Name: Creazione di un modello di ratto silicosi attraverso lesposizione di tutto il corpo alla silice respirabile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Scopri come creare un modello di silicosi nel ratto mediante esposizione inalatoria a silice respirabile. Questo metodo riproduce fedelmente la patologia umana con elevata ripetibilità e costi contenuti, supportando la ricerca su diagnosi precoce e terapie.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (82003406), dalla Natural Science Foundation of Hebei Province (H2022209073) e dal Science and Technology Project del Dipartimento dell'Educazione dell'Hebei (ZD2022127).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvati dal Comitato per l'etica della North China University of Science and Technology (codice protocollo LX2019033 e 2019-3-3 di approvazione). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi, di 3 settimane di età. Tutti i ratti sono stati tenuti in gabbie statiche con trucioli di legno. Gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore e sono stati forniti di cibo e acqua ad libitum. Gli esperimenti di follow-up sono stati condotti dopo 1 settimana di alimentazione adattativa.
1. Preparazione dell'animale
<ol><li>All'arrivo, alloggia tutti i ratti in una stanza specifica priva di agenti patogeni (SPF).</li>
	<li>Dividi in modo casuale i ratti sani in due gruppi (n = 10): ratti di controllo che inalano aria pura e ratti con silicosi che inalano silice.</li>
</ol>2. Preparazione della silice
ATTENZIONE: La polvere di silice inalata dal corpo umano può danneggiare i polmoni. Pertanto, le persone devono indossare tute, guanti medici e maschere protettive (N95) durante le operazioni.
<ol><li>Macinare le particelle di silice (vedi Tabella dei materiali) con una malta d'agata per 1,5 ore prima di ogni esposizione. Questo perché il quarzo appena fratturato produce maggiori quantità di specie di ossigeno attivo rispetto al quarzoinvecchiato 13 e la silice con un diametro di 1-5 μm è la più patogeno.</li>
	<li>Pesare la silice (30 g) utilizzando una bilancia elettronica dopo la macinazione, metterla in un contenitore di vetro e cuocerla a 180 °C per 6 ore in un essiccatore elettrico a riscaldamento (vedi Tabella dei materiali) per eliminare gli agenti patogeni dalla superficie delle particelle di silice.</li>
</ol>3. Esposizione alla silice per i ratti
<ol><li>Collegare l'iniezione e i sistemi di generazione disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) e inserire la silice (30 g) nel generatore. Controllare se la tubazione di connessione è normale, il cavo di alimentazione è collegato e l'alimentazione è normale.<ol><li>Controllare manualmente il livello dell'acqua della torre di spruzzatura e dell'umidificatore del dispositivo di trattamento dei gas di scarico (vedi Tabella dei materiali) e aggiungere acqua se è insufficiente (non fino alla linea standard).</li>
		<li>Aggiungere acqua di rubinetto alla torre di spruzzatura del dispositivo di trattamento dei gas di scarico e acqua distillata all'umidificatore (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Accendere il dispositivo di scarico dei gas di scarico (vedere la tabella dei materiali) e l'interruttore della fonte d'aria per verificare se l'interno dell'armadio di schermatura è in uno stato di pressione negativa.<ol><li>Verificare che la miscelazione di liquidi, polveri, valvole di controllo del flusso di gas puro e valvola di scarico delle acque reflue sotto la camera di inalazione siano chiuse.</li>
	</ol></li>
	<li>Mettere un totale di 10 ratti nella camera di inalazione (vedere la tabella dei materiali) e chiudere lo scomparto di inalazione e le porte dell'armadio schermate.</li>
	<li>Impostare i seguenti parametri sperimentali sul quadro strumenti o nel computer: pressione dell'armadio: da -50 a -30 Pa; concentrazione di ossigeno: 21%; temperatura dell'armadio: 26-30 °C; umidità: 30%-70%; velocità di ingresso della polvere: 2,0-2,5 mL/min; e concentrazione di polvere dell'armadio: 60 ± 5 mg/m3. NOTA: Osservare continuamente i dati sperimentali e lo stato dell'apparecchiatura durante l'esperimento. L'allarme di guasto dell'apparecchiatura ha richiesto un'elaborazione tempestiva.<ol><li>Esporre ogni animale alla silice continuamente per 3 ore al giorno, 5 giorni alla settimana, e consentire agli animali del gruppo di controllo di inalare aria pura.</li>
	</ol></li>
	<li>Al termine dell'esperimento, chiudere la valvola di controllo del flusso di gas miscelato e aprire la valvola di flusso del gas puro. Iniettare continuamente il gas puro nella camera di inalazione. NOTA: Nel presente studio, il flusso di gas puro (7,0-7,5 m3/h) è stato iniettato per almeno 20 minuti fino a quando il gas velenoso nella camera di inalazione è stato completamente sostituito.<ol><li>Chiudere la valvola del flusso d'aria pura, aprire la porta, far uscire i ratti e rimandarli nella stanza priva di agenti patogeni.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere la rastrelliera per topi e i componenti del tubo di derivazione in sequenza e posizionarli nel lavandino per la pulizia. Dopo il risciacquo, chiudere la valvola di pulizia automatica e aprire il portello.<ol><li>Pulisci la parete interna con un panno pulito o accendi il gas puro per asciugare il serbatoio. Infine, effettuare la disinfezione. Dopo la pulizia e la disinfezione con etanolo al 75%, chiudere la saracinesca di scarico e, appena possibile, aprire leggermente la porta della cabina di inalazione per far evaporare l'umidità, in modo che l'interno della cabina di inalazione rimanga asciutto.</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare la concentrazione di silice nell'armadio con un campionatore atmosferico completo seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali) due volte alla settimana per garantire la stabilità della concentrazione di silice durante l'esperimento. Calibrare il campionatore atmosferico prima del campionamento.<ol><li>Per la determinazione gravimetrica è possibile utilizzare una bilancia analitica digitale a piatto singolo. La concentrazione di silice calcolata è stata di 65 mg/m3 (Figura 1 e Tabella 1). NOTA: Pesare la carta da filtro prima e dopo l'assorbimento della silice. La concentrazione di silice è stata calcolata utilizzando la seguente formula12: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64467/64467eq01.jpg" style="margin: auto;"> dove W2 = peso della carta da filtro dopo il campionamento, W1 = peso della carta da filtro prima del campionamento e V = volume dell'aria.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Acquisizione e fissazione dei tessuti polmonari
<ol><li>Sopprimere i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg/kg di peso corporeo) e lidocaina (4 mg/kg di peso corporeo). Valutare la morte per perdita del battito cardiaco14.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, fissare il polmone inferiore destro, il rene, il fegato, la milza e l'osso con paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore, incorporare in paraffina e tagliare in sezionida 5 μm 7,15.</li>
</ol>5. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&amp;E)
<ol><li>Deparaffinizzare le sezioni di paraffina nello xilolo (vedere Tabella dei materiali) due volte per 10 minuti ogni16 e reidratare in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata per 3 minuti ciascuna.</li>
	<li>Colorare le sezioni con ematossilina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti, quindi lavare le sezioni con acqua10.</li>
	<li>Mettere le sezioni in alcool cloridrico al 2% e poi in acqua distillata fino a quando il colore non cambia in blu.</li>
	<li>Colorare le sezioni con eosina per 1 minuto, disidratarle con etanolo al 95%, renderle trasparenti con xilene, sigillarle con gomma neutra e osservare al microscopio ottico12.</li>
</ol>6. Colorazione immunoistochimica
<ol><li>Lavare regolarmente le sezioni di paraffina con acqua.</li>
	<li>Esporre gli antigeni ad alta pressione (60 kPa) e ad alta temperatura (100 °C) per 80 s e poi bloccare con un bloccante della perossidasi endogena (3%) per 15 min per eliminare le perossidasi endogene7.</li>
	<li>Incubare i campioni con anticorpi diretti contro CD68 (diluizione 1:200 - aggiungere 4 μL di CD68 a 396 μL di diluente anticorpale; vedere Tabella dei materiali) a 4 °C per una notte.</li>
	<li>Incubare i campioni con un anticorpo secondario (polimero IgG anti-topo di capra coniugato con HRP; vedere la tabella dei materiali) a 37 °C per 30 minuti, quindi lavare i campioni con 1x PBS.</li>
	<li>Visualizzare l'immunoreattività con la 3,3-diaminobenzidina (DAB; vedere la tabella dei materiali). Dopo aver applicato DAB sul tessuto, osservare la colorazione del tessuto al microscopio ottico10. NOTA: Il tempo di colorazione variava da pochi secondi a pochi minuti in base al tempo di colorazione del tessuto. La procedura di colorazione è stata interrotta mettendo le sezioni in acqua. In questo studio, la colorazione marrone del tessuto ha rappresentato l'espressione positiva di CD68. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in 1x PBS.</li>
</ol>

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<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+RAS+axis+alleviates+silicotic+fibrosis+and+Ang+II-induced+myofibroblast+differentiation+via+inhibition+of+the+hedgehog+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway.</a> Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica+perturbs+primary+cilia+and+causes+myofibroblast+differentiation+during+silicosis+by+reduction+of+the+KIF3A-repressor+GLI3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex.</a> Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+silicosis+alters+microRNA+expression+in+rat+lung+and+miR-411-3p+exerts+anti-fibrotic+effects+by+inhibiting+MRTF-A%2FSRF+signaling.+Molecular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy.</a> Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Essendo la principale causa di silicosi, la silice svolge un ruolo decisivo nello stampaggio. Le particelle di silice inalate dai pazienti con pneumoconiosi sono particelle di silice fresca e libera prodotte dal taglio meccanico. La silice può generare specie reattive dell'ossigeno direttamente sulle superfici delle particelle appena scisse o indirettamente attraverso il suo effetto sui macrofagi25. Pertanto, la macinazione delle particelle di silice è di grande importanza. Nel protocollo proposto...

La silicosi, causata dall'inalazione di silice, è la malattia professionale più grave in Cina, rappresentando oltre l'80% del numero totale di segnalazioni di malattie professionali ogni anno1. L'eziologia della silicosi è chiara e può essere prevenuta e controllata, ma non è disponibile un metodo di trattamento efficace2. Molti farmaci si sono dimostrati efficaci negli studi di base, ma hanno effetti clinici imprecisi 3,4. Pertanto, i meccanismi patologici e fisiologici della silicosi devono ancora essere esplorati.
Molti studi hanno utilizzato un'infusione una tantum di silice nella trachea di ratti o topi per studiare la patogenesi della silicosi 5,6. Sebbene questi modelli silicotici di roditori potessero essere ottenuti in breve tempo7, questi metodi presentavano ancora delle sfide, come traumi animali e un'elevata mortalità. Alcuni studi hanno coinvolto l'instillazione di silice immagazzinata nei polmoni per indurre una reazione polmonare non specifica, ma non hanno menzionato i noduli silicotici nei topi8. Inoltre, lontano dalla silicosi acuta, l'esposizione cronica alla silice negli ambienti di lavoro ha indotto un'infiammazione polmonare significativamente più bassa e ha elevato i livelli di marcatori anti-apoptotici, piuttosto che di marcatori pro-apoptotici, nei polmoni9. Pertanto, è necessario un modello animale affidabile, ragionevole e ripetibile per esplorare ulteriormente la patogenesi della silicosi.
Il presente studio descrive un metodo per imitare il processo patologico dei pazienti con silicosi attraverso l'inalazione di silice attraverso tutto il corpo, particelle erogate dall'aria in una camera di inalazione, che comprendeva un generatore di silice erogato dall'aria, una camera per tutto il corpo e un sistema di smaltimento dei rifiuti. Questo metodo è semplice, facile da usare e imita efficacemente il processo di evoluzione dinamica patologica della silicosi. Inoltre, molti possibili meccanismi e la patogenesi della silicosi sono identificati utilizzando questo metodo 10,11,12. Si prevede che il protocollo proposto aiuterà ulteriori indagini nel campo correlato della ricerca sulla silicosi.

<table><tbody><tr><td>Rilevatore d'aria (campionatore atmosferico compressivo)</td><td>Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo</td><td></td><td></td> <td>anatomico&nbsp; Non è consigliata alcuna marca specifica.</td></tr><tr><td>Anticorpo di CD68</td><td>Abcam</td><td>ab201340</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore elettrico a soffiaggio d'aria</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>OHRUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina per l'inclusione</td><td>leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di scarico dei gas di scarico &nbsp;</td><td>HOPE Industria e Commercio Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di generatori&nbsp;</td><td>HOPE Industria e Commercio Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti (guanti da laboratorio sottili)</td><td>Il secco medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina e eosina</td><td>BaSO Diagnostics Inc.</td><td>BA4025</td><td></td></tr><tr><td>HOPE MED 8050 apparecchio di controllo dell'esposizione</td><td>HOPE Industry and Trade Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di inalazione&nbsp;</td><td>HOPE Industria e Commercio Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td></td><td></td> per iniezione<td>&nbsp; Non è consigliata alcuna marca specifica.</td></tr><tr><td>Microscopio ottico&nbsp;</td><td>olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oggetto scivolo</td><td>shitai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV-6000 (HRP-coniugato capra anti-topo IgG polimero)</td><td>Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd</td><td>s5631</td><td></td></tr><tr><td>Biossido di silicio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice</td><td>leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di trattamento dei gas di scarico</td><td>HOPE Industry and Trade Co. Ltd. </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wet box</td><td>Cooperativa di prodotti in plastica Fabbrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

creazione di un modello di ratto silicosi attraverso l'esposizione di tutto il corpo alla silice respirabile

Establishing a Silicosis Rat Model via Exposure of Whole-Body to Respirable Silica

La causa principale della silicosi è l'inalazione di silice nell'ambiente di lavoro. Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, i modelli di roditori continuano ad essere uno strumento essenziale per lo studio della silicosi umana. Per la silicosi, il classico processo patologico deve essere inducibile attraverso l'inalazione di particelle di quarzo appena generate, il che significa indurre specificamente malattie professionali umane. Questo studio ha descritto una tecnica per stabilire e imitare efficacemente il processo di evoluzione dinamica patologica della silicosi. Inoltre, la tecnica ha avuto una buona ripetibilità senza alcun intervento chirurgico. Il sistema di esposizione per inalazione è stato fabbricato, convalidato e utilizzato per studi tossicologici sull'inalazione di particelle respirabili. I componenti critici erano i seguenti: (1) generatore di polveri SiO2 a secco sfuso regolato con un regolatore del flusso d'aria; (2) camera di esposizione per inalazione di 0,3 m3 per tutto il corpo in grado di ospitare fino a 3 ratti adulti; (3) un sistema di monitoraggio e controllo per regolare la concentrazione di ossigeno, la temperatura, l'umidità e la pressione in tempo reale; e (4) una barriera e un sistema di smaltimento dei rifiuti per proteggere i tecnici di laboratorio e l'ambiente. In sintesi, il presente protocollo riporta l'inalazione attraverso tutto il corpo e la camera di inalazione ha creato un modello silicotico di ratto affidabile, ragionevole e ripetibile con bassa mortalità, meno lesioni e più protezione.

Utilizzando il metodo proposto, sono stati esplorati alcuni potenziali meccanismi e la patogenesi della silicosi nei ratti. Lo schema della camera di inalazione è mostrato in Figura 1. La camera era costituita da un generatore di silice erogato ad aria, da una camera a corpo intero e da un sistema di smaltimento dei rifiuti, come descritto in precedenza17. Le funzioni polmonari, i livelli di fattori infiammatori nel siero e nel polmone, la deposizione di collagene e l...

Questo studio descrive una tecnica per stabilire un modello di ratto di silicosi con l'inalazione di silice attraverso tutto il corpo in una camera di inalazione. I ratti con silicosi potrebbero imitare da vicino il processo patologico della silicosi umana in modo semplice, economico e con una buona ripetibilità.

Creazione di un modello di ratto silicosi attraverso l'esposizione di tutto il corpo alla silice respirabile

The major cause of silicosis is the inhalation of silica in the occupational environment. Despite some anatomical and physiological differences, rodent ...

Utilizzando questo protocollo del modello di ratto di silicosi, è possibile imitare da vicino il processo patologico della silicosi umana. Questa tecnica è facile da eseguire in modo economico con una buona ripetibilità e non ci sono traumi per l'animale. Il modello di ratto stabilito in questo studio contribuisce all'identificazione precoce, alla diagnosi accurata e al trattamento della silicosi.Per iniziare, mettere le particelle di silice in una malta di agata e macinare per 1,5 ore prima di ogni esposizione animale. Quindi pesare 30 grammi di silice macinata in una bilancia elettronica e metterla in un contenitore di vetro. Cuocere a 180 gradi Celsius per sei ore in un essiccatore elettrico a soffiaggio d'aria per eliminare gli agenti patogeni dalla superficie delle particelle di silice.Configurare il regolatore dell'esposizione alla silice collegando i sistemi di iniezione e generatore. Quindi posizionare la silice pesata nel generatore e verificare che il collegamento della tubazione sia corretto. Il cavo di alimentazione è collegato e l'alimentazione è normale.Dopo essersi assicurati che le valvole della camera di inalazione siano chiuse, accendere il dispositivo di scarico

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La generazione di un modello di ratto ortotopico di pleurico mesotelioma maligno da impianto di II-45 cellule di mesotelioma nella cavità pleurica di topi immunocompetenti è presentato. Metodo citometria di flusso per analizzare sette sottoinsiemi di cellule immunitarie di questi animali da un campione di sangue di 25 ml è anche descritto.

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Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello di effusione pleurica in ratti mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice.

Un modello di effusione pleurica in ratti mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice

Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle per le prove di tossicità.

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello murino di silicosi attraverso l'esposizione ripetuta a sospensioni di silice tramite una flebo nasale. Questo modello può imitare in modo efficiente, conveniente e flessibile il processo patologico della silicosi umana con elevata ripetibilità ed economia.

Un modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione ripetuta di polvere di silice cristallina

Questo studio descrive un modello murino per studiare l'effetto sinergico della nicotina sulla progressione della fibrosi polmonare nei topi sperimentali affetti da silicosi. Il modello murino a doppia esposizione simula la progressione patologica nel polmone dopo l'esposizione simultanea a nicotina e silice. I metodi descritti sono semplici e altamente riproducibili.

Utilizzo della nicotina in un modello murino esposto alla silice per promuovere la transizione epitelio-mesenchimale polmonare

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Creazione di un modello di ratto silicosi attraverso l'esposizione di tutto il corpo alla silice respirabile

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