Gel fluidi di agarosio formati dalla lavorazione a taglio durante la gelificazione per la bioprinting 3D sospesa

La capacità di utilizzare diversi bioink è fondamentale per il successo dello sviluppo di strutture biostampate e questa tecnologia facilita l'uso di materiali generalmente incompatibili con le tecniche di stampa convenzionali. Il mezzo di sospensione impedisce il collasso dei bioink a bassa viscosità quando vengono depositati e consente l'integrazione di diversi bioink all'interno di un singolo costrutto per creare variazioni regionali nelle proprietà chimiche e meccaniche che sono più simili al tessuto nativo. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Tom Robertson, ricercatore dell'Università di Birmingham, e la Dr.Jessica Senior, ricercatrice dell'Università di Huddersfield.

Per iniziare, accendere il reometro e inserire geometrie seghettate da 40 millimetri, lasciandolo riposare per 30 minuti. Azzerare l'altezza del reometro utilizzando la funzione di altezza zero-gap. Aggiungere circa due millilitri di campione sulla piastra inferiore e abbassare la geometria superiore per creare un'altezza di spazio di un millimetro.

Rifilare il campione rimuovendo il materiale in eccesso espulso tra le piastre utilizzando un bordo piatto e non abrasivo per allontanare il fluido in eccesso dallo spazio e assorbirlo con carta velina. Per determinare l'iniettabilità del bioink, intraprendere profili viscometry selezionando Viscometry test dalle opzioni utente. Immettere i parametri per un test di rampa controllato dalla velocità di taglio da 0,1 a 500 al secondo con un tempo di rampa di un minuto.

Caricare un nuovo campione e ripetere il processo per garantire la riproducibilità. Per determinare le caratteristiche di gelificazione del bioink, sono stati eseguiti piccoli test di deformazione selezionando Test oscillatorio dalle opzioni utente. Immettere i parametri in un singolo test di frequenza sotto sforzo costante, come la frequenza di un hertz, deformazione dello 0,5% in un'ora mentre l'inchiostro gelifica.

Ripetere la prova di rampa viscometrica su nuovi campioni sotto controllo delle sollecitazioni utilizzando le sollecitazioni superiori e inferiori determinate dalla prova di rampa controllata dalla velocità di taglio in fase come dimostrato in precedenza. Per eseguire misure di ampiezza e frequenza in situ su campioni gelificati, selezionare un test oscillatorio dalle opzioni utente. Dopo aver selezionato la sweep di ampiezza, immettere i parametri per un test di sweep di ampiezza controllato da 0,01 a 500% a una frequenza costante di un hertz.

Dopo aver completato il test, analizzare gli spettri per determinare la regione viscoelastica lineare. Caricare un nuovo campione sul reometro e lasciarlo gelificare. Quindi selezionare un test oscillatorio dalle opzioni utente.

Selezionare i parametri di frequenza di prova e frequenza di ingresso compresi tra 0,01 e 10 hertz e una deformazione all'interno della regione viscoelastica lineare degli spettri determinata dai dati di ampiezza ottenuti in precedenza. Per avviare il software CAD e avviare la generazione di un modello CAD, selezionare l'opzione Strumenti e quindi fare clic su Materiali nel software CAD per definire i parametri di stampa per il bioink scelto. Immettete il diametro stimato del filamento nella scheda Spessore per determinare lo spessore z di ciascun livello.

Per progettare la struttura livello per livello, utilizzate le schede Livello nel software, raggruppate i livelli utilizzando la scheda Gruppo e assegnate ogni livello a un livello sul piano z utilizzando la scheda Livello. Generare una struttura reticolare creando uno strato con i filamenti lungo l'asse x e un secondo strato lungo l'asse y e assegnare entrambi a un livello separato. Nella scheda Raggruppa, determinare l'altezza di costruzione selezionando il numero di unità ripetute nella struttura.

Quindi fare clic sullo strumento Genera per creare un codice G per il progetto e visualizzare un rendering 3D della struttura. Nella bioprinter, inserire il bioink nella cartuccia di stampa e avvitarlo nella testina di stampa sopra la microvalvola. Quindi fare clic sulla funzione di misurazione della lunghezza dell'ago per calibrare la testina di stampa.

Quindi, collegare la testina di stampa assemblata al sistema di pressione pneumatico e caricare il recipiente di coltura sulla piattaforma di stampa. Una volta selezionata una pressione appropriata, aprire il codice G generato in precedenza e fare clic su Esegui per avviare il processo di stampa. Una volta completata la stampa dell'arteria carotide, utilizzare una siringa e un ago per iniettare due millilitri di cloruro di calcio 200 millimolari diidrato attorno al costrutto.

Dopo un minimo di tre ore, rimuovere il letto di supporto in gel fluido da tutto il costrutto e lavarlo delicatamente in PBS. Quindi rimuovere il costrutto dal bagno di supporto usando una spatola. È stata osservata la personalizzazione della risoluzione di stampa dei reticoli di alginato e collagene in funzione del diametro del filamento tramite estrusione a 30, 60 e 120 kilopascal e i risultati hanno dimostrato che la risoluzione era direttamente sintonizzabile con le variazioni della pressione di estrusione.

Per ottenere un gradiente di proprietà meccaniche simili a quelle che si trovano nella pelle, sono state utilizzate diverse proporzioni di pectina e collagene negli strati dermici e ipodermici, risultando in una struttura senza segni di delaminazione. Un alto livello di vitalità cellulare è stato osservato in tutta la struttura dopo 14 giorni di coltura durante i quali i materiali si sono irrigiditi, indicando il rimodellamento del materiale. Per la reologia, è importante che il campione sia caricato correttamente per garantire dati riproducibili, e per il bioprinting, è importante che la struttura sia completamente reticolata prima di rimuoverla dal letto di supporto.

La coltura di costrutti tissutali su larga scala per periodi prolungati aiuta a esplorare la risposta delle cellule incorporate agli stimoli fisici e chimici.