Name: Una camera flessibile per limaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione Raman stimolata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Impara a utilizzare una camera flessibile per l'imaging time-lapse di cellule vive con microscopia SRS. Questo metodo consente di studiare la dinamica dei lipid droplets in cellule SKOV3 trattate con acido oleico per 24 ore.

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Vogliamo ringraziare il 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza e James Walsh) presso la Binghamton University per la progettazione, la fabbricazione e il collaudo della scatola di custodia del microscopio. Ringraziamo Scott Hancock, Olga Petrova e Fabiola Moreno Olivas della Binghamton University per le utili discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health con il numero di premio R15GM140444.

1. Costruire l'involucro ambientale del microscopio
NOTA: Questo grande involucro ambientale del microscopio viene utilizzato per controllare la temperatura del corpo del microscopio e l'ambiente di imaging da stabilizzare a 37 °C (Figura 1A).
<ol><li>Segnare le posizioni dei piedi del telaio del microscopio SRS e del palcoscenico motorizzato utilizzando un pennarello sul tavolo ottico. Montare due diaframmi dell'iride davanti allo scanner galvanometrico del microscopio e regolarli per far passare la pompa e i raggi laser Stokes attraverso il centro dei diaframmi dell'iride.</li>
	<li>Rimuovere la cornice del microscopio e il palcoscenico dal tavolo ottico.</li>
	<li>Posare il foglio di gomma siliconica (dimensioni: 31 x 29 pollici, spessore: 1/8 di pollice) sul tavolo ottico (Figura 1B).</li>
	<li>Tagliare la gomma siliconica lungo i segni usando un coltello, rimuovere piccoli pezzi di gomma e posizionare i fogli quadrati di ceramica MICA (dimensioni: 6 x 6 pollici, spessore: 1/4 di pollice) nelle stesse posizioni. NOTA: La ceramica MICA è un materiale facile da lavorare15. È duro come l'alluminio ma è un eccellente isolante termico. Le lastre ceramiche MICA sono state utilizzate per fermare il trasferimento di calore dal telaio e dal palcoscenico del microscopio metallico al tavolo ottico in acciaio inossidabile. Alcuni fori passanti devono essere praticati sui fogli MICA per consentire l'uso di 1/4-20 viti per il montaggio dei piedini del telaio e del palco.</li>
	<li>Spostare la cornice del microscopio e il palco sul tavolo ottico e allineare con cura i piedini sui fogli ceramici MICA lungo le linee di marcatura. Utilizzare 1/4-20 viti per montare il telaio e il palco sul tavolo.</li>
	<li>Riallineare il percorso ottico SRS. Regolare i supporti a specchio di Mirror 1 e Mirror 2 per far passare il raggio laser attraverso il centro dei due diaframmi del diaframma premontati (Figura 2). NOTA: I dettagli tecnici del microscopio SRS costruito in laboratorio utilizzato per l'attuale lavoro di imaging delle cellule vive sono descritti in precedenza16. La larghezza dell'impulso della pompa e dei fasci Stokes è ~ 3-4 ps con dispersione dell'asta di vetro. Il sistema è controllato tramite il software ScanImage17 .</li>
	<li>Sopra questa fondazione di isolamento termico, assemblare l'involucro ambientale per coprire l'intero telaio del microscopio utilizzando cinque pezzi di grandi lastre di policarbonato (dimensioni: 31 x 29 x 28 pollici, spessore: 0,25 pollici). NOTA: La dimensione della scatola della custodia è determinata in base alle dimensioni del telaio del microscopio e del palcoscenico. Il pannello frontale della scatola del microscopio dovrà essere rimosso temporaneamente per installare la camera flessibile e caricare il piatto di coltura cellulare.<ol><li>Per assemblare l'involucro, eseguire semplici lavori di lavorazione, tra cui taglio, foratura e maschiatura dei fori delle viti su ciascun bordo delle lastre di policarbonato. Tagliare due grandi fori con un diametro di 2,6 pollici sui fogli destro e sinistro della custodia per adattarsi rispettivamente ai tubi di ingresso e di uscita. Tagliare un piccolo foro con un diametro di 5 mm sul foglio posteriore per consentire ai raggi laser di entrare nella custodia.</li>
	</ol></li>
	<li>Sigillare i bordi e le interfacce della scatola utilizzando nastro di alluminio.</li>
	<li>Collegare il tubo flessibile del condotto alle porte di ingresso e di uscita della scatola della custodia per consentire il flusso di aria calda di circolazione pompato e controllato dal modulo riscaldatore. Posizionare il sensore termico del modulo riscaldatore nella camera flessibile in cui le celle vengono coltivate e riprese. Impostare la temperatura target a 37 °C. NOTA: Un diffusore può essere utilizzato per ottenere una distribuzione più uniforme del flusso d'aria nell'involucro ambientale.</li>
</ol>2. Assemblare la camera flessibile
<ol><li>Montare il pezzo cilindrico cilindrico in alluminio lavorato 1 (materiale: alluminio 6061) sul nasello dell'obiettivo utilizzando tre viti di fissaggio (Figura 2).</li>
	<li>Montare il pezzo cilindrico cilindrico in alluminio 2 lavorato sul portacampioni utilizzando quattro viti 1/4-20 (Figura 2). NOTA: Il portacampioni deve essere modificato per contenere il piatto di coltura cellulare con fondo di vetro di copertura da 50 mm. Praticare un foro passante al centro del portacampioni utilizzando una sega forata da 1-7/8 pollici. Profilare il foro con una sega da 50 mm e mantenere la profondità del foro passante ~1 mm.</li>
	<li>Montare il portacampioni con il pezzo di alluminio 2 sul palco motorizzato e montarlo utilizzando viti.</li>
	<li>Posizionare il manicotto del film di gomma naturale (spessore: 0,01 pollici; incollato con adesivo cianoacrilato) tra i due pezzi di alluminio lavorati e montarlo utilizzando elastici a ciascuna estremità.</li>
	<li>Collegare la bombola di CO2 compressa al modulo miscelatore di gas utilizzando tubi e connettori appropriati. Impostare la pressione di ingresso di CO2 a 20-25 psi. Utilizzare un sensore CO 2 integrato e un controller per garantire che il modulo miscelatore dell'aria possa regolare e miscelare il 5% di CO2 nel flusso d'aria. Utilizzare filtri in linea per pulire il flusso d'aria.</li>
	<li>Utilizzando tubi e connettori adeguati, guidare l'aria miscelata (con il 5% di CO2) verso la bottiglia d'acqua presterilizzata posta sulla piastra calda, quindi guidare l'aria umidificata verso la camera flessibile. Impostare la piastra riscaldante a 37 °C. Bolle il flusso d'aria nell'acqua calda per aumentare l'umidità del flusso d'aria.</li>
</ol>3. Preparazione per esperimenti di imaging SRS di cellule vive time-lapse
<ol><li>Pulire tutte le parti della camera flessibile con etanolo al 70%, compreso il nasello, l'obiettivo di immersione dell'acqua e il supporto del campione.</li>
	<li>Decontaminare l'intero sistema di custodia utilizzando una lampada UV posizionata nella custodia per 20-30 minuti. NOTA: Non rimanere nella stanza di laboratorio durante il processo di disinfezione UV per sicurezza.</li>
	<li>Coltura di cellule SKOV3 in una capsula di Petri con fondo di vetro da 50 mm per 12 ore in normali condizioni fisiologiche in una normale incubatrice. NOTA: Avviare la coltura cellulare SKOV318 in un armadio di biosicurezza standard.</li>
	<li>Scollegare il pezzo di alluminio lavorato 2 dal portacampioni rimuovendo le viti. NOTA: Questo è il modo per aprire la camera flessibile per caricare il piatto di coltura cellulare.</li>
	<li>Caricare il piatto di coltura cellulare. Ricordarsi di aggiungere olio ad immersione sulla parte superiore del condensatore prima di posizionare il piatto di coltura cellulare. Rimuovere il coperchio del piatto e immobilizzare il piatto usando i morsetti. NOTA: Per evitare la contaminazione, tutte le operazioni devono essere eseguite con i guanti.</li>
	<li>Abbassare l'obiettivo nei terreni di coltura cellulare per una messa a fuoco grossolana. Abbassare il pezzo di alluminio 2 per racchiudere la camera flessibile e montarlo sul supporto del campione utilizzando viti. NOTA: Un cuscino in gomma siliconica da 2 mm è fissato sul fondo del pezzo di alluminio 2 per sigillare saldamente lo spazio.</li>
	<li>Impostare l'alimentazione dell'aria con il 5% di CO 2 e il 19% di O2 per la normale coltura cellulare con una portata d'aria di 200 cc/min. NOTA: è possibile utilizzare una portata d'aria inferiore. Dipende da quanto bene è sigillata la camera flessibile.</li>
</ol>4. Condurre esperimenti di imaging SRS con cellule vive time-lapse
<ol><li>Sintonizzare la lunghezza d'onda del laser a 805 nm per indirizzare lo spostamento Raman di 2854 cm-1 , che è attribuito alla vibrazione dei legami chimici CH2 . Utilizzare una bassa potenza laser per ridurre il fotodanneggiamento delle cellule. Per seguire questo protocollo, utilizzare ~ 15 mW di potenza media del laser a pompa e ~ 7,5 mW del laser Stokes (fissato a 1.045 nm) per l'imaging a lungo termine delle cellule vive. NOTA: una maggiore potenza laser produrrà una migliore qualità dell'immagine SRS. Tuttavia, una potenza laser troppo elevata indurrà danni fotografici alle cellule vive. C'è un compromesso tra qualità dell'immagine e fotodanneggiamento.</li>
	<li>Regolare e mettere a fuoco l'obiettivo per ottenere una buona immagine SRS delle celle utilizzando il pulsante FOCUS sul pannello CONTROLLI PRINCIPALI del software. Per eseguire una messa a fuoco rapida, impostate il numero di pixel su 512 × 512 pixel con un tempo di permanenza dei pixel di 4,8 μs nel pannello CONFIGURAZIONE .</li>
	<li>Impostare l'intervallo di ingresso dell'amplificatore lock-in (in genere 5 mV) in modo che sia il doppio della tensione massima del segnale. Impostare il filtro passa-basso in modo che corrisponda al tempo di permanenza dei pixel (4,8 μs). NOTA: diversi sistemi SRS costruiti in laboratorio possono utilizzare impostazioni di acquisizione dati diverse.</li>
	<li>Dopo aver ottenuto una buona messa a fuoco, impostare la risoluzione dell'immagine su 2.048 × 2.048 pixel per un campo visivo di 175 μm2 per l'acquisizione di immagini di alta qualità. Controllare la funzione SAVE sul pannello CONTROLLI PRINCIPALI e controllare il canale SRS sul pannello CANALI . Impostate il tempo di intervallo tra due fotogrammi su 180 s (3 min) sul canale MAIN CONTROLS. Impostare il numero di acquisizione su 480 per l'imaging time-lapse nell'arco di 24 ore. NOTA: è possibile utilizzare una risoluzione di imaging inferiore in base allo scopo degli esperimenti.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione automatica delle immagini utilizzando la funzione LOOP sul pannello CONTROLLI PRINCIPALI . NOTA: verificare se c'è una deriva focale dovuta all'instabilità della temperatura nella prima ora di imaging. L'imaging della prima ora potrebbe non essere stabile. Controllare la messa a fuoco ogni 2-3 ore durante la sessione di imaging time-lapse.</li>
	<li>Elaborare le immagini raccolte utilizzando ImageJ19. Utilizzare i seguenti due metodi per la quantificazione della LD: (i) il rapporto LD/area corporea cellulare e (ii) l'intensità media SRS delle LD totali. Misurare l'area del corpo cellulare sospendendo e azzerando i pixel non cellulari nelle immagini SRS a 2.854 cm-1. Misurare l'area LD e l'intensità sospendendo e azzerando i pixel non LD nelle immagini SRS. NOTA: ulteriori dettagli sull'elaborazione delle immagini SRS sono stati segnalati in precedenza16.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La microscopia SRS a cellule vive time-lapse è una tecnica di imaging alternativa per il tracciamento delle molecole in modo label-free. Rispetto alla marcatura a fluorescenza, l'imaging SRS è privo di fotosbiancamento, consentendo il monitoraggio a lungo termine delle molecole. Tuttavia, ad oggi, il sistema di imaging di cellule vive su una microscopia SRS verticale non è disponibile in commercio. In questo lavoro, è stato sviluppato un sistema di imaging di cellule vive con una scatola stabile per microscopio isolato t...

La microscopia ottica viene utilizzata per osservare le microstrutture dei campioni. L'imaging ottico è rapido, meno invasivo e meno distruttivo di altre tecnologie1. L'imaging delle cellule vive con microscopia ottica è sviluppato per catturare la dinamica delle cellule vive in coltura per un lungo periodo2. Diversi tipi di contrasti ottici forniscono informazioni distinte sui campioni biologici. Ad esempio, la microscopia ottica di fase mostra la sottile differenza negli indici di rifrazione nel campione3. La microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche biomolecole o organelli cellulari. Tuttavia, gli spettri di eccitazione a banda larga e di emissione della fluorescenza di solito provocano sovrapposizioni spettrali quando viene eseguita l'imaging multicolore4. Le molecole fluorescenti sono sensibili alla luce e possono essere sbiancate dopo un'esposizione periodica alla luce a lungo termine. Inoltre, la marcatura a fluorescenza può modificare la biodistribuzione delle molecole nelle cellule5. La microscopia SRS è una tecnologia di imaging chimico label-free6. Il contrasto di SRS si basa sulla transizione vibrazionale di specifici legami chimici. La frequenza vibrazionale di un legame chimico spesso mostra una larghezza di banda spettrale ristretta, rendendo possibile l'immagine di più bande Raman negli stessi campioni7. La microscopia SRS è uno strumento unico per l'imaging di cellule vive, che fornisce molteplici contrasti chimici in modo label-free8.
Mentre l'imaging SRS di cellule non colorate è stato utilizzato per molti studi, l'imaging SRS time-lapse a lungo termine di cellule vive non è stato ampiamente adottato. Uno dei motivi è che le camere aperte commerciali non possono essere utilizzate direttamente per l'imaging SRS a causa del loro grande spessore 9,10,11,12. Queste camere con coperchio in vetro sono per lo più progettate per l'imaging in campo chiaro o a fluorescenza utilizzando un singolo obiettivo ad alto NA con uno schema di rilevamento all'indietro. Tuttavia, l'imaging SRS preferisce il rilevamento trasmesso utilizzando sia un obiettivo NA elevato che un condensatore ad alto NA, che lascia solo uno spazio molto breve (in genere pochi millimetri) tra l'obiettivo e il condensatore. Per ovviare a questo problema, abbiamo progettato una camera flessibile utilizzando un materiale morbido per consentire l'imaging SRS time-lapse di cellule vive utilizzando una cornice per microscopio verticale. In questo progetto, l'obiettivo di immersione dell'acqua è stato racchiuso nella camera morbida e può muoversi liberamente in tre dimensioni per scopi di messa a fuoco e imaging.
La temperatura ottimale per la coltura della maggior parte delle cellule di mammifero è di 37 °C, mentre la temperatura ambiente è sempre inferiore di 10°. Una temperatura superiore o inferiore a 37 °C ha un effetto drammatico sul tasso di crescita cellulare13. Pertanto, il controllo della temperatura dell'ambiente di coltura cellulare è richiesto in un sistema di imaging di cellule vive. È noto che l'instabilità della temperatura porterà a problemi di sfocatura durante l'imaging a lungo termine14. Per ottenere un ambiente stabile a 37 °C, abbiamo costruito una grande camera di custodia per coprire l'intera struttura del microscopio, incluso uno strato di isolamento termico sotto il microscopio (Figura 1). All'interno della camera di controllo della temperatura di grandi dimensioni, la piccola camera flessibile aiuta a mantenere con precisione l'umidità fisiologica e il pH attraverso il flusso d'aria regolato integrato con il 5% di CO 2 (Figura 2). La temperatura e l'umidità delle camere sono state misurate per confermare che il design a doppia camera forniva la condizione ottimale di coltura cellulare per la crescita cellulare nell'imaging SRS periodico a lungo termine (Figura 3). Abbiamo quindi dimostrato l'applicazione del sistema per l'imaging time-lapse e il monitoraggio delle goccioline lipidiche (LD) nelle cellule tumorali SKOV3 (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).

<table><tbody><tr><td>Microscopio SRS costruito in laboratorio <></td><td></td><td></td><td>https://rdcu.be/cP6ve</td></tr><tr><td>amplificatore lock-in HF2LI 50 MHz</td> Zurich <td>Instruments</td> Diaframma a iride <td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs Inc</td><td>SM1D12</td><td></td></tr><tr><td>Montatura a specchio cinematico</td><td>Thorlabs Inc</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>Telaio per microscopio</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-1</td><td></td></tr><tr><td>Tavolino per microscopia motorizzato</td><td>Prior Scientific</td><td>Z-Deck</td><td></td></tr><tr><td>Condensatore a immersione in olio (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td><td>Nikon Inc</td><td>MBL71405</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in acqua (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td><td>Nikon Inc</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td>Materiali e parti per l'involucro del microscopio (31'' x 29'' x 28'' L x P x A)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulo riscaldatore Airtherm</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SAT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Controllore riscaldatore Airtherm, CO2 e monitor di umidità</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SMT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Modulo mixer aria/CO2</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>ECU-HOC-W</td><td></td></tr><tr><td>Tubo flessibile per condotti (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>56675K71</td><td></td></tr><tr><td>Vetro-mica ceramica ad alta temperatura, facile da lavorare (6'' x 6'', 1/4'' di spessore)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8489K62</td><td></td></tr><tr><td>Lastre di policarbonato (spessore 0,25'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K286</td><td></td></tr><tr><td>Fogli di gomma siliconica (36'' x 36'', spessore 1/8'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>5827T43</td><td></td></tr><tr><td>Materiali e parti per la camera flessibile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>McMaster-Carr</td><td>31745K11</td><td></td></tr><tr><td>Filtro in linea ad alta purezza, 1/4 NPT</td><td>McMaster-Carr</td><td>6645T18</td><td></td></tr><tr><td>Sega a tazza (diametro di taglio 1-7/8 </td><td>McMaster-Carr</td><td>4066A34</td><td></td></tr><tr><td>Sega a tazza (diametro di taglio 50 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4556A19</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in gomma siliconica per alte temperature, morbido, diametro interno 2 mm, diametro esterno 5 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5054K313</td><td></td></tr><tr><td>Filtro in linea (1/4 NPT, 40 micron)</td><td>McMaster-Carr</td><td>98385K843</td><td></td></tr><tr><td>Tubo tondo multiuso in alluminio 6061 (spessore della parete 1/8'', 4' ' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K42</td><td></td></tr><tr><td>Multiuso 6061 Tubo tondo in alluminio (3/4'' spessore della parete, 3-3/4'' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K47</td><td></td></tr><tr><td>Multiuso 6061 Barra in alluminio (12'' x 12'', spessore 1/4'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8975K142</td><td></td></tr><tr><td>Multiuso 6061 Barra in alluminio (8'' x 8'', spessore 3/8' ')</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K21</td><td></td></tr><tr><td>Revolver obiettivo (singolo)</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-MN-H</td><td></td></tr><tr><td>Portacampione (modificato)</td><td>Prior Scientific</td><td>HZ202</td><td></td></tr><tr><td>Film di gomma naturale ultrasottile (spessore 0,01'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8611K13</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo di vetro sigillabile sottovuoto</td><td>McMaster-Carr</td><td>3231T44</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td>imagej.net</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies, LLC</td><td></td><td>Software di imaging SRS</td></tr><tr><td>Materiali per l'imaging di cellule vive</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover piastre di coltura sterili con fondo in vetro (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td><td>Microscopia elettronica (EMS)</td><td>70674-02</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>LysoSensor colorante fluorescente DND-189</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7535 (Invitrogen)</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico</td><td>MilliporeSigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr></tbody></table>

una camera flessibile per l'imaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione raman stimolata

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

La microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico label-free. L'imaging di cellule vive con SRS è stato dimostrato per molte applicazioni biologiche e biomediche. Tuttavia, l'imaging SRS time-lapse a lungo termine delle cellule vive non è stato ampiamente adottato. La microscopia SRS utilizza spesso un obiettivo ad immersione in acqua ad alta apertura numerica (NA) e un condensatore ad alta immersione in olio NA per ottenere immagini ad alta risoluzione. In questo caso, lo spazio tra l'obiettivo e il condensatore è solo di pochi millimetri. Pertanto, la maggior parte delle camere ambientali da palcoscenico commerciali non può essere utilizzata per l'imaging SRS a causa del loro grande spessore con una copertura di vetro rigido. Questo documento descrive la progettazione e la fabbricazione di una camera flessibile che può essere utilizzata per l'imaging di cellule vive time-lapse con rilevamento del segnale SRS trasmesso su un telaio del microscopio verticale. La flessibilità della camera si ottiene utilizzando un materiale morbido - un sottile film di gomma naturale. Il nuovo design dell'involucro e della camera può essere facilmente aggiunto a una configurazione di imaging SRS esistente. I test e i risultati preliminari dimostrano che il sistema a camera flessibile consente l'imaging SRS stabile, a lungo termine, time-lapse di cellule vive, che può essere utilizzato per varie applicazioni di bioimaging in futuro.

Abbiamo fabbricato e assemblato il sistema a camera flessibile per l'imaging SRS time-lapse (Figura 1 e Figura 2), quindi valutato le prestazioni del sistema. La temperatura all'interno dell'involucro ambientale del microscopio ha raggiunto i 37 °C previsti entro 1 ora, il che non ha influenzato significativamente la temperatura ambiente (Figura 3A). La temperatura nella camera flessibile ha raggiunto i 37 °C in 1,5 ore ed è stata m...

Riportiamo una camera ambientale flessibile per l'imaging time-lapse di cellule vive utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata verticalmente con rilevamento del segnale trasmesso. Le goccioline lipidiche sono state visualizzate in cellule SKOV3 trattate con acido oleico per un massimo di 24 ore con un intervallo di tempo di 3 minuti.

Una camera flessibile per l'imaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

La tecnica flessibile della camera ambientale consente l'imaging time-lapse come SRS con rilevamento del segnale trasmesso su un telaio del microscopio operatorio. La microscopia SRS ha utilizzato un obiettivo ad alta apertura numerica e un condensatore di fascia alta, lasciando solo pochi millimetri di spazio dove una camera convenzionale non può adattarsi. Una camera flessibile risolve questo problema.I ricercatori che utilizzano la microscopia SRS possono facilmente adottare questa tecnica. La camera flessibile può essere utilizzata anche su un microscopio da dissezione o sterile per mantenere il campione in condizioni fisiologiche ottimali. Per iniziare, segnare le posizioni dei piedi del telaio del microscopio SRS e del palcoscenico motorizzato usando una pennarello sul tavolo ottico.Dopo aver rimosso il telaio e il palcoscenico del microscopio dal tavolo ottico, posare il foglio di gomma siliconica sul tavolo. Tagliare la gomma siliconica lungo i segni usando un coltello. Rimuovere piccoli pezzi di gomma e posizionare i fogli quadrati di ceramica mica nelle stesse posizioni.Quindi spostare la cornice del microscopio e il palco sul tavolo ottico e allineare con attenzione i piedini sui fogli di ceramica mica lungo le linee di marcatore. Dopo aver riallineato il percorso ottico SRS, assemblare l'involucro ambientale sopra la fondazione di isolamento termico per coprire l'intero telaio del microscopio, utilizzando cinque pezzi di grandi lastre di policarbonato. Sigillare i bordi e le interfacce della scatola utilizzando nastro di alluminio.Collegare il tubo flessibile del condotto alle porte di ingresso e di uscita della scatola della custodia per consentire il flusso di aria calda di circolazione pompato e controllato dal modulo riscaldatore. Montare il pezzo cilindrico cilindrico in alluminio lavorato 1 sul nasello dell'obiettivo utilizzando tre viti di fissaggio. Quindi, montare il pezzo cilindrico cilindrico cilindrico 2 lavorato sul supporto del campione utilizzando quattro viti.Montare il portacampioni con il pezzo 2 in alluminio sul palco motorizzato e montarlo utilizzando viti. Posizionare il manicotto del film di gomma naturale tra i due pezzi di alluminio lavorati e montarlo utilizzando elastici a ciascuna estremità. Collegare la bombola di CO2 compressa al modulo miscelatore di gas utilizzando tubi e connettori appropriati.Impostare la pressione di ingresso della CO2 da 20 a 25 psi. Utilizzare il sensore di CO2 integrato e un controller per garantire che il modulo miscelatore dell'aria possa regolare e miscelare il 5% di CO2 nel flusso d'aria. Utilizzare filtri in linea per pulire il flusso d'aria.Utilizzando tubi e connettori adeguati, guidare l'aria miscelata verso la bottiglia d'acqua pre-sterilizzata posizionata sulla piastra riscaldante e quindi guidare l'aria umidificata verso la camera flessibile. Impostare la piastra riscaldante a 37 gradi Celsius. Bolle il flusso d'aria nell'acqua calda per aumentare l'umidità del flusso d'aria.Scollegare il pezzo di alluminio della macchina 2 dal portacampioni rimuovendo le viti. Pulire tutte le parti della camera flessibile con etanolo al 70%, incluso il nasello, il supporto del campione e l'obiettivo di immersione dell'acqua. Decontaminare l'intero sistema di custodia utilizzando una lampada UV posizionata nella custodia per 20-30 minuti.Quindi caricare il piatto di coltura cellulare. Rimuovere il coperchio del piatto e immobilizzarlo usando i morsetti. Abbassare l'obiettivo nei terreni di coltura cellulare per una messa a fuoco grossolana.Abbassare il pezzo di alluminio 2 per racchiudere la camera flessibile e montarlo sul supporto del campione utilizzando viti. Quindi inserire il sensore. Impostare l'alimentazione d'aria con il 5% di CO2 e il 19% di O2 per la normale coltura cellulare con una portata d'aria di 200 centimetri cubici al minuto e una temperatura di 37 gradi Celsius.Sintonizzare la lunghezza d'onda del laser a 805 nanometri per indirizzare lo spostamento Raman inverso di 2.854 centimetri, che è attribuito alla vibrazione dei legami chimici CH2. Utilizzare una bassa potenza laser per ridurre i danni fotografici alle cellule. Regolare e focalizzare l'obiettivo per ottenere una buona immagine SRS delle celle utilizzando il pulsante di messa a fuoco sul pannello di controllo principale del software.Per eseguire una messa a fuoco rapida, impostate il numero di pixel su 512 x 512 pixel con un tempo di permanenza dei pixel di 4,8 microsecondi sul pannello di configurazione. Dopo aver ottenuto una buona messa a fuoco, impostare la risoluzione dell'immagine su 2048 per 2048 pixel per un campo visivo quadrato di 175 micrometri per l'acquisizione di immagini di alta qualità. Controllare la funzione di salvataggio sul pannello di controllo principale e controllare il canale SRS sul pannello dei canali.Impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi su 180 secondi sul canale dei controlli principali. Impostare il numero di acquisizione su 480 per l'imaging time-lapse nell'arco di 24 ore. Avviare l'acquisizione automatica delle immagini utilizzando la funzione loop sul pannello di controllo principale.Sono state valutate le prestazioni del sistema a camera flessibile per l'imaging SRS time-lapse. La temperatura all'interno dell'involucro ambientale del microscopio ha raggiunto i 37 gradi Celsius previsti e non ha influenzato in modo significativo la temperatura ambiente. La temperatura nella camera flessibile ha raggiunto i 37 gradi Celsius in 1,5 ore ed è stata mantenuta stabilmente per almeno 24 ore.L'umidità relativa nella camera flessibile ha raggiunto l'85% in un'ora e potrebbe essere mantenuta per almeno 24 ore. L'imaging SRS time-lapse delle cellule SKOV3 vive ha mostrato il movimento rapido e attivo delle goccioline lipidiche intracellulari con una risoluzione temporale di tre minuti. Alla fine della sessione di imaging di 24 ore, le cellule mostravano ancora morfologia e densità normali, indicando che le cellule erano sane.Successivamente, sono state visualizzate le cellule SKOV3 trattate con acido oleico e l'accumulo di goccioline lipidiche è stato monitorato nell'arco di 10 ore. Le quantità di goccioline lipidiche sono state quantificate utilizzando il rapporto tra goccioline lipidiche e area corporea cellulare e l'intensità SRS totale delle goccioline lipidiche. I risultati indicano che la quantità di goccioline lipidiche ha continuato ad aumentare per 10 ore.È stato inoltre dimostrato l'imaging SRS simultaneo in avanti delle goccioline lipidiche e l'imaging a fluorescenza a due fotoni all'indietro dei lisosomi marcati con un colorante di fluorescenza DND-189. È stato osservato un grado molto basso di colocalizzazione delle goccioline lipidiche e dei lisosomi. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la deriva focale è un problema comune nell'imaging di cellule vive.Potrebbe essere necessaria una rimessa a fuoco dopo circa due ore di imaging time-lapse. Dopo il suo sviluppo, l'imaging SRS time-lapse è stato utilizzato per vari studi per tracciare molecole label-free o molecole marcate con testo Raman in cellule vive.

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Bioengineering

Bioingegneria

Fonte: Zhang, M. et al., Test rapido di suscettibilità antimicrobica tramite imaging stimolato a diffusione Raman dell'incorporazione del deuterio in un singolo batterio. J. Vis. Esperienza (2022)Questo video dimostra l'applicazione della microscopia a scattering Raman stimolata per valutare la suscettibilità agli antibiotici monitorando l'attività metabolica marcata con il deuterio. Monitorando i segnali carbonio-deuterio, il metodo consente la rapida rilevazione di popolazioni batteriche...

Rilevamento della suscettibilità agli antibiotici batterici utilizzando un microscopio a scattering Raman stimolato

Fonte: Espinoza, R., et al. Imaging di scattering Raman stimolato a due colori in tempo reale del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti. J. Vis. Exp. (2022).  Il video mostra l'imaging a due colori di scattering Raman stimolato (SRS) di sezioni di tessuto cerebrale di topo. Due raggi laser sincronizzati sono diretti sulla sezione di tessuto per eccitare le vibrazioni molecolari, determinando un cambiamento di intensità relativa nei raggi. I lipidi e le proteine nel tessuto vengono...

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Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

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Una camera flessibile per l'imaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione Raman stimolata

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