Name: Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri la quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR utilizzando primer divergenti e cellule C2C12. Questo metodo avanzato offre alta sensibilità e accuratezza per la ricerca diagnostica molecolare.

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Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti intramurali dell'Institute of Life Sciences, dalla sovvenzione di ricerca DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e dalla Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2 / 504017] assegnata ad Amaresh C. Panda. Ringraziamo gli altri membri del laboratorio per aver riletto l'articolo.

L'RNA è sensibile alle RNasi; pertanto, tutti i reagenti, gli strumenti e gli spazi di lavoro devono essere privi di RNasi e maneggiati con cura.
1. Disegno di primer divergente per circRNA (vedi Figura 1)
<ol><li>Recuperare la sequenza matura dai dati di annotazione del circRNA utilizzando BEDTools o dal browser del genoma UCSC unendo la sequenza esone/introne presente tra le coordinate di giunzione retrosplicare18,19.</li>
	<li>Preparare una sequenza modello PCR di 200 nucleotidi di lunghezza unendo gli ultimi 100 nucleotidi della lunghezza totale della sequenza circRNA ai primi 100 nucleotidi della sequenza circRNA10. NOTA: Se la lunghezza del circRNA è inferiore a 200 nucleotidi, dividerla in due metà uguali e unire i nucleotidi dall'ultima metà all'inizio della prima metà.</li>
	<li>Utilizzare la sequenza di modelli sopra per la progettazione del primer utilizzando lo strumento web Primer3 e impostando una lunghezza del prodotto PCR compresa tra 120-180 nucleotidi in lunghezza20.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni predefinite di Primer3 per altri parametri come Tm e lunghezza del primer. Le sequenze di primer per circBnc2 sono elencate nella Tabella 1.</li>
	<li>Ordina le sequenze di primer divergenti per la sintesi da qualsiasi azienda di oligosintesi.</li>
</ol>2. Isolamento dell'RNA
NOTA: Isolare l'RNA totale dalle cellule C2C12 del topo utilizzando qualsiasi kit disponibile in commercio o metodo di isolamento dell'RNA interno. Il metodo interno di isolamento dell'RNA utilizzato qui è stato descritto in precedenza21. Le sfere di silice magnetica sono preparate in laboratorio utilizzando il protocollo22 precedentemente pubblicato. Queste sfere magnetiche possono anche essere acquistate da vari fornitori.
<ol><li>Prendi un piatto da 10 cm contenente circa 5 x 106 cellule di mioblasti C2C12 proliferanti e un miotubo C2C12 differenziato di 4 giorni per l'isolamento dell'RNA.</li>
	<li>Lavare le celle con 10 ml di 1x PBS tre volte ed eliminare il PBS utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Raschiare le cellule in 1 mL di 1x PBS usando un raschietto cellulare, centrifugarle a 4 °C per 5 minuti a 750 x g ed eliminare il PBS usando una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento dell'RNA (RIR) e lisare le cellule mediante pipettaggio vigoroso21.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL (1/5 del volume di RIR) di cloroformio e vortice per 15 s. Centrifugare il tubo a 4 °C per 10 minuti a 12.000 x g.</li>
	<li>Prelevare 400 μL dello strato acquoso superiore, caricarlo su una colonna di silice e centrifugare per 1 minuto a 12.000 x g a temperatura ambiente. Portare il flusso in un nuovo tubo e aggiungere 600 μL di etanolo al 100%.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di sfere di silice magnetica e posizionare il tubo su un termomixer impostato a 25 °C e 1.200 giri/min per 5 minuti. NOTA: Il volume delle perle può essere aumentato o diminuito a seconda del numero iniziale di cellule prelevate per la lisi. Le sfere di silice magnetica possono essere acquistate da venditori commerciali.</li>
	<li>Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 30 secondi o fino a quando la soluzione diventa limpida. Scartare il surnatante con cautela usando una pipetta.</li>
	<li>Risospendere le sfere di silice magnetica in un tampone di lavaggio da 500 μL contenente il 90% di etanolo. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per 30 s. Ruotare il tubo due volte sul supporto magnetico per lavare le perline. Lasciare che le perline si depositino verso il magnete e gettare il tampone usando una pipetta.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.9 due volte. Dopo il lavaggio, ruotare brevemente il tubo e riposizionarlo sul supporto magnetico per 30 secondi. Eliminare il tampone di lavaggio rimanente. Asciugare all'aria il tubo a 50 °C per 3 minuti su un termomiscelatore, mantenendo il coperchio aperto.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere le perle. NOTA: Il volume di eluizione dell'RNA può essere ridotto fino a 10 μL per aumentare la concentrazione di RNA.</li>
	<li>Posizionare i tubi per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e lasciarlo riposare per 30 secondi. Raccogliere l'RNA disciolto in una nuova provetta per la valutazione della quantità e della qualità utilizzando uno spettrofotometro. NOTA: L'RNA può essere conservato a -20 °C o -80 °C per la conservazione a lungo termine. Per ottenere un risultato ottimale, si consiglia di procedere con la fase di sintesi del cDNA il giorno successivo.</li>
</ol>3. Sintesi del cDNA
<ol><li>Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e prendere 1 μg di RNA per la sintesi del cDNA.</li>
	<li>Mescolare 1 μg di RNA totale con 1 μL di miscela dNTP (10 mM ciascuno di dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 4 μL di tampone 5x di trascrittasi inversa (RT), 2 μL di 10x RT random primer, 0,25 μL di enzima trascrittasi inversa (200 U/μL) e 0,5 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL) e portare il volume fino a 20 μL utilizzando acqua priva di nucleasi. NOTA: Il volume dell'enzima trascrittasi inversa può essere alterato a seconda della concentrazione iniziale di RNA prelevata per la sintesi del cDNA.</li>
	<li>Tocca il tubo per mescolare la reazione e ruotare brevemente. Posizionare il tubo a 25 °C per 10 minuti e poi a 50 °C per 1 ora.</li>
	<li>Per inattivare l'enzima, posizionare il tubo a 85 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Raffreddare il tubo per 2 minuti e aggiungere 480 μL di acqua priva di nucleasi al tubo per ottenere la concentrazione di cDNA a 2 ng/μL. NOTA: il cDNA può essere conservato a -20 °C o utilizzato immediatamente per l'analisi dd-PCR.</li>
</ol>4. Flusso di lavoro Digital droplet PCR (dd-PCR)
NOTA: Il flusso di lavoro della dd-PCR prevede più fasi, a partire dalla preparazione del campione, seguita dalla generazione di goccioline, dall'amplificazione PCR, dal conteggio delle gocce e dall'analisi dei dati. Ogni fase è cruciale per la generazione accurata dei dati in quanto la dd-PCR comporta la quantificazione assoluta dei prodotti e non richiede alcuna curva standard. Quindi, ciascuna delle diverse fasi della dd-PCR è stata descritta di seguito.
<ol><li>Preparazione della reazione dd-PCR.<ol><li>Impostare la reazione PCR di 22 μL in provette o strisce PCR da 0,2 mL insieme a un tubo di controllo negativo e tubi NTC (non-template control). NOTA: Ogni diversa coppia di primer divergenti per la rilevazione di diversi circRNA deve avere una reazione NTC insieme a campioni di prova.</li>
		<li>Aggiungere 11 μL di miscela master dd-PCR (ad es. EvaGreen Supermix) e 11 μL di acqua priva di nucleasi per impostare il tubo di reazione di controllo negativo. NOTA: Scongelare la miscela master dd-PCR a temperatura ambiente seguita da un breve vortice per ottenere una miscela omogenea. Utilizzare la stessa acqua priva di nucleasi per impostare il tubo di reazione di controllo negativo e i tubi NTC utilizzati per diluire il cDNA.</li>
		<li>Aggiungere 11 μL di med-master mix dd-PCR, 5,5 μL di primer forward e reverse primer specifici per circRNA con concentrazione di 1 μM e 5,5 μL di acqua priva di nucleasi per impostare i tubi di reazione NTC. NOTA: Diluire i primer divergenti circolari RNA-specifici diretti e inversi di 100 μM e miscelare per preparare una concentrazione di lavoro di 1 μM di miscela di primer circRNA diretta e inversa; quindi, la concentrazione finale del primer è 250 nM nella reazione da 22 μL.</li>
		<li>Aggiungere 11 μL di med-master dd-PCR, 5,5 μL di primer forward e reverse primer specifici per circRNA con concentrazione di 1 μM e 5,5 μL di cDNA (2 ng/μL) per impostare le provette di reazione.</li>
		<li>Vortex accuratamente seguito centrifugando brevemente tutti i tubi di reazione per ottenere una miscela di reazione omogenea sul fondo dei tubi.</li>
	</ol></li>
	<li>Generazione di goccioline.<ol><li>Trasferire i 20 μL di miscela PCR da provette PCR da 0,2 mL ai pozzetti del campione della cartuccia del generatore di gocce.</li>
		<li>Aggiungere 70 μL di olio per la generazione di goccioline ai pozzetti dell'olio della cartuccia del generatore di gocce con attenzione utilizzando una pipetta multicanale. NOTA: Incubare l'olio di generazione di goccioline a temperatura ambiente per 15 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Coprire la cartuccia del generatore di gocce con la guarnizione in gomma e posizionarla nella macchina del generatore di gocce per ottenere la miscela di gocce di olio campione, generata nei pozzetti delle gocce della cartuccia.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificazione PCR.<ol><li>Trasferire 40 μL della miscela di gocce di olio campione dai pozzetti delle gocce della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. NOTA: trasferire con attenzione la miscela di gocce di olio campione mentre si fa un angolo verso i pozzetti attraverso le punte della pipetta multicanale per evitare di rompere le goccioline durante il trasferimento sulla piastra dd-PCR a 96 pozzetti.</li>
		<li>Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti con il sigillante a fogli di alluminio, posizionarla nel blocco macchina sigillante preriscaldato a 80 °C e fare clic sul sigillo per sigillare la piastra PCR.</li>
		<li>Ora, posizionare la piastra nel termociclatore dd-PCR e impostare il programma come indicato nella Tabella 2 con la temperatura del coperchio impostata a 105 °C e una velocità di rampa di 2 °C/s.</li>
	</ol></li>
	<li>Conteggio delle goccioline.<ol><li>Una volta terminata la PCR, posizionare la piastra sulla macchina contagocce dd-PCR con il supporto della piastra nella posizione corretta per il conteggio delle goccioline.</li>
		<li>Aprire il software di analisi delle gocce e impostare l'esecuzione fornendo input per le informazioni di esempio.</li>
		<li>Fare clic sull'opzione di configurazione. Quindi, fai clic sull'opzione del modello per aprire un nuovo modello.</li>
		<li>Definisci ogni pozzetto inserendo i dettagli dell'esperimento, come il nome del campione (cDNA usato o controllo negativo o NTC), il nome del bersaglio (nome del primer circRNA) e il tipo (sconosciuto) e il tipo di esperimento come ABS (quantificazione assoluta) e Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) utilizzati, ecc.</li>
		<li>Infine, salva il modello e avvia la corsa facendo clic sull'opzione di esecuzione e seleziona il conteggio per riga o colonna. Consentire alla macchina di completare il conteggio delle gocce, che richiede circa 1 minuto / pozzetto.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Analizza per analizzare i dati dopo il completamento della lettura del droplet.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Ampiezza 1D per visualizzare le goccioline positive e negative</li>
		<li>Per separare le goccioline positive dalle goccioline negative, inserire una linea di soglia comune per tutti i campioni con lo stesso target. NOTA: Le goccioline totali in ciascun campione devono essere superiori a 10.000 per essere considerate per la quantificazione assoluta. Il NTC non dovrebbe mostrare conteggi di goccioline positivi. La presenza di goccioline positive nel NTC indica la contaminazione dei reagenti o l'amplificazione dei dimeri di primer. È difficile scoprire se le goccioline positive hanno dimeri primer o prodotti non specifici in NTC. Si consiglia di controllare i primer ed evitare qualsiasi contaminazione dei reagenti come pratica generale per qualsiasi PCR incluso dd-PCR.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Esporta per esportare i dati del conteggio circRNA come file .csv. I dati esportati mostrano il numero di circRNA presenti in ciascun campione.</li>
		<li>Calcolare manualmente il numero di circRNA in ciascun campione per nanogrammo di RNA considerando la quantità totale di cDNA utilizzata in ciascuna reazione.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

La ricerca sul CircRNA è cresciuta nell'ultimo decennio con la scoperta di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento. Di conseguenza, è stata considerata una potenziale molecola per le future terapie a RNA. Inoltre, è noto per agire come biomarcatore in diverse malattie, tra cui il cancro e le malattie cardiovascolari 4,8. Tuttavia, l'identificazione del circRNA è difficile a causa della sua bassa abbondanza e ha solo una specifica sequenza di giunzione bac...

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento dell'RNA e nuovi algoritmi computazionali hanno scoperto un nuovo membro della crescente famiglia di RNA non codificanti, chiamato RNA circolare (circRNA)1. Come suggerisce il nome, i circRNA sono una famiglia di molecole di RNA a singolo filamento senza estremità libere. Sono formati da splicing testa-coda non canonico chiamato back-splicing, in cui il sito accettore di giunzione a monte si unisce covalentemente con il sito donatore di giunzione a valle per formare un cerchio stabile di RNA 1,2. Questo processo potrebbe essere mediato da diversi fattori, tra cui elementi ripetitivi invertiti di Alu presenti a monte e a valle degli esoni circolarizzati o può essere mediato da alcuni fattori di splicing o proteine leganti l'RNA (RBP)2,3. Gli RNA circolari generati esclusivamente dalla sequenza esonica o intronica sono classificati come circRNA esonico e RNA intronici circolari o ci-RNA, mentre alcuni circRNA esonici trattengono l'introne e sono chiamati circRNA esone-introne (EIcircRNAs)3,4. Le funzioni dei circRNA sono molteplici, tra cui la spugnatura di miRNA e/o RBP, la regolazione della trascrizione e la regolazione della funzione cellulare traducendo in peptidi 3,5,6,7. Diversi rapporti hanno evidenziato il significato dei circRNA in varie malattie e processi fisiologici8. Inoltre, i modelli di espressione tessuto-specifici e la resistenza alla digestione esonucleasica lo rendono un biomarcatore funzionale per la diagnosi della malattia e può anche essere utilizzato come bersaglio terapeutico adatto8. Considerando la sua importanza nella regolazione della salute e delle malattie, la quantificazione accurata dell'espressione del circRNA è la necessità del momento.
Sono stati sviluppati diversi metodi biochimici per quantificare i circRNA in campioni biologici9. Uno dei metodi più convenienti e ampiamente accettati per la quantificazione del circRNA è la trascrizione inversa seguita dalla reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) utilizzando coppie di primer divergenti10. Tuttavia, la maggior parte dei circRNA sono in bassa abbondanza rispetto agli mRNA lineari, il che rende difficile quantificarli11. Per superare questo problema, abbiamo cercato di utilizzare la PCR digitale a goccia (dd-PCR) per quantificare accuratamente il numero di circRNA in un determinato campione. La dd-PCR è una tecnologia PCR avanzata che segue il principio della microfluidica; genera più goccioline acquose nell'olio e la PCR si verifica in ogni goccia come reazione individuale12. La reazione avviene nelle singole goccioline e viene analizzata utilizzando un lettore di goccioline, che fornisce il numero di goccioline positive o negative per il gene di interesse12. È la tecnica più sensibile per quantificare con precisione un gene di interesse, anche se c'è solo una singola copia in un dato campione. La diminuzione della sensibilità verso gli inibitori, la migliore precisione e l'omissione del gene di riferimento per la quantificazione lo rendono più vantaggioso rispetto alla qPCR convenzionale13,14,15. È stato ampiamente utilizzato come strumento di ricerca e diagnostica per la quantificazione assoluta di un gene di interesse16,17. Qui, descriviamo il protocollo dd-PCR dettagliato per la quantificazione del circRNA nella differenziazione dei miotubi C2C12 di topo e dei mioblasti C2C12 di topo proliferanti utilizzando primer divergenti.

<table><tbody><tr><td>Provetta microcentifuga da 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>Strisce per provette da 0,2 ml con tappo</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Puntali filtranti</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata senza DNasi/RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cell raschiatore</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>Diluente DNA</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Primer casuali</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi murina</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima reverse trascrittasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>Olio per generazione di gocce per Evagreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, lamina, perforabile</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartucce e guarnizioni</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 supporto</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Generatore di gocce</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Piastre a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Sigillante per piastre PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler con 96&ndash; Modulo di reazione per pozzi profondi</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di gocce QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Software Quantasoft</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di silice</td><td>Umbrella Life Science</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

quantificazione di rna circolari mediante digital droplet pcr

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

La reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (dd-PCR) è uno dei metodi di quantificazione più sensibili; fraziona la reazione in quasi 20.000 goccioline d'acqua in olio e la PCR si verifica nelle singole goccioline. La dd-PCR presenta diversi vantaggi rispetto alla qPCR convenzionale in tempo reale, tra cui una maggiore precisione nel rilevare bersagli a bassa abbondanza, omettendo geni di riferimento per la quantificazione, eliminando le repliche tecniche per i campioni e mostrando un'elevata resilienza agli inibitori nei campioni. Recentemente, la dd-PCR è diventata uno dei metodi più popolari per quantificare accuratamente il DNA o l'RNA bersaglio per l'analisi e la diagnostica dell'espressione genica. Gli RNA circolari (circRNA) sono una grande famiglia di molecole di RNA recentemente scoperte covalentemente chiuse prive di estremità 5' e 3'. È stato dimostrato che regolano l'espressione genica agendo come spugne per le proteine leganti l'RNA e i microRNA. Inoltre, i circRNA sono secreti nei fluidi corporei e la loro resistenza alle esonucleasi li rende utili come biomarcatori per la diagnosi della malattia. Questo articolo ha lo scopo di mostrare come eseguire la progettazione di primer divergenti, l'estrazione dell'RNA, la sintesi del cDNA e l'analisi dd-PCR per quantificare accuratamente specifici livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule. In conclusione, dimostriamo la quantificazione precisa dei circRNA utilizzando dd-PCR.

Il numero assoluto di circRNA in ciascun campione può essere derivato dai dati dd-PCR esportati. L'analisi PCR quantitativa in tempo reale ha suggerito l'espressione differenziale di circBnc2 nei miotubi C2C12 differenziati (dati non mostrati). Qui, abbiamo voluto verificare il numero assoluto di copie di circBnc2 nei mioblasti e nei miotubi C2C12 proliferanti. Poiché l'espressione di circBnc2 viene confrontata in due condizioni, è molto importante elaborare tutti i campioni per l'isolamento de...

Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.

Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR è un metodo altamente sensibile e accurato per la quantificazione assoluta del DNA o RNA bersaglio. È stato utilizzato per la diagnosi di malattie in cui altri metodi convenzionali non riescono a dare risultati accurati. dd-PCR è la tecnica più sensibile per rilevare molecole di acido nucleico molto basse e abbondanti.A differenza della PCR quantitativa, la dd-PCR non richiede alcun controllo genico per la quantificazione. Grazie alla sua sensibilità e accuratezza, la dd-PCR può essere utilizzata come strumento per la diagnostica molecolare e la ricerca che coinvolge molecole di RNA a bassa abbondanza come micro RNA e RNA circolari. Prima di utilizzare dd-PCR, si dovrebbe eseguire RT-PCR o RT-qPCR per confermare che i primer stanno amplificando i loro geni bersaglio senza alcuna amplificazione PCR non specifica.Per iniziare, preparare una sequenza modello di PCR di 200 nucleotidi di lunghezza unendo gli ultimi 100 nucleotidi della lunghezza totale della sequenza di RNA circolare ai primi 100 nucleotidi della sequenza di RNA circolare. Utilizzare la sequenza di modelli per primer, progettata dallo strumento web Primer 3. Prendi un piatto di 10 centimetri contenente circa 5 milioni di cellule di mioblasti C2C12 proliferanti e un miotubo C2C12 differenziato di quattro giorni per l'isolamento dell'RNA.Lavare le celle con 10 millilitri di 1X PBS tre volte e scartare il PBS usando una pipetta. Aggiungere un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA e lisare le cellule mediante pipettaggio vigoroso. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e vortice per 15 secondi.Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 12.000 G.Prendere 400 microlitri dello strato acquoso superiore, caricarlo su una colonna di silice e centrifugare per un minuto a 12.000 G a temperatura ambiente. Prendi il flusso attraverso un nuovo tubo e aggiungi 600 microlitri di etanolo al 100%. Aggiungere 20 microlitri di perle di silice magnetica e posizionare il tubo su un termomixer, impostato a 25 gradi Celsius e 1.200 RPM per cinque minuti.Quindi, posizionare il tubo su un supporto magnetico per 30 secondi o fino a quando la soluzione diventa chiara. Risospendere le sfere di silice magnetica in 500 microlitri di tampone di lavaggio contenente il 90% di etanolo. Dopo aver posizionato il tubo sul supporto magnetico per 30 secondi, lasciare che le perline si depositino verso il magnete e scartare il tampone usando una pipetta.Asciugare all'aria il tubo a 50 gradi Celsius per tre minuti su un termomiscelatore, mantenendo il coperchio aperto. Aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi e risospendere le perle. Raccogliere l'RNA disciolto in una nuova provetta per la valutazione della quantità e della qualità utilizzando uno spettrofotometro.Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e prendere un microgrammo di RNA per la sintesi del cDNA. Mescolare un microgrammo di RNA totale con un microlitro di miscela dNTP, quattro microlitri di tampone 5X di trascrittasi inversa, due microlitri di primer casuale 10X trascrittasi inversa, 0,25 microlitri di enzima trascrittasi inversa e 0,5 microlitri di inibitore della RNasi. Portare il volume a 20 microlitri utilizzando acqua priva di nucleasi.Posizionare il tubo a 25 gradi Celsius per 10 minuti, seguito da 50 gradi Celsius per un'ora. Quindi posizionare il tubo a 85 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare l'enzima. Impostare la reazione PCR di 22 microlitri in provette o strisce PCR da 0,2 millilitri, insieme a un tubo di controllo negativo e tubi di controllo non modello.Aggiungere 11 microlitri di miscela master dd-PCR, 5,5 microlitri di miscela di primer circolare RNA-specifica per avanti e inverso di una concentrazione micromolare e 5,5 microlitri di acqua priva di nucleasi per impostare i tubi di reazione NTC. Allo stesso modo, per impostare le provette di reazione, aggiungere 11 microlitri di miscela master dd-PCR, 5,5 microlitri di miscela di primer circolare specifica per RNA diretta e inversa di una concentrazione micromolare e 5,5 microlitri di cDNA. Per la generazione di gocce, trasferire 20 microlitri della miscela PCR da provette PCR da 0,2 millilitri ai pozzetti del campione della cartuccia del generatore di gocce.Aggiungere 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline ai pozzetti dell'olio della cartuccia del generatore di goccioline con attenzione, utilizzando una pipetta. Coprire la cartuccia del generatore di gocce con una guarnizione di gomma e posizionarla nella macchina del generatore di gocce per ottenere la miscela di gocce d'olio campione, generata nei pozzetti delle gocce della cartuccia. Per l'amplificazione PCR, trasferire 40 microlitri della miscela di gocce d'olio campione dai pozzetti delle goccioline della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta.Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti con il sigillante in alluminio. Posizionarlo nel blocco macchina sigillatrice a piastre, preriscaldato a 180 gradi Celsius, e fare clic sul sigillo per sigillare la piastra PCR. Quindi, posizionare la piastra nel termociclatore dd-PCR e impostare la temperatura del coperchio su 105 gradi Celsius e una velocità di rampa su due gradi Celsius al secondo.Una volta terminata la PCR, posizionare la piastra sulla macchina contagocce dd-PCR con il supporto della piastra nella posizione corretta per il conteggio delle goccioline. Aprire il software di analisi delle gocce e impostare l'esecuzione fornendo l'input delle informazioni di esempio. Fare clic sul pulsante Analizza per analizzare i dati dopo il completamento della lettura del droplet.Quindi, fai clic sul pulsante Ampiezza 1D per visualizzare le goccioline positive e negative. Per separare le goccioline positive dalle goccioline negative, inserire una linea di soglia comune per tutti i campioni con lo stesso target. Fare clic sul pulsante di esportazione per esportare i dati circolari RNA conteggia come file csv.I dati esportati mostrano il numero di RNA circolari presenti in ciascun campione. Calcolare manualmente il numero di RNA circolari in ciascun campione per nanogrammo di RNA considerando la quantità totale di cDNA utilizzata in ciascuna reazione. L'analisi dei dati con il software QuantaSoft è mostrata qui.Tutti i campioni tranne MT1 hanno mostrato più di 12.000 conteggi di goccioline. Poiché il conteggio totale delle goccioline era basso in MT1, questo campione non è stato considerato per l'analisi finale dei dati. È interessante notare che c'era una chiara differenza nel modello di espressione di Circ B e C2 nella condizione differenziata del miotubo a quattro giorni rispetto alle cellule dei mioblasti.L'analisi dell'abbondanza di Circ B e C2 in termini di numero di copie, ha indicato che le tre repliche dei mioblasti C2C12 avevano 76,8, 67 e 46 copie per nanogrammo di RNA, mentre i due campioni di miotubo avevano 558 e 610 copie per nanogrammo di RNA. I dati nel grafico a barre rappresentano la deviazione standard media più meno di due o tre repliche biologiche. ddPCR è uno dei metodi più avanzati per misurare l'accurata espressione differenziale dell'RNA circolare bersaglio.Questo metodo sarà uno strumento essenziale per accelerare la ricerca sull'RNA circolare e le industrie diagnostiche nel prossimo anno.

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In questo video, presentiamo una procedura passo-passo per generare nano-goccioline emulsionate per rilevare gli acidi nucleici bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi digitale o dPCR.

Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline: un metodo per generare reazioni di PCR con nanogocce per rilevare rare mutazioni tumorali

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Viene descritto un metodo sensibile e accurato per la quantificazione di microRNA privi di cellule utilizzando una chimica basata su coloranti e una tecnologia PCR digitale a goccioline.

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MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l'estrazione di miRNA, trascrizione d'inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.

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Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

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La quantificazione precisa delle copie del genoma del vettore del virus adeno-associato (AAV) è fondamentale, ma un protocollo standardizzato deve ancora essere stabilito. Questo protocollo descrive un metodo convalidato per la preparazione di campioni di AAV purificati e per l'esecuzione di una reazione a catena della polimerasi (dd_PCR) digitale per quantificare in modo affidabile il titolo del genoma virale.

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