Name: Stabilire organoidi endometriali 3D dallutero del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Impara a isolare epitelio uterino puro da utero di topo per coltivare organoidi endometriali 3D. Questo metodo combina dissociazione enzimatica e meccanica per studiare il rinnovamento endometriale e malattie correlate.

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Ringraziamo la Dott.ssa Stephanie Pangas e il Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) per la lettura critica e la redazione del nostro manoscritto. Gli studi sono stati sostenuti da Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development grants R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e da NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. ha ricevuto un Next Gen Pregnancy Award dal Burroughs Wellcome Fund.

La manipolazione dei topi e gli studi sperimentali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine e linee guida stabilite dalla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Isolamento dell'epitelio uterino dai topi con metodi enzimatici e meccanici
NOTA: Questa sezione descrive i passaggi necessari per stabilire, passare, congelare e scongelare organoidi endometriali epiteliali da topi utilizzando un'impalcatura a matrice di gel. Studi precedenti hanno determinato che colture ottimali di organoidi endometriali di topo sono stabilite dai topi durantela fase 4 dell'estro, che può essere determinata dall'esame citologico di un tampone vaginale15. Topi WT femmina adulti (6-8 settimane, ibridi C57BL/6J e 129S5/SvEvBrd) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti. I topi sono stati sottoposti a eutanasia umana secondo le linee guida approvate dalla IACUC utilizzando sedazione isoflurana seguita da disarticolazione cervicale. Una volta che i topi vengono eutanasiati, è necessario seguire i seguenti passaggi. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi ai materiali e alle soluzioni utilizzate in questo protocollo.
<ol><li>Lasciare scongelare la matrice di gel sul ghiaccio per circa 1-2 ore prima dell'uso.</li>
	<li>Per sezionare il mouse, utilizzare le forbici per fare un'incisione mediana sull'addome e staccare delicatamente la pelle per esporre lo strato peritoneale sottostante. Utilizzare una pinza per sostenere lo strato peritoneale e fare incisioni laterali con le forbici per esporre il contenuto addominale.<ol><li>Individuare le corna uterine spostando delicatamente i cuscinetti di grasso addominale da parte. Sezionali tenendoli prima alla giunzione cervicale e usando le forbici per tagliare lungo il grasso mesenterico. Dopo la dissezione dell'utero del topo, rimuovere accuratamente il tessuto adiposo dal corno uterino con piccole forbici. NOTA: Mantenere la sterilità durante l'isolamento cellulare sterilizzando tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso, spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70% ed eseguire tutte le fasi successive alla dissezione sotto un cappuccio di coltura di tessuto sterile.</li>
	</ol></li>
	<li>Tagliare ogni corno uterino in piccoli frammenti, ciascuno dei quali misura circa 4-5 mm.</li>
	<li>Mettere tutti i frammenti uterini da un utero in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 0,5 ml di tripsina all'1%. Consentire alla soluzione enzimatica di entrare nel lume uterino, causando la separazione enzimatica dell'epitelio endometriale dallo stroma sottostante.</li>
	<li>Incubare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore di coltura tissutale umidificata a 37 °C per circa 1 ora.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di 1 ora, trasferire i frammenti uterini in una piastra di coltura tissutale di 35 mm contenente 1 mL di soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS).</li>
	<li>Sotto un microscopio a dissezione, utilizzare una pinza fine e una pipetta da 1 mL per separare meccanicamente l'epitelio uterino dal tubo uterino. Mentre si tiene premuto un'estremità di un frammento uterino con la pinza, far scorrere delicatamente la punta della pipetta longitudinalmente attraverso il frammento, schiacciando l'epitelio dall'altra estremità del tubo uterino. Osservare i fogli epiteliali separati dal frammento uterino al microscopio di dissezione.</li>
	<li>Utilizzare la pipetta da 1 mL per raccogliere e trasferire delicatamente i fogli epiteliali in un tubo da 1,5 ml.</li>
	<li>Ripetere il processo per i frammenti uterini rimanenti, trasferendo tutti i fogli epiteliali nello stesso tubo di raccolta.</li>
	<li>Pellet i fogli epiteliali dissociati mediante centrifugazione per 5 min a 375 × g.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il surnatante per evitare di disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di 2,5 mg/mL di collagenasi + 2 mg/mL di soluzione di DNasi. Pipettare su e giù circa 10 volte o fino a ottenere una sospensione a cella singola.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 ml di DMEM/F12 + 10% siero fetale bovino (FBS) + antibiotici e centrifugare le cellule per 5 minuti a 375 × g. NOTA: Per ulteriori informazioni sull'antibiotico ad ampio spettro utilizzato per la coltura cellulare, fare riferimento alla Tabella dei materiali.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotici. Centrifugare le celle per 5 minuti a 375 × g.</li>
</ol>2. Lavorazione del compartimento stromale
NOTA: Questa sezione delinea i protocolli necessari per isolare il compartimento stromale dell'endometrio del topo. Dato il crescente interesse per gli esperimenti di co-coltura epiteliale/stromale, è importante essere in grado di elaborare le popolazioni di cellule stromali oltre alle cellule epiteliali che genereranno organoidi.
<ol><li>Una volta che tutto l'epitelio è stato separato enzimaticamente e meccanicamente dai frammenti uterini, le restanti strutture tubolarie sono i compartimenti "stromale/miometriale". Raccogliere questo tessuto in una 2,5 mg/mL collagenasi + 2 mg/mL DNasi in soluzione HBSS.</li>
	<li>Incubare il campione stromale/miometriale su uno shaker a 37 °C per 15 minuti.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 500 μL di DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotici per topo e filtrare i frammenti non dissociati attraverso un filtro cellulare da 40 μm.</li>
	<li>Pellettare le celle mediante centrifugazione per 5 minuti a 375 × g.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotici. Aggiungere la miscela goccia a goccia a 10 ml di DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotici in una piastra di coltura cellulare di 10 cm. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore di coltura cellulare umidificata.</li>
	<li>Per generare co-colture di cellule epiteliali e stromali endometriali di topo, seguire i metodi descritti per organoidi endometriali umani utilizzando sistemi privi di scaffold o matrice di collagene 6,8. NOTA: Mentre queste tecniche non sono ancora state pubblicate per i topi, possono essere adattate in base ai protocolli pubblicati con endometrio umano.</li>
</ol>3. Incapsulamento dell'epitelio uterino nella matrice di gel per stabilire organoidi
NOTA: Tenere la matrice di gel sul ghiaccio fino a quando non è pronta per essere utilizzata.
<ol><li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un volume di matrice di gel che è 20 volte quello del pellet cellulare (cioè, se il pellet cellulare è 20 μL, risospendere le cellule con 400 μL di matrice gel). Risospendere il pellet con attenzione per evitare di introdurre bolle.</li>
	<li>Lasciare riposare la matrice di gel/sospensione cellulare a temperatura ambiente per ~10 minuti.</li>
	<li>Una volta che la matrice di gel/sospensione cellulare diventa un gel semisolido, utilizzare una micropipetta P200 con una punta larga da 200 μL per aspirare delicatamente 25 μL della matrice di gel/sospensione cellulare. Erogare tre cupole separate da 25 μL per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e lasciare polimerizzare la matrice di gel per 15 minuti in un incubatore per colture tissutali umidificate a 37 °C.</li>
	<li>Dopo che la matrice di gel si è indurita, aggiungere 750 μL di mezzo organoide a ciascun pozzetto contenente cupole di matrice di gel. Incubare a 37 °C in un incubatore per colture tissutali umidificate. NOTA: La formulazione dei terreni organoidi è indicata nella tabella dei materiali. Gli organoidi si formano tipicamente entro 4 giorni dalla coltura iniziale.</li>
</ol>4. Analisi dell'espressione genica di organoidi endometriali dopo trattamento con estradiolo
NOTA: Questa sezione descrive i metodi utilizzati per profilare l'espressione genica degli organoidi epiteliali endometriali utilizzando qPCR in tempo reale dopo il trattamento con estradiolo (E2; vedere Tabella 1). Poiché l'endometrio è sotto il controllo ciclico dell'ormone ovarico E2, testare la risposta degli organoidi a E2 è una misura importante della funzione fisiologica. Abbiamo ottenuto RNA di alta qualità e generato mRNA sufficiente per profilare l'espressione genica utilizzando qPCR e / o sequenziamento dell'RNA dai nostri organoidi epiteliali endometriali. Questa sezione descrive come raccogliere organoidi e processarli per l'analisi a valle dell'espressione genica. Il mezzo di trattamento selezionato riflette quello usato per trattare le cellule endometriali in coltura. Tuttavia, va notato che questo mezzo di trattamento può essere ottimizzato di conseguenza, come fatto per il trattamento di colture 3D endometriali umane con ormoni 8,16,17.
<ol><li>Coltura gli organoidi endometriali come descritto sopra.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo organoide e sostituirlo con 750 μL di terreno di fame quattro giorni dopo la semina. Incubare durante la notte.</li>
	<li>La mattina seguente, rimuovi il mezzo di fame. Aggiungere 750 μL di mezzo di trattamento contenente veicolo o 10 nM E2. Incubare per 48 h.</li>
	<li>Procedere con l'isolamento dell'RNA seguendo il protocollo del produttore del kit.</li>
</ol>5. Analisi istologica degli organoidi endometriali
NOTA: L'imaging delle caratteristiche morfologiche degli organoidi endometriali è fondamentale per valutare l'effetto cellulare di fattori di crescita, manipolazioni genetiche o inibitori di piccole molecole. Questa sezione descrive le tecniche utilizzate per fissare, elaborare e visualizzare organoidi epiteliali endometriali utilizzando colorazioni istologiche e colorazione immunofluorescente anticorpale.
<ol><li>Preparare provette da microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 1 mL di paraformaldeide al 4% in 1x PBS. Mettili sul ghiaccio.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dai pozzetti della piastra a 12 pozzetti contenente gli organoidi.</li>
	<li>Utilizzando una punta di pipetta da 1 mL con punta tagliata, trasferire 500 μL di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto e staccare delicatamente le cupole della matrice di gel dal fondo della piastra.</li>
	<li>Aspirare delicatamente l'intera cupola della matrice di gel nella punta della pipetta e trasferirla nella provetta della microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Fissare gli organoidi posizionandoli su un rotatore a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>La mattina seguente, centrifugare il tubo a 600 × g per 5 minuti per pellettare gli organoidi. Rimuovere delicatamente la soluzione di paraformaldeide al 4% con una pipetta ed eliminare. Lavare gli organoidi 2x con etanolo al 70%.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutti tranne 50-100 μL di etanolo dal tubo. Mettere da parte il tubo.</li>
	<li>Mettere un tubo di gel per la lavorazione del campione a bagnomaria e nel microonde per ~ 30 s per sciogliere il gel. Assicurarsi che il gel per la lavorazione del campione non bolle monitorando la consistenza del gel. NOTA: Una volta che il gel di lavorazione del campione è fuso, ma non bollente, lavorare rapidamente per incapsulare gli organoidi.</li>
	<li>Trasferire abbastanza gel per la lavorazione del campione per coprire l'intera superficie dello stampo (circa 250 μL).</li>
	<li>Mentre il gel per la lavorazione del campione è ancora fuso, trasferire rapidamente i 50 μL di soluzione di etanolo al 70% contenente gli organoidi. Assicurarsi che gli organoidi siano affondati o spinti nella parte inferiore dello stampo.</li>
	<li>Posizionare lo stampo istologico su un secchio di ghiaccio e lasciare raffreddare e solidificare il gel di lavorazione del campione.</li>
	<li>Una volta che il gel di lavorazione del campione è completamente asciutto, trasferire con attenzione il quadrato del gel di lavorazione del campione in una sacca del campione, tenendo traccia del piano in cui si trovano gli organoidi.</li>
	<li>Porre la sacca in una cassetta istologica e processare utilizzando metodi standard utilizzati per la fissazione della formalina e l'incorporazione di paraffina dei tessuti18.</li>
	<li>Dopo la fissazione e l'incorporazione in paraffina, suddividere in sezioni da 5 μm utilizzando un microtomo19. Procedere con le procedure standard di colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H & E) o immunocolorazione, come descritto di seguito.</li>
</ol>6. Colorazione di ematossilina ed eosina
<ol><li>Deparaffinizzare le sezioni come segue: xilene, 2 x 10 min; 100% etanolo, 2 x 3 min; 80% etanolo, 3 min; 60% etanolo, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min in ematossilina; acqua del rubinetto (3 x 5 s); 1 min in Eosin.</li>
	<li>Disidratare le sezioni come segue: 60% di etanolo, 3 min; 80% etanolo, 3 min; 95% etanolo, 3 min; 100% etanolo, 2 x 3 min; xilene, 2 x 15 min.</li>
	<li>Montare utilizzando il mezzo di montaggio.</li>
</ol>7. Colorazione con immunofluorescenza
<ol><li>Deparaffinizzare le sezioni come descritto al punto 6.1.</li>
	<li>Eseguire il recupero dell'antigene<ol><li>Immergere i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene in un contenitore sicuro per il microonde.</li>
		<li>Microonde a fuoco alto per 20 minuti, utilizzando intervalli di 5 minuti per garantire che la soluzione non bolle.</li>
	</ol></li>
	<li>Al termine della fase di recupero dell'antigene di 20 minuti, lasciare raffreddare i vetrini sul ghiaccio per 40 minuti mentre sono ancora immersi nel tampone di recupero dell'antigene.</li>
	<li>Lavare i vetrini con 1x TBST per 3 minuti</li>
	<li>Bloccare i vetrini incubando in BSA al 3% in TBST per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubazione di anticorpi primari<ol><li>Diluire l'anticorpo in BSA al 3% nel TBST (1:50-1:1.000, a seconda di Ab).</li>
		<li>Incubare per una notte a 4 °C in camera umidificata.</li>
		<li>Lavare 3 x 5 minuti con TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubazione di anticorpi secondari<ol><li>Diluire l'anticorpo in BSA al 3% (in TBST) (1:250) o in siero normale di asino al 5%.</li>
		<li>Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT) al buio, poiché l'anticorpo è coniugato a un fluoroforo.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione nucleare<ol><li>Diluire 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) 1:1.000 in TBST.</li>
		<li>Incubare per 5 minuti a RT.</li>
		<li>Lavare 2 x 5 minuti con TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Montante<ol><li>Utilizzare una goccia di supporto di montaggio per montare il coperchio.</li>
		<li>Sigillare la copertina con lo smalto il giorno seguente.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Qui, descriviamo i metodi per generare organoidi epiteliali endometriali dall'endometrio del topo e i protocolli utilizzati abitualmente per la loro analisi a valle. Gli organoidi endometriali sono un potente strumento per studiare i meccanismi che controllano le malattie correlate all'endometrio, come l'endometriosi, il cancro dell'endometrio e il fallimento dell'impianto. Studi di riferimento pubblicati nel 2017 hanno riportato le condizioni per la coltura a lungo termine e colture rinnovabili di organoidi endometriali...

L'endometrio - il tessuto mucoso del rivestimento interno della cavità uterina - è un tessuto unico e altamente dinamico che svolge ruoli critici nella salute riproduttiva di una donna. Durante la vita riproduttiva, l'endometrio ha il potenziale per subire centinaia di cicli di proliferazione, differenziazione e rottura, coordinati dall'azione concertata degli ormoni ovarici - estrogeni e progesterone. Studi su topi geneticamente modificati hanno scoperto meccanismi biologici di base alla base della risposta endometriale agli ormoni e del controllo dell'impianto dell'embrione, della decidualizzazione delle cellule stromali e della gravidanza1. Gli studi in vitro, tuttavia, sono stati limitati a causa delle difficoltà nel mantenere tessuti endometriali primari di topo non trasformati nelle colture cellulari 2D tradizionali 2,3. I recenti progressi nella coltura dei tessuti endometriali come sistemi di organi 3D, o organoidi, rappresentano una nuova opportunità per studiare i percorsi biologici che controllano la rigenerazione e la differenziazione delle cellule endometriali. I sistemi organoidi endometriali di topo e umano sono stati sviluppati da epitelio endometriale puro incapsulato in varie matrici4,5, mentre l'endometrio umano è stato coltivato come co-colture epiteliali/stromali prive di scaffold 6,7 e, più recentemente, come assembloidi epiteliali/stromali incapsulati in collagene8 . La crescita e il potenziale rigenerativo delle colture organoidi epiteliali è supportato da un cocktail definito di fattori di crescita e inibitori di piccole molecole che sono stati empiricamente determinati per massimizzare la crescita e la rigenerazione degli organoidi 4,5,9. Inoltre, la capacità di congelare e scongelare gli organoidi endometriali consente la banca a lungo termine di organoidi endometriali da topi e umani per studi futuri.
Topi geneticamente modificati hanno rivelato le complesse vie di segnalazione che controllano la gravidanza precoce e la decidualizzazione e sono stati utilizzati come modelli di perdita di gravidanza, cancro dell'endometrio ed endometriosi. Questi studi genetici sono stati ampiamente raggiunti con la delezione cellulo-specifica di alleli affiancati da loxP ("floxed") utilizzando cre ricombinasi che sono specificamente attive nei tessuti riproduttivi femminili. Questi modelli murini includono il recettore del progesterone-cre10, ampiamente utilizzato, che ha una forte attività ricombinasi nei tessuti epiteliali e stromali endometriali, la lattoferrina i-cre, che induce la ricombinazione epiteliale endometriale nei topi adulti11, o Wnt7a-cre, che innesca la delezione epiteliale-specifica nei tessuti di derivazione mülleriana12 . La coltura di tessuti endometriali da modelli murini geneticamente modificati come organoidi 3D ha fornito un'eccellente opportunità per studiare la biologia endometriale e facilitare l'identificazione dei fattori di crescita e delle vie di segnalazione che controllano il rinnovamento e la differenziazione delle cellule endometriali13,14. I metodi per l'isolamento e la coltura del tessuto endometriale del topo sono descritti in letteratura e riportano l'uso di varie strategie enzimatiche per l'isolamento dell'epitelio uterino per la successiva coltura di organoidi epiteliali endometriali4. Mentre la letteratura precedente fornisce un quadro critico per i protocolli di coltura organoide epiteliale endometriale 4,5,6, questo articolo fornisce un metodo chiaro e completo per generare, mantenere, elaborare e analizzare questi organoidi. La standardizzazione di queste tecniche è importante per accelerare i progressi nel campo della biologia riproduttiva femminile. Qui, riportiamo una metodologia dettagliata per la purificazione enzimatica e meccanica del tessuto epiteliale endometriale di topo per la successiva coltura di organoidi endometriali in un'impalcatura a matrice di gel. Descriviamo anche le metodologie per le analisi istologiche e molecolari a valle degli organoidi epiteliali endometriali di topo incapsulati in gel con matrice di remu.

<table><tbody><tr><td>Formulazione dei terreni organoidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Concentrazione finale</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrice della membrana basale, *Senza LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>Tripsina dal pancreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>1X N2 supplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade; Integratore (50X), meno vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &; g/mL</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 inibitore, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Noggin umana ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rispondina-1 umana ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-10 umana ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>HGF umana ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& Sistemi D</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Altre forniture e reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Concentrazione finaleCollagenasi</td></tr> <tr><td>da Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ mL</td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I da pancreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Micropiastre in polistirene (24 pozzetti)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Micropiastre in polistirene (12 pozzetti)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per celle di falco, 40 &; micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 &micro; g)</td><td>Reagente Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, Carbone spogliato</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldeide 16% in acquosa soluzione, EM Grade</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia Cassette 1 Cassette per tessuti scanalate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Stampi per base per inclusione in acciaio inossidabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio permanente</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Nylon Sacche per biopsia</td><td>Fisher</td><td>Scientific 6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Gel per l'elaborazione dei campioni</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di eosina Y (giallastra) Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tampone, 20X, pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Acido citrico.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td> Soluzione <td>3%</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie trasparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Krt8 (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>Diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Vimentin Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-ratto d'asino (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>Diluizione 1:250</td></tr><tr><td>Anti-Rabbin d'asino IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>Diluizione 1:250</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Microscopio</td><td>ZEISS ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Microscopio di routine invertito con fotocamera digitale</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Sequence</td><td>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Lattoferrina (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi (Gapdh)</td><td>CAATGTGTGTGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilire organoidi endometriali 3d dall'utero del topo

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Il tessuto endometriale riveste la cavità interna dell'utero ed è sotto il controllo ciclico di estrogeni e progesterone. È un tessuto composto da epitelio luminale e ghiandolare, un compartimento stromale, una rete vascolare e una popolazione di cellule immunitarie complesse. I modelli murini sono stati un potente strumento per studiare l'endometrio, rivelando meccanismi critici che controllano l'impianto, la placentazione e il cancro. Il recente sviluppo di colture organoidi endometriali 3D presenta un modello all'avanguardia per sezionare le vie di segnalazione che sono alla base della biologia endometriale. Stabilire organoidi endometriali da modelli murini geneticamente modificati, analizzare i loro trascrittomi e visualizzare la loro morfologia a una risoluzione a singola cellula sono strumenti cruciali per lo studio delle malattie dell'endometrio. Questo articolo delinea i metodi per stabilire colture 3D di epitelio endometriale da topi e descrive tecniche per quantificare l'espressione genica e analizzare l'istologia degli organoidi. L'obiettivo è quello di fornire una risorsa che possa essere utilizzata per stabilire, coltivare e studiare l'espressione genica e le caratteristiche morfologiche degli organoidi epiteliali endometriali.

Immagini a contrasto di fase di organoidi endometriali di topo Abbiamo stabilito organoidi dall'epitelio endometriale del topo WT, come descritto nel protocollo allegato (vedi diagramma in Figura 1). Dopo la dissociazione enzimatica dell'epitelio endometriale del topo, i fogli epiteliali sono stati separati meccanicamente dalle cellule stromali uterine e ulteriormente dissociati dalla collagenasi per generare una sospensione unicellulare. Se eseguito correttamente, questo...

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire organoidi epiteliali endometriali di topo per l'espressione genica e le analisi istologiche.

Stabilire organoidi endometriali 3D dall'utero del topo

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Questo protocollo è significativo in quanto mostra una metodologia passo-passo per isolare l'epitelio uterino altamente puro dall'utero del topo per la coltura di organoidi endometriali. Questo metodo utilizza in modo efficiente la dissociazione enzimatica e meccanica per isolare l'epitelio uterino. Le tecniche sono state ottimizzate per stabilire, trattare e analizzare gli organoidi dell'epitelio endometriale derivati dall'epitelio isolato.Iniziare scongelando la matrice di gel sul ghiaccio per circa una o due ore prima dell'uso. Quindi sezionare il topo eutanasia praticando un'incisione mediana sull'addome usando le forbici e staccando delicatamente la pelle per esporre lo strato peritoneale sottostante. Individuare le corna uterine spostando delicatamente i cuscinetti di grasso addominale da parte e tenere le corna uterine alla giunzione cervicale prima di tagliarle lungo il grasso mesenterico.Dopo la dissezione dell'utero del topo, rimuovere accuratamente il tessuto adiposo dal corno uterino con piccole forbici. Una volta fatto, tagliare ogni corno uterino in piccoli frammenti, ciascuno dei quali misura circa quattro o cinque millimetri. Mettere tutti i frammenti uterini da un utero in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 0,5 millilitri di tripsina all'1%.Quindi incubare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore di coltura tissutale umidificata a 37 gradi Celsius per circa un'ora per la separazione enzimatica dell'epitelio endometriale dallo stroma sottostante. Dopo l'incubazione, trasferire i frammenti uterini su una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente un millilitro di soluzione tamponata fosfato di Dulbecco o DPBS. Quindi, separare l'epitelio uterino dal tubo uterino al microscopio a dissezione tenendo un'estremità di un frammento uterino con la pinza e facendo scorrere delicatamente la punta della pipetta longitudinalmente attraverso il frammento, schiacciando l'epitelio dall'altra estremità del tubo uterino.Quindi osservare i fogli epiteliali separati dal frammento uterino al microscopio a dissezione. Quindi, trasferire delicatamente tutti i fogli epiteliali nello stesso tubo da 1,5 millilitri usando la pipetta da un millilitro. E pellet i fogli epiteliali dissociati mediante centrifugazione a 375 x g per cinque minuti.Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet cellulare in 0,5 millilitri di 2,5 milligrammi per millilitro di collagenasi più due milligrammi per millilitro di soluzione di DNA. Pipettare su e giù circa 10 volte o fino a raggiungere una sospensione a cella singola. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di DMEM F / 12 più siero bovino fetale al 10% o FBS più antibiotici e centrifugare le cellule per cinque minuti a 375 x g.Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro DMEM / F12 più 10% FBS più antibiotici e centrifugare le cellule. Posizionare la matrice di gel sul ghiaccio fino a quando non è pronta. Quindi, rimuovere il surnatante dalle celle della centrifuga e risospendere il pellet cellulare utilizzando 20 volte il volume della matrice di gel senza introdurre le bolle.Lasciare riposare la sospensione cellulare della matrice di gel a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Una volta che la sospensione della cella della matrice di gel diventa un gel semi-solido, utilizzare una micropipetta P200 con una punta larga da 200 microlitri e aspirare delicatamente 25 microlitri della sospensione cellulare della matrice di gel. Erogare tre cupole separate da 25 microlitri per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e lasciare polimerizzare la matrice di gel per 15 minuti e un incubatore di coltura tissutale umidificata a 37 gradi Celsius.Dopo che la matrice di gel è stata polimerizzata, aggiungere 750 microlitri di mezzo organoide a ciascun pozzetto contenente cupola della matrice di gel e incubatore a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura di tessuti umidificati. Le immagini a contrasto di fase degli organoidi endometriali di topo hanno mostrato che la separazione delle cellule epiteliali e stromali ha prodotto campioni con non più del 10-15% di contaminazione del tipo di cellula opposta. Le cellule epiteliali endometriali sono state assemblate in organoidi entro tre o quattro giorni.Gli organoidi endometriali incorporati in paraffina sezionata in formalina sono stati visualizzati da colorazioni di ematossilina ed eosina, che mostravano il singolo strato di epitelio e centri cavi, i lumi degli organoidi. L'imaging al microscopio a fluorescenza ha mostrato che tutte le cellule degli organoidi erano citocheratine 8-positive e contenevano DAPI, indicando che la fissazione, l'incorporazione e l'elaborazione degli organoidi endometriali è compatibile con l'immunocolorazione basata sugli anticorpi. La PCR quantitativa in tempo reale ha mostrato che la stimolazione con estradiolo nanomolare 10 ha aumentato l'espressione di lipocalina 2, lattoferrina e recettore del progesterone negli organoidi epiteliali, indicando che gli organoidi epiteliali endometriali possono essere utilizzati con successo per misurare i cambiamenti di espressione genica in risposta all'estradiolo.È importante assicurarsi che si ottenga una chiara separazione dell'epitelio endometriale durante la fase di dissociazione meccanica. Si dovrebbe essere in grado di osservare l'epitelio che emerge dal tubo uterino. Altri metodi includono la creazione degli organoidi epiteliali mediante incapsulamento in una matrice di gel.Se lo si desidera, il compartimento stromale può essere ulteriormente digerito per creare co-colture stromali epiteliali 3D. Il metodo può aiutare a rispondere alle domande sui segnali che controllano il rinnovamento dell'endometrio. Potrebbe aiutare a trattare le malattie nelle donne, come l'endometriosi, la perdita di gravidanza e il cancro.

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