità, con un ciclo luce / buio di 12 ore e accesso ad libitum a cibo e acqua.
1. Raccolta di ovociti di topo
<ol><li>Preparare il terreno di coltura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, vedere la tabella dei materiali) e incubarlo a 37 °C e al 5% di CO2 durante la notte. NOTA: Il mezzo CZB può essere conservato a 4 °C per 1 mese (vedere il file supplementare 1 per la composizione del supporto).</li>
	<li>Integrare il terreno CZB con glutammina (1 mM) e milrinone (2,5 mM) (CZB + M) (vedi Tabella dei materiali) e metterlo nell'incubatore. NOTA: Il milrinone è un inibitore della fosfodiesterasi che mantiene gli ovociti arrestati alla profase I e impedisce la ripresa meiotica20.</li>
	<li>Preparare il mezzo di raccolta (terreno essenziale minimo privo di bicarbonato, MEM) contenente 3 mg/ml di polivinilpirolidone (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (File supplementare 1) e milrinone (2,5 mM) (MEM/PVP + M, vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare i piatti di raccolta e coltura, preparare quattro microgocce (100 μL) di terreno di raccolta (MEM / PVP + M) e due microgocce (100 μL) di terreno di coltura (CZB + M) in piastre di Petri da 60 mm e 35 mm, rispettivamente, e coprirle con olio minerale (vedi Tabella dei materiali). Tenere il piatto di raccolta sul vetrino più caldo e mettere il piatto di coltura nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Iniettare per via intraperitoneale 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG, vedere la tabella dei materiali) in topi femmina sessualmente maturi (6-8 settimane) Cep192-eGFP 44-48 ore prima della raccolta degli ovociti.</li>
	<li>Sacrificare i topi mediante lussazione cervicale, identificare e rimuovere le ovaie21 e trasferirle in un vetro da orologio contenente terreno di raccolta preriscaldato (MEM / PVP + M) a 37 ° C.</li>
	<li>Fissare l'ovaia toccando una siringa da 1 mL sul fondo del vetro dell'orologio e perforandola più volte (~ 40 volte per ovaio) usando aghi da cucito raggruppati insieme per rilasciare gli ovociti nel mezzo.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di trasferimento in plastica, trasferire tutto il mezzo contenente i complessi cumulo-ovocita (COC) dal punto 1.7 in una capsula di Petri di plastica vuota da 100 mm.</li>
	<li>Sotto uno stereomicroscopio, raccogliere i COC utilizzando un pipet di vetro Pasteur e trasferirli nel piatto di raccolta che contiene MEM / PVP + M.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di vetro Pasteur stretto (circa 100 μm di diametro), denudare meccanicamente gli ovociti mediante un delicato pipettaggio ripetitivo, seguito dal trasferimento e dal lavaggio in quattro microgocce di (100 μL) MEM/PVP + M (il piatto di raccolta) prima del loro trasferimento nel piatto di coltura CZB + M.</li>
	<li>Incubare gli ovociti denudati per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2 nell'aria.</li>
</ol>2. Microiniezione di ovociti
<ol><li>Introdurre una goccia da 250 μL di MEM/PVP + M in un coperchio in plastica di Petri da 100 mm e coprirlo con olio minerale. NOTA: Il coperchio della piastra di Petri ha un bordo inferiore che offre più spazio per la regolazione del micromanipolatore.</li>
	<li>Accendere il sistema di microiniezione (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare il piatto di microiniezione sullo stadio di riscaldamento (37 °C) del microscopio.</li>
	<li>Caricare l'ago per iniezione con 0,5 μL di cRNA mCh-Cep192utilizzando le punte delle pipette del microcaricatore (vedere Tabella dei materiali) e fissare l'ago per iniezione al micromanipolatore.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti denudati (fase 1.11) nella microgoccia da 250 μL (fase 2.1).</li>
	<li>Sotto una lente obiettivo 20x o 40x, regolare la posizione e la messa a fuoco degli aghi per iniezione e di tenuta in base alla posizione dell'ovocita (Figura 1).</li>
	<li>Impostare l'unità di microiniezione e impostare la pressione di iniezione (p i), la pressione di compensazione (pc) e il tempo di iniezione (ti) per essere in grado di iniettare 5-10 pl di cRNA mCh-Cep192 (per marcare esogenamente gli MTOC).</li>
	<li>Iniettare con cura gli ovociti senza toccare il nucleo.</li>
	<li>Una volta iniettati tutti gli ovociti, lavarli in tre microgocce di CZB + M, trasferirli nel piatto di coltura (CZB + M) e incubarli per 3 ore a 37 °C per consentire l'espressione di mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maturazione degli ovociti
<ol><li>Preparare il mezzo di maturazione aggiungendo glutammina (1 mM) al mezzo CZB pre-equilibrato in un incubatore con il 5% di CO2 in aria a 37 °C per almeno 3 ore.</li>
	<li>Fare due microgocce (100 μL) del mezzo di maturazione in una capsula di Petri da 35 mm e coprirle con olio minerale (piatto di maturazione).</li>
	<li>Lavare gli ovociti arrestati in profase I almeno tre volte in microgocce CZB prive di milrinone da 100 μL per rimuovere completamente il milrinone e consentire la ripresa meiotica.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti nel piatto di maturazione e incubarli per 5 ore (stadio di prometafase I) in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 in aria a 37 °C.</li>
</ol>4. Preparazione degli ovociti per l'ablazione e l'imaging
<ol><li>Trasferire gli ovociti di prometafase I (fase 3.4) in una capsula di coltura a fondo di vetro contenente 100 μL di terreno di maturazione (fase 3.1) ricoperta di olio minerale.</li>
</ol>5. Preparazione al microscopio per l'ablazione
<ol><li>Almeno 30 minuti prima dell'ablazione, accendere il regolatore di temperatura per l'incubatore dello stadio (vedere Tabella dei materiali) e impostarlo a 37 °C.</li>
	<li>Accendere il controller CO 2 e impostarlo su 5% CO2.</li>
	<li>Selezionare un obiettivo apocromatico ad immersione in olio 40x e applicare una piccola goccia dell'olio ad immersione.</li>
	<li>Montare il piatto di coltura con fondo di vetro con gli ovociti su un'incubatrice da palcoscenico e coprire l'incubatrice con un coperchio a gas.</li>
	<li>Nel software di acquisizione delle immagini (vedere la tabella dei materiali), selezionare un'opzione che consente il salvataggio di più posizioni di fase (ad esempio, "Definisci segna e trova esperimento"). Utilizzando l'illuminazione a luce luminosa trasmessa, centrare i singoli ovociti e salvare le loro posizioni.</li>
	<li>Nel software di acquisizione immagini, selezionare la modalità di scansione XYZ , impostare il formato dell'immagine su 256 x 256 pixel, impostare il fattore di zoom su 2,5x - 3,0x e selezionare una frequenza di scansione di 600 Hz. Ciò corrisponde a un tempo di permanenza dei pixel di circa 1,6 μs.</li>
	<li>Impostare una linea laser di eccitazione a 488 nm a circa il 10% della potenza del laser (che corrisponde a 4,0 μW a livello del campione) (vedere Tabella dei materiali) e utilizzare una larghezza di banda spettrale di 500-550 nm per osservare il segnale GFP dagli MTOC. Per l'osservazione simultanea della fluorescenza dal Cep192 marcato con mCherry, impostare una linea laser di eccitazione a 585 nm a circa l'8% della potenza del laser (che corrisponde a 10,7 μW a livello del campione) e utilizzare un altro rivelatore impostato su una larghezza di banda spettrale di 595-645 nm. NOTA: È utile utilizzare il rilevatore di luce trasmessa (TLD) del microscopio confocale per rilevare contemporaneamente i confini degli ovociti.</li>
	<li>Utilizzando una modalità di scansione dal vivo e il controllo manuale dello z-drive, eseguire lo screening dell'ovocita per gli MTOC.</li>
	<li>Una volta rilevato un mcMTOC, disegna una regione quadrata di interesse (ROI) attorno ad esso.</li>
</ol>6. Ablazione di mcMTOCs
<ol><li>Impostare un laser a femtosecondi su una lunghezza d'onda di 740 nm. NOTA: La lunghezza d'onda del laser può essere modificata in base al microscopio e alle condizioni del laser.</li>
	<li>Utilizzare il modulatore elettro-ottico del microscopio multi-fotone (vedi Tabella dei materiali) per impostare la potenza del laser al 70% -80%, corrispondente alla potenza di 60-70 mW sul piano del campione. NOTA: Se il laser è dotato di un compensatore di impulsi a femtosecondi, utilizzarlo per correggere la dispersione del ritardo di gruppo (GDD). La correzione GDD riduce la quantità di potenza laser necessaria per un'ablazione efficiente di mcMTOC e minimizza il fotodanneggiamento dell'ovocita. Il controllo GDD è solitamente integrato con il software di acquisizione immagini dei microscopi multifotoni commerciali.</li>
	<li>Utilizzare lo stesso formato immagine, fattore di zoom e frequenza di scansione del passaggio 5.6. Impostate i parametri di media di linee e fotogrammi su 1.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Scan nel software per eseguire l'ablazione del mcMTOC eseguendo una singola scansione laser del ROI selezionato.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per rivedere i risultati dell'ablazione confrontando le immagini delle strutture marcate con GFP prese prima e dopo l'esposizione laser multi-fotone. Se l'ablazione ha successo, l'intensità della fluorescenza GFP nel mcMTOC mirato diminuisce ai livelli osservati sullo sfondo.</li>
	<li>Se rimangono alcuni frammenti di una struttura di etichettatura GFP, ripetere il passaggio 6.4 una o più volte concentrandosi su vari piani z del mcMTOC.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per verificare l'efficienza di ablazione mediante la perdita completa dei segnali mCherry associati a mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Ripetere il passaggio da 5.8 al punto 6.7 fino a quando tutti gli MTOC di un ovocita (su vari piani focali) sono ablati. NOTA: Questo protocollo utilizza la microiniezione mCh-Cep192 come strategia per confermare la deplezione di mcMTOC dopo esposizione laser multi-fotone ed escludere la possibilità che la perdita di fluorescenza GFP sia causata dal fotosbiancamento GFP. Tuttavia, la microiniezione di questa sonda è facoltativa e non richiesta per la procedura di ablazione.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Esistono diversi metodi per disturbare le strutture correlate al citoscheletro all'interno delle cellule22,23,24,25. Tuttavia, trovare tecniche efficienti per perturbare selettivamente la struttura mirata senza compromettere la vitalità cellulare è difficile. Il metodo di ablazione laser multi-fotone qui presentato è una strategia efficiente per indurre una perturbazione meccanica selettiva ai mcMTOC all'interno dell'ovocita senza alterare la vitalità dell'ovocita.
L'ablazione laser è stata ampiamente utilizzata per comprendere i meccanismi molecolari che controllano la segregazione cromosomica durante la mitosi e la meiosi22,23,26,27. A causa delle dimensioni relativamente grandi (>80 mm di diametro) degli ovociti di mammifero rispetto alle cellule somatiche28, l'ablazione delle loro strutture intracellulari rappresenta una sfida. Inoltre, il volume medio di mcMTOC negli ovociti in metafase I è ~ 20 μm15, rappresentando un'ulteriore sfida. Un metodo efficiente che offra una penetrazione più profonda dei tessuti deve essere adottato per superare queste sfide. Il vantaggio principale dell'utilizzo del laser multi-fotone per l'ablazione è la sua capacità di raggiungere più in profondità la cellula riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio29.
Per verificare l'efficacia e l'efficienza del metodo di ablazione laser per esaurire la struttura mirata, si raccomanda di utilizzare una proteina marcata con fluorescenza per identificare la struttura bersaglio nel tempo (prima e dopo l'ablazione)23. È importante notare che l'ablazione laser esaurisce l'intero mcMTOC come struttura e, sebbene gli mcMTOC più piccoli richiedano solo una singola esposizione laser per essere esauriti, gli mcMTOC più grandi possono richiedere più di un'esposizione laser a diversi piani focali. Si raccomanda inoltre di fissare e immunomarcare un sottogruppo di ovociti di controllo e mcMTOC-ablati con un marcatore MTOC (come γ-tubulina, pericentrina o Cep192) per confermare ulteriormente l'efficienza dell'ablazione mcMTOC. Negli ovociti di controllo, le aree del citoplasma adiacenti ma non sovrapposte agli mcMTOC saranno esposte al laser.
Questo esperimento richiede diverse ablazioni mcMTOC mentre si sposta tra diversi piani focali all'interno degli ovociti. Pertanto, si consiglia vivamente di praticare questa tecnica più volte prima di eseguire l'esperimento per ridurre al minimo il tempo dell'esperimento, aumentando così la vitalità degli ovociti. Inoltre, è importante utilizzare la potenza laser minima sufficiente per esaurire gli mcMTOC senza compromettere la vitalità degli ovociti.
Questa tecnica ha alcune limitazioni. In primo luogo, i microscopi confocali multi-fotone sono relativamente più costosi dei normali microscopi confocali. In secondo luogo, perturbare tutti gli mcMTOC su diversi piani focali richiede più tempo rispetto alle perturbazioni chimiche o genetiche. In terzo luogo, questo protocollo richiede competenze tecniche per ablare tutti gli mcMTOC nel più breve tempo possibile. Tuttavia, una volta padroneggiato, l'uso del laser multi-fotone fornisce un'eccellente strategia per perturbare diverse strutture intracellulari negli ovociti di topo, compresi gli mcMTOC, contribuendo alla comprensione dei meccanismi molecolari che regolano il posizionamento del fuso e la sua tempestiva migrazione negli ovociti di mammifero.

I gameti aploidi (spermatozoi e ovociti) sono prodotti attraverso la meiosi, che comporta un ciclo di replicazione del DNA seguito da due divisioni consecutive necessarie per la riduzione del numero cromosomico prima della fecondazione. Nei mammiferi, durante la prima vita fetale, l'ovocita subisce un lungo arresto (fino alla pubertà) allo stadio diplotene della profase I della prima divisione meiotica, uno stadio chiamato stadio della vescicola germinale (GV). Dopo la ripresa meiotica, l'ovocita GV subisce la rottura dell'involucro nucleare (NEBD) e il fuso viene assemblato principalmente al centro dell'ovocita 1,2,3. Successivamente, guidato da F-actina, il fuso migra in modo tempestivo dal centro dell'ovocita alla corteccia per garantire una divisione altamente asimmetrica, risultando in un uovo con un piccolo corpo polare (PB)4,5,6.
Nelle cellule mitotiche, i centrosomi sono costituiti da una coppia di centrioli circondati da componenti materiali pericentriolari (PMC), come pericentrina, γ-tubulina, Cep152 e Cep1927. Questi centrosomi contenenti centrioli contribuiscono alla fedeltà della formazione del fuso bipolare8. Tuttavia, i centrioli vengono persi durante l'oogenesi precoce in varie specie, compresi i roditori9. Pertanto, gli ovociti di topo adottano una via di assemblaggio del fuso indipendente dal centriolo utilizzando numerosi centri di organizzazione dei microtubuli acentriolari (MTOC)9,10. Alla ripresa meiotica, gli MTOC perinucleari subiscono tre fasi distinte di ricondensazione, allungamento e frammentazione in un gran numero di MTOC più piccoli11,12. Gli MTOC frammentati vengono quindi raggruppati e ordinati per organizzare un fuso bipolare10,13,14. Un altro pool di MTOC si trova nel citoplasma durante NEBD. Alcuni di questi MTOC citoplasmatici migrano e formano poli del fuso (MTOC polari, pMTOC)10,11. Recentemente, è stato scoperto un altro sottogruppo di MTOC citoplasmatici, chiamati MTOC citoplasmatici metafase (mcMTOC), che non contribuiscono alla formazione del polo del fuso ma rimangono nel citoplasma ovocitario durante la metafase I (Met I)15. L'esaurimento degli mcMTOC mediante ablazione laser multi-fotone o l'aumento anomalo del loro numero mediante inibizione dell'autofagia perturba il posizionamento e la migrazione del fuso e aumenta l'incidenza di aneuploidia negli ovociti in metafase II15.
È interessante notare che i mcMTOC differiscono dai pMTOC in molti aspetti15. Ad esempio, a differenza dei pMTOC, che provengono principalmente dagli MTOC perinucleari, i mMTOC provengono dalla corteccia ovocitaria. Quando il fuso è ancora al centro dell'ovocita, gli mcMTOC sono localizzati in modo asimmetrico opposto al lato verso il quale il mandrino migra per l'estrusione PB15. Le MT astrali non possono raggiungere la corteccia nella cellula ovocitaria relativamente grande. Pertanto, questi mcMTOC nucleano MT per ancorare il fuso (tramite MTOC astrali) alla corteccia. Questi risultati suggeriscono un modello in cui la forza MT nucleata da mcMTOC contrasta la forza mediata da F-actina che guida la migrazione del fuso verso la corteccia. L'equilibrio tra queste due forze opposte è essenziale per regolare il posizionamento centrale del mandrino e la migrazione tempestiva del mandrino15.
Ad oggi, tutte le proteine PMC esaminate (pericentrina, g-tubulina, Cep192 e Aurora chinasi A) si localizzano in entrambi i pool MTOC: mcMTOCs e pMTOCs15. Pertanto, non esiste un approccio chimico o genetico per perturbare selettivamente gli mcMTOC senza perturbare i pMTOC. Queste limitazioni possono essere aggirate prendendo di mira selettivamente gli mcMTOC con ablazione laser. Tra le tecnologie basate su laser sviluppate per la microablazione, i laser a femtosecondi multifotoni pulsati mostrano un grande potenziale grazie al loro impatto di precisione limitato al piano focale, all'elevata profondità di penetrazione della luce nel vicino infrarosso e alla ridotta fototossicità e danno termico alla cella16,17,18. Questo lavoro descrive un approccio selettivo per ablare i mcMTOC negli ovociti di topo utilizzando un laser multi-fotone accoppiato a un microscopio invertito.

<table><tbody><tr>Strumento di precisione mondiale a <td>parete sottile GL 1.0 OD/.75 ID da 4 pollici</td><td>&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Aghi per iniezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td>Capillarità in vetro borosilicato <td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Strumento di precisione mondiale&nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Aghi di tenuta&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a gabbia per microscopio Leica DMI6000 B</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcio cloruro diidrato</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td>Controllore CO2 <td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Coperchio HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Acido lattico&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Gatto # L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscopio&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>Gatto # E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microiniettore&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>E5242956003</tr><tr><td>Gentamicina</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Gatto# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro&nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Gatto # P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Gatto # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sale di sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Incubatore CO2&nbsp;</td></tr><tr><td>Micorscopio confocale a scansione laser spettrale Leica TCP SP8 con supporto invertito DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio diidrato</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Zaffiro laser a femtosecondi</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Aquila media minima essenziale (MEM)</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A Piastra</td><td></td></tr><tr><td>di Petri (100 mm)</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td>Piastra di Petri <td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>(35 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Piastra di Petri Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirolidone</td><td>MilliporoSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Gatto # P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cammenta incinta&acuto; s gonadotropina sierica&nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Gatto# 493-10-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido piruvico&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Acido piruvico&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da cucito&nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&deg; 5 * 16 aghi&nbsp;</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Inserto riscaldante per palco P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscopio&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringa 1 mL</td><td>BD company&nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura Tempcontrol 37-2 digital</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>Il regolatore di temperatura Cube per l'incubatore a gabbia</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

La fedeltà della meiosi ovocitaria è fondamentale per generare uova euploidi competenti dal punto di vista dello sviluppo. Nei mammiferi, l'ovocita subisce un lungo arresto alla profase I della prima divisione meiotica. Dopo la pubertà e alla ripresa meiotica, la membrana nucleare si smonta (rottura dell'involucro nucleare) e il fuso viene assemblato principalmente al centro dell'ovocita. Il posizionamento iniziale del mandrino centrale è essenziale per proteggersi da attacchi anomali cinetococo-microtubuli (MT) e aneuploidia. Il fuso posizionato centralmente migra in modo sensibile al tempo verso la corteccia, e questo è un processo necessario per estrudere un piccolo corpo polare. Nelle cellule mitotiche, il posizionamento del fuso si basa sull'interazione tra MT astrali mediate dal centrosoma e la corteccia cellulare. Al contrario, gli ovociti di topo mancano dei centrosomi classici e, invece, contengono numerosi centri di organizzazione MT acentriolare (MTOC). Nella fase di metafase I, gli ovociti di topo hanno due diversi set di MTOC: (1) MTOC raggruppati e ordinati per assemblare i poli del fuso (MTOC polari) e (2) MTOC citoplasmatici in metafase (mcMTOC) che rimangono nel citoplasma e non contribuiscono direttamente alla formazione del fuso ma svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del posizionamento del fuso e nella migrazione tempestiva del fuso. Qui, viene descritto un metodo di ablazione laser multi-fotone per esaurire selettivamente gli mcMTOC marcati endogenamente negli ovociti raccolti da topi reporter Cep192-eGfp . Questo metodo contribuisce alla comprensione dei meccanismi molecolari alla base del posizionamento e della migrazione del fuso negli ovociti di mammifero.

L'ablazione laser multi-fotone fornisce un metodo efficiente per ablare selettivamente le strutture intracellulari. L'attuale studio ha utilizzato l'ablazione laser multi-fotone per esaurire selettivamente gli mcMTOC negli ovociti di topo. L'ablazione laser ha depauperato gli mcMTOC in modo efficiente, come dimostrato dalla riduzione della fluorescenza endogena GFP negli mcMTOC mirati a un livello paragonabile allo sfondo. Anche l'mCh-Cep192 esogeno negli mcMTOC mirati è stato abolito in seguito all'ablazione laser. L'ablazione laser degli mcMTOC deve essere eseguita su diversi piani focali all'interno dell'ovocita (dove si trovano gli mcMTOC, Figura 2) per garantire che tutti gli mcMTOC all'interno dell'ovocita siano esauriti (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figura 1: Microiniezione di ovociti. Microiniezione di un ovocita di topo arrestato con profase I con cRNA mCh-Cep192 . Barra scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figura 2: Deplezione di mcMTOCs negli ovociti di topo. Immagini rappresentative di singoli piani focali. I quadrati bianchi indicano un mcMTOC prima e dopo l'ablazione laser multi-fotone. Barra di scala: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figura 3: Deplezione di mcMTOC su diversi piani focali in un ovocita di topo. Immagini rappresentative di massima proiezione di un ovocita di topo ablato da mcMTOC. Barra scala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File supplementare 1: Composizioni di Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) e mezzo essenziale minimo privo di bicarbonato (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Questo protocollo offre un'eccellente strategia per l'ablazione selettiva di MTOC citoplasmatici, che sono regolatori critici per il posizionamento del fuso negli ovociti di topo. Contribuendo così alla nostra comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la meiosi degli ovociti. Questa tecnica consente di eseguire ablazioni mirate all'interno di ovociti vivi con un'elevata precisione spaziale e con effetti fototossici minimi sulla cellula. Questo protocollo può essere utilizzato per indurre una perturbazione meccanica selettiva di diversi istruttori senza alterare la vitalità cellulare. Questo protocollo richiede le competenze tecniche per ablare tutti gli MTOC citoplasmatici nel più breve tempo possibile per evitare di compromettere la vitalità degli ovociti. Quindi praticare questa tecnica più volte prima di eseguire l'esperimento vero e proprio è essenziale. Per iniziare, integrare il terreno CZB con glutammina e milrinone e metterlo nell'incubatrice. Prepara i piatti di raccolta e cultura. Prelevare quattro micro gocce di terreno di raccolta e due micro gocce di terreno di coltura rispettivamente in piastre di Petri da 60 e 35 mm. E copriteli con olio minerale. Tenere il piatto di raccolta sullo scaldavetrini e incubare a 37

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Scopri l'ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo. Questa tecnica consente studi di meiosi oocitaria con alta precisione spaziale e minima fototossicità.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

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