Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Questo metodo ci consente di progettare idrogel di collagene 3D con livelli controllati di allineamento delle fibre per modellare ambienti trovati in tessuti sani e malati nel corpo. Questa tecnica fornisce un semplice approccio microfluidico per progettare idrogel di collagene allineati, introdurre cellule e quantificare come le cellule si comportano in ambienti 3D topograficamente definiti. A dimostrare la procedura saranno Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly e Justin Vidas per il mio laboratorio.

Per iniziare, montare un foglio PDMS spesso 250 micrometri su un supporto di plastica e tagliare il design microfluidico utilizzando un cutter artigianale a una profondità della lama di 0,5 millimetri, velocità di un centimetro al secondo e forza elevata. Utilizzando un bagno ad ultrasuoni, pulire i ritagli del canale microfluidico per cinque minuti. Risciacquare i canali sonicati in acqua deionizzata e asciugarli su una piastra calda a 100 gradi Celsius per cinque minuti.

Conservare i canali in una capsula di Petri pulita e coperta fino all'uso. Per fabbricare lo strato di copertura PDMS e funzionalizzare la superficie per future modifiche, preparare una soluzione di amminopropiltrietossisilano al 2% in un becher di vetro aggiungendo un millilitro di amminopropiltrietossisilano a 49 millilitri di acetone. Quindi, diluire una soluzione di glutaraldeide al 25% al 5% in acqua deionizzata.

Fare due millilitri di soluzione per ogni slittamento di copertura da 24 millimetri per 50 millimetri. Pulire i vetrini di copertura in un sonicatore da bagno per cinque minuti usando IPA. Risciacquare l'alcool isopropilico dai vetrini di copertura con acqua deionizzata.

Una pellicola liscia di acqua sul vetrino indica che l'IPA è accuratamente risciacquato. Asciugare il coperchio scivola su una piastra calda per cinque minuti a 100 gradi Celsius. Posizionare le scivolate di copertura essiccate in piastre di Petri pulite, assicurandosi che non si sovrappongano.

Utilizzando una bacchetta di scarico corona, esporre i vetrini di copertura a una scarica corona per un minuto ciascuno. Rimuovere i vetrini di copertura entro cinque minuti dall'esposizione alla corona e immergere ogni vetrino di copertura nella soluzione di amminopropiltrietossisilano per 10 secondi, assicurandosi che il vetrino di copertura sia immerso Quindi, rimuovere i vetrini di copertura dalla soluzione di amminopropiltrietossisilano, immergerli nell'acetone per 10 secondi e asciugarli con aria compressa. Posizionare nuovamente la scivolata di coperchio asciutta nella capsula di Petri, con il lato trattato rivolto verso l'alto.

Pipettare un millilitro di soluzione di glutaraldeide sulla superficie di ciascun vetrino di copertura. Coprire quanta più superficie possibile senza permettere alla soluzione di fuoriuscire oltre il bordo del vetrino di copertura. Lasciare che il coperchio scivoli a contatto con la soluzione per 30 minuti e quindi risciacquare con acqua deionizzata per 20 secondi.

Asciugare i vetrini di copertura con aria compressa e riporli nelle piastre di Petri, il lato trattato al plasma verso l'alto Per il taglio laser della base magnetica modulare, ritagliare i disegni dallo strato di PMMA utilizzando le impostazioni laser appropriate, come il numero di passaggi e la potenza. Le impostazioni del laser devono essere regolate in modo che i magneti possano essere montati a pressione nello strato di PMMA. Lavare la parte tagliata al laser con acqua e sapone per rimuovere i detriti dal processo di taglio laser.

Non utilizzare solventi, in quanto potrebbero propagare microfessurazioni nei bordi tagliati al laser. Per assemblare la piattaforma, spingere i magneti a mano nella base tagliata al laser. Lo spessore dei magneti deve essere inferiore allo spessore della base in PMMA per garantire che i magneti siano a filo con la superficie della base.

Staccare il supporto dall'adesivo sensibile alla pressione, o foglio PSA, e fissare la base a un vetrino trattato con glutaraldeide con il lato funzionalizzato rivolto verso l'alto. Posizionare delicatamente il ritaglio del canale PDMS nella cavità definita dal telaio. Premere verso il basso con pinzette a punta larga per rimuovere le bolle d'aria e garantire un contatto conforme.

Posizionare l'albumina sierica bovina o il coperchio del canale trattato con BSA sopra il ritaglio del canale con il lato BSA rivolto verso il basso. Assicurarsi che le porte di ingresso e uscita del fluido siano allineate con il canale. Il dispositivo è pronto per l'iniezione di collagene I.

Inserire una pompa per siringa, una siringa sterile refrigerata, una soluzione di collagene I neutralizzato refrigerato e un ago sterile con blocco luer a punta angolare di 20 gradi calibro 20 in un armadio di biosicurezza. Caricare la soluzione di collagene I nella siringa, evitando bolle. Collegare la punta dell'ago alla siringa, caricare la siringa nella pompa della siringa, l'ago rivolto verso il basso, e innescare l'ago con la soluzione di collagene I.

Impostare la pompa a siringa sulla portata richiesta tra 50 e 2.000 microlitri al minuto. Posizionare i canali PDMS preparati su un jack da laboratorio e livellare con l'ago. Inserire l'ago nella porta di ingresso del canale PDMS.

Iniettare il canale fino a quando una goccia di 30 microlitri di collagene che raccolgo sul lato di uscita. Abbassare il jack da laboratorio e separare delicatamente l'ago dal canale appena riempito. Ripetere fino a quando tutti i canali sono stati riempiti con la soluzione di collagene I.

Caricare i canali riempiti nelle piastre di Petri insieme a una salvietta pulita e priva di lanugine satura di acqua deionizzata per prevenire la disidratazione del gel di collagene I appena formato. Coprire la piastra di Petri e posizionare i canali caricati nell'incubatore per due ore prima della fase di peel-off. Per il peel-off e l'equilibrio dei media, iniziare sollevando il coperchio PDMS usando una pinzetta per esporre il gel di collagene I polimerizzato.

Aggiungere 650 microlitri di terreno di crescita endoteliale al pozzetto. In alternativa, collegare un altro modulo per introdurre un ulteriore strato di collagene o fornire capacità di perfusione dei supporti. Lasciare i dispositivi nell'incubatore per un minimo di quattro ore per equilibrare il gel e il supporto.

Sostituire il supporto prima della semina con le celle. La funzionalizzazione dello slip di copertura in vetro ha permesso il decollo del canale e la funzionalizzazione della copertura PDMS con BSA hanno impedito l'attacco del collagene I. L'allineamento delle fibre di collagene I è rimasto inalterato dopo il sollevamento del coperchio.

Le immagini degli HUVEC coltivati sul segmento allineato della matrice hanno mostrato un maggiore allineamento delle fibre di actina rispetto agli HUVEC sul segmento con fibre casuali. Il nostro approccio ci consente di modellare il microambiente tumorale e quantificare come rispondono i diversi tipi di cellule. Possiamo anche introdurre canali di flusso per supportare esperimenti a lungo termine.