Name: Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Impara a creare modelli ortotopici di glioblastoma mediante iniezione intracranica di cellule GEM in topi immunocompetenti. Questo metodo riproduce le caratteristiche invasive del tumore umano per valutare nuove terapie.

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Siamo grati al signor Alan E. Kulaga per l'eccellente assistenza tecnica e alla signora Michelle L. Gumprecht per aver perfezionato le tecniche chirurgiche. Ringraziamo il Dr. Philip L. Martin per l'analisi patologica e la signora Lilia Ileva e il Dr. Joseph Kalen del Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program per le scansioni MRI.
Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali dal National Cancer Institute, National Institutes of Health, con contratto n. HHSN261201500003I. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della salute e dei servizi umani, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

Il protocollo di studio qui descritto è stato approvato dal NCI presso il Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick è accreditato da AAALAC International e segue la politica del servizio sanitario pubblico per la cura e l'uso di animali da laboratorio. La cura degli animali è stata fornita secondo le procedure delineate nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Preparazione delle cellule per l'iniezione
NOTA: Le cellule primarie del tumore cerebrale di topo (MBR) utilizzate per questo modello sono state originariamente isolate da topi TRP GEM indotti da tamoxifene, come descritto in El Meskini et al.5. I dettagli sulla preparazione delle cellule possono essere trovati in questo riferimento.
<ol><li>Eseguire i seguenti passaggi utilizzando la tecnica sterile in un armadio di biosicurezza.</li>
	<li>Coltura di cellule tumorali cerebrali primarie in vitro fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in tripsina allo 0,25% e, una volta che si sono staccate, diluirle con terreno di crescita per inattivare la tripsina.</li>
	<li>Pellettare le celle mediante centrifugazione a 400 x g e lavare con mezzi senza siero. Ripeti una volta prima di contare.</li>
	<li>Contare le celle manualmente o con un contatore automatico delle celle. Risospendere le cellule in metilcellulosa sterile al 5% in 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) alla concentrazione desiderata, sulla base di un volume di iniezione finale di 2 μL. La concentrazione cellulare desiderata può variare in base alla linea cellulare e al modello di tumore cerebrale. Per le celle GBM GEM TRP, iniettiamo 2 μL di una soluzione 25 x 106 cellule/ml o 50.000 cellule.</li>
</ol>2. Ceppo di topo
<ol><li>Allevare o acquistare un ceppo di topo appropriato che corrisponda allo sfondo del ceppo delle cellule tumorali cerebrali. Per le cellule TRP, utilizzare topi B6D2F1 / J di 9 settimane (da un incrocio tra femmine C57BL / 6J [B6] e maschi DBA / 2J [D2]) come destinatari di cellule tumorali.</li>
</ol>3. Allestimento dell'area chirurgica
NOTA: Tutte le fasi chirurgiche sono condotte utilizzando la tecnica asettica in un ambiente pulito e igienizzato. Scrub e dispositivi di protezione individuale, compresa una maschera, devono essere indossati dal chirurgo. Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati a caldo prima dell'uso.
<ol><li>Posizionare i protettori della superficie sotto l'apparecchio stereotassico e sul piano di lavoro.</li>
	<li>Collegare il tubo in vinile dalla macchina per anestesia alla porta IN della piattaforma di anestesia gassosa dell'apparecchio stereotassico e un altro tubo alla porta OUT.</li>
	<li>Collegare il display digitale a una fonte di alimentazione e all'apparecchio.</li>
	<li>Collegare il controller della micropompa (Figura 1A) a una fonte di alimentazione e collegare la micropompa (Figura 1A) al braccio manipolatore dell'apparecchio (vedere anche le istruzioni del produttore).</li>
	<li>Impostare la micropompa su 5,6 nL/s per l'iniezione di volume di 2.000 nL.</li>
	<li>Accendere lo sterilizzatore a sfere calde.</li>
	<li>Collegare il termoforo del mouse al regolatore di temperatura e collegarlo a una fonte di alimentazione. Posiziona il piatto sulla piattaforma del palcoscenico. Impostare la temperatura della piastra a 37 °C.</li>
	<li>Caricare una siringa di precisione da 30 G, facendo attenzione a non introdurre bolle. Inserire lo stantuffo e inserire l'ago. Assicurarsi di afferrare l'ago solo dal mozzo. Premere lo stantuffo fino a quando una goccia della miscela di cellule di metilcellulosa eroga attraverso l'ago. Pulire l'ago con un tampone per la preparazione di alcol al 70% strofinando accuratamente i lati dell'ago o posizionando una garza sterile sul piano di lavoro e asciugandola. Fare attenzione a non piegare o rompere l'ago.</li>
	<li>Collegare la siringa di precisione alla micropompa e ruotare il braccio del manipolatore lontano dal palco, per evitare lo spostamento dell'ago della siringa prima di posizionare il mouse sul palco.</li>
</ol>4. Preparare il topo per la chirurgia
<ol><li>Anestetizzare il topo posizionandolo nella camera di induzione con il vaporizzatore isoflurano impostato al 2,5%, o secondo le linee guida istituzionali. Accendere il flusso di isoflurano al naso.</li>
	<li>Trasferire il mouse sull'apparecchio stereotassico e fissarlo al nosecone, con i denti superiori posizionati sul supporto del nosecone (Figura 1B, 9). Stringere la manopola sul naso per fissare (Figura 1B). Garantire un livello appropriato di anestesia eseguendo un pizzico del dito del piede per verificare il riflesso.<ol><li>Monitorare le orecchie, i piedi e le mucose per il colore (rosa) per garantire un'adeguata ossigenazione. Inoltre, monitorare la frequenza respiratoria (un aumento o una diminuzione potrebbe indicare la necessità di regolare i livelli di isoflurano).</li>
	</ol></li>
	<li>Inserire le barre auricolari (Figura 1B) in entrambe le orecchie e stringere la manopola per fissare la testa.</li>
	<li>Applicare un unguento per gli occhi per lubrificare gli occhi mentre il topo è sotto anestesia.</li>
	<li>Utilizzare una pinza curva per strappare i peli sulla testa del topo in un'area circa il 150% più grande dell'incisione pianificata, per garantire condizioni asettiche adeguate.</li>
	<li>Iniettare 0,5-1 mg/kg di buprenorfina SR analgesia per via sottocutanea o utilizzare un altro analgesico approvato dal protocollo.</li>
	<li>Posizionare la sonda rettale del topo per monitorare la temperatura interna e prevenire l'ipotermia dovuta all'anestesia. Mantenere la temperatura corporea del mouse tra 36,5 e 38,5 °C.</li>
	<li>Sanificare il campo chirurgico utilizzando cerchi verso l'esterno, alternando uno scrub chirurgico e l'etanolo tre volte.</li>
	<li>Usando una pinza per tirare la pelle tesa, praticare un'incisione di circa 1 cm con la lama di bisturi, iniziando tra gli occhi. Il bregma dovrebbe essere visibile attraverso l'incisione. NOTA: Per una corretta tecnica sterile, toccare il sito chirurgico solo con le punte degli strumenti sterilizzati e posizionare le punte degli strumenti solo su una superficie sterile (come l'interno di un pacco utensili in autoclave).</li>
	<li>Utilizzare l'estremità in legno dell'applicatore con punta in cotone per raschiare via il tessuto connettivo in eccesso e quindi l'estremità in cotone di un altro applicatore per asciugare.</li>
</ol>5. Iniezione cellulare
<ol><li>Riportare il braccio manipolatore con l'attacco della siringa sopra il mouse, serrando la manopola per fissarla. Utilizzare le manopole X e Y sul piano orizzontale per spostare il supporto della siringa sul bregma. Abbassare l'ago usando la manopola Z per confermare la posizione del bregma. Impostare la console di lettura digitale su zero.</li>
	<li>Utilizzare le manopole X e Y e la corrispondente lettura digitale per spostare l'ago nella posizione desiderata. Per la posizione della corteccia corticale, le coordinate appropriate sono 3 mm posteriormente, 2 mm lateralmente a destra al bregma e 2 mm di profondità dalla dura madre. Utilizzare la manopola Z per spostare l'ago sulla superficie del cranio.</li>
	<li>Forare un foro nel cranio usando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G attaccato. Posizionare la smussatura dell'ago verso la siringa e l'ago di precisione da 30 G e ruotare con attenzione il braccio manipolatore verso il lato. Usando il pollice e il dito, far rotolare l'ago avanti e indietro lentamente con una leggera pressione fino a quando la punta dell'ago perfora appena il cappuccio cranico.</li>
	<li>Utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponare il sangue lontano dal foro dell'ago. Riposizionare il braccio del manipolatore nella posizione appropriata con l'ago della siringa di precisione caricato sopra il foro. Allineare la punta dell'ago con il foro, utilizzando la manopola Z per abbassare l'ago fino alla durata del cervello e impostare la console di lettura digitale a zero.</li>
	<li>Utilizzando la manopola Z, abbassare l'ago di 1 mm, quindi attendere 1 minuto. Ripetere l'operazione fino a raggiungere la profondità desiderata (2 mm come indicato). NOTA: L'ago viene abbassato lentamente per evitare ulteriori danni al tessuto cerebrale circostante e al riflusso della soluzione cellulare.</li>
	<li>Avviare la micropompa, quindi monitorare per assicurarsi che la pompa si fermi quando sono stati iniettati 2 μL. Questo processo dovrebbe richiedere circa 6 minuti alla velocità indicata. Quindi, attendere 1 minuto prima di spostare l'ago.</li>
</ol>6. Rimozione dell'ago e chiusura della ferita
<ol><li>Sollevare l'ago di 1 mm e attendere 1 minuto. Ripetere fino a quando l'ago è completamente libero dal cranio.</li>
	<li>Se necessario, utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponare il sangue lontano dal sito di iniezione.</li>
	<li>Utilizzando l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone, prendere un piccolo pezzo di cera ossea (~ 1 mm) e modellarlo in un cono. Mettilo nell'apertura del cranio, spingendo la cera nel foro.</li>
	<li>Pinze termiche usando uno sterilizzatore di perline e usarle per sciogliere la cera rimanente sul cranio e levigarlo.</li>
	<li>Posizionare circa due gocce di soluzione di bupivacaina (anestetico) nell'incisione e utilizzare una pinza per tirare insieme i bordi della pelle.</li>
	<li>Tirare la pelle tesa e posizionare una o due clip per ferite per chiudere la pelle.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita su una piastra riscaldante in un'area priva di correnti d'aria e osservare attentamente il mouse. Consentire al topo di svegliarsi completamente dall'anestesia, riprendendo la normale attività, prima di riportarlo all'alloggio normale.</li>
	<li>Controllare quotidianamente il topo dopo la procedura chirurgica e somministrare la gestione del dolore, secondo le linee guida istituzionali.<ol><li>Se la buprenorfina SR (Fase 4.6) viene utilizzata per l'analgesia, la formula a rilascio prolungato dura 72 ore. Ripetere l'iniezione solo se è presente dolore o disagio visibile dopo 72 ore. Se eseguiti correttamente, i topi si riprendono bene dalle iniezioni intracraniche e non è necessaria un'ulteriore analgesia.</li>
		<li>Rimuovere le graffette 7-10 giorni dopo l'intervento.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitorare la crescita del tumore mediante imaging di animali vivi (MRI).<ol><li>Eutanasia dei topi quando vengono raggiunti endpoint umani (cioè, se l'animale perde il 20% del peso corporeo o diventa ipotermico).</li>
		<li>A causa della natura invasiva di questi tumori cerebrali, osservare i topi per sintomi neurologici, come andatura irregolare, paralisi parziale, rotazione o inclinazione della testa. Eutanasia di un topo se si osserva uno qualsiasi di questi segni clinici di crescita tumorale avanzata.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

I modelli preclinici sono essenziali per la valutazione di nuovi bersagli terapeutici e nuove strategie di trattamento nel GBM. I modelli murini geneticamente modificati per GBM hanno il vantaggio di insorgenza del tumore nel sito autoctono, ma spesso con una lunga latenza e una crescita tumorale imprevedibile13. I tumori del modello GEM mostrano una latenza di 4-5 mesi e la finestra temporale ideale per l'imaging, il reclutamento e il trattamento è variabile tra i singoli topi. Il modello ortotop...

Il glioblastoma (GBM; glioma di grado IV) è il tumore cerebrale più comune e maligno e le terapie attuali sono inefficaci, con una sopravvivenza mediana di 15 mesi1. Modelli preclinici affidabili e accurati che rappresentano le complesse vie di segnalazione coinvolte nella crescita e nella patogenesi del tumore cerebrale sono essenziali per accelerare i progressi nella valutazione di nuovi regimi terapeutici per GBM. I modelli murini in cui le linee cellulari di tumore cerebrale umano sono impiantate per via sottocutanea in topi immunocompromessi non riflettono l'ambiente immunitario nativo dei tumori cerebrali, né possono essere utilizzati per valutare la capacità delle terapie di attraversare la barriera emato-encefalica2. Idealmente, i modelli murini preclinici dovrebbero anche riprodurre fedelmente l'istopatologia GBM umana, incluso l'alto livello di invasività nel parenchima circostante3. Sebbene i modelli murini geneticamente modificati (GEM) sviluppino tumori nel contesto di un sistema immunitario intatto, sono spesso necessari schemi di allevamento complicati e i tumori possono svilupparsi lentamente e in modo incoerente4. I modelli di allotrapianto derivati da GEM sono più adatti per studi terapeutici preclinici, in cui sono necessarie grandi coorti di topi portatori di tumore in un lasso di tempo più breve.
In un precedente rapporto, abbiamo descritto un modello murino ortotopico GBM derivato direttamente dai tumori GEM. La tumorigenesi nel GEM è iniziata da eventi genetici in popolazioni cellulari (principalmente astrociti) che esprimono la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), che provocano la progressione verso GBM. Questi TRP GEM ospitano un transgene TgGZT121 (T), che esprime T121 dopo l'esposizione alla Cre ricombinasi guidata da GFAP. L'espressione della proteina T121 determina la soppressione dell'attività della proteina Rb (Rb1, p107 e p103). La co-espressione di un transgene Cre guidato da GFAP (GFAP-CreERT2) mira all'espressione degli astrociti adulti dopo induzione con tamoxifene. I topi TRP ospitano anche un Kras mutante Cre-dipendente (KrasG12D; R) allele, per rappresentare l'attivazione della via del recettore tirosin-chinasi, e sono eterozigoti per la perdita di Pten (P)5,6. Aberrazioni geniche concomitanti nelle reti del recettore tirosin-chinasi (RTK), PI3K e RB sono implicate nel 74% della patogenesi GBM7. Pertanto, le vie primarie di segnalazione alterate nel GBM umano sono rappresentate dalle mutazioni ingegnerizzate nei topi TRP, in particolare nei tumori GBM, in cui vengono attivati bersagli a valle condivisi di RTK5.
Il modello ortotopico singeneico derivato da GEM è stato convalidato come modello che riassume le caratteristiche dei tumori cerebrali umani, tra cui l'invasività e la presenza di biomarcatori di sottotipo, da utilizzare come piattaforma per valutare le terapie antitumorali mirate a percorsi aberranti nel GBM. Le cellule sono state coltivate da tumori raccolti dal cervello TRP e reimpiantate nel cervello di topi abbinati al ceppo, utilizzando apparecchiature stereotassiche per l'iniezione intracranica nella corteccia. Questo modello murino ortotopico preclinico ha sviluppato tumori GBM altamente cellulari, invasivi, pleomorfi con un alto tasso mitotico e mostravano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa, come osservato per GBM umano. I volumi e la crescita del tumore sono stati misurati mediante risonanza magnetica (MRI) in vivo .
In questo rapporto, descriviamo la tecnica ottimale per l'iniezione intracranica di cellule GBM primarie o linee cellulari nel cervello di topo wild-type, usando i tumori TRP come esempio. Lo stesso protocollo può essere adattato per topi immunocompromessi e altre linee cellulari GBM. Vengono forniti suggerimenti cruciali per evitare insidie comuni, come la preparazione non ottimale delle cellule o la perdita di cellule nel sito di iniezione, e per utilizzare correttamente l'apparecchiatura stereotassica per garantire la riproducibilità e l'affidabilità del modello. Per scopi traslazionali, convalidiamo il modello mediante rilevamento MRI della crescita del tumore cerebrale in animali vivi, caratterizzazione istologica e presentiamo un esempio di trattamento nei topi portatori di tumore.

<table><tbody><tr><td>5% di metilcellulosa in 1X PBS, siringa autoclavata</td><td>Millipore</td><td>Sigma M7027</td><td></td></tr><tr><td>1mL Tuberculin, punta scorrevole</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>6" Applicatori con punta in cotone</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma scenica regolabile</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 901</td><td></td></tr><tr><td>Punte barriera per aerosol</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-33</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol Sterile, grande - 2,5 x 3 pollici</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>B6D2&nbsp; ceppo di topo (C57Bl/6J x DBA/2J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Jax #10006</td><td></td></tr><tr><td>Cera ossea</td><td>Specialità chirurgiche</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaina 0,25%</td><td>Henry Schein</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>BuprenorphineSR</td><td>ZooPharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in vinile trasparente 1/8ID X 3/16OD</td><td>UDP</td><td>T10004001</td><td></td></tr><tr><td>CVS Lubrificante Unguento per gli occhi</td><td>CVS Farmacia</td><td>247881</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso, bisturi a lama #10</td><td>Miltex</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia a gas con collegamento all'ossigeno e scatola per anestesia</td><td>Somni Scientific</td><td>n/a</td><td>L'investigatore può utilizzare l'attrezzatura standard facility </td></tr><tr><td>Gas piattaforma per anestesia per topi</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 923-B</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graphpad</td><td>Prism&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 9&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; versione 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 30 g ago, &frac12; ", mozzo piccolo, punto pst 3</td><td>Hamilton</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton siringa di precisione da microlitro, 1701 RN, senza ago 10 & micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a cordone caldo con perline</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3 Contatore cellulare automatizzato</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol isopropilico</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>ITK_SNAP (Versione 36.X, 2011- presenta)</td><td>Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) presso l'Università della Pennsylvania e il Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) presso l'Università dello Utah</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOPF Strumento stereotassico per piccoli animali con console di lettura digitale</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 940</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo Masterflex, PVDF, dritto, riduttore per portagomma, 1/4" ID x 1/8" ID</td><td>Masterflex</td><td>HV-30616-16</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante per topi</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Sonda rettale per topo</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH RET-3-ISO</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry Protezioni per superfici</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>74000-00</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetta</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Scrub chirurgico allo iodio povidone</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip per ferite Reflex da 9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di rimozione per clip per ferite Reflex da 9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite Reflex da 9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Semken, curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td>Siringa per tubercolina <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>con ago da 25 g, punta scorrevole</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump 3 con controller Micro2T</td><td>World Precision Instruments</td><td>Modello UMP3T</td><td></td></tr></tbody></table>

modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

I modelli murini geneticamente modificati (GEM) per il glioblastoma multiforme umano (GBM) sono fondamentali per comprendere lo sviluppo e la progressione dei tumori cerebrali. A differenza dei tumori xenotrapianti, nei GEM, i tumori sorgono nel microambiente nativo in un topo immunocompetente. Tuttavia, l'uso di GEM GBM negli studi di trattamento preclinico è impegnativo a causa delle lunghe latenze tumorali, dell'eterogeneità nella frequenza delle neoplasie e dei tempi di sviluppo del tumore di grado avanzato. I topi indotti tramite iniezione ortotopica intracranica sono più trattabili per gli studi preclinici e mantengono le caratteristiche dei tumori GEM. Abbiamo generato un modello di tumore cerebrale ortotopico derivato da un modello GEM con aberrazioni Rb, Kras e p53 (TRP), che sviluppa tumori GBM che mostrano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa analoga al GBM umano. Le cellule derivate dai tumori GEM GBM vengono iniettate per via intracranica in topi riceventi wild-type, con ceppo abbinato e riproducono tumori di grado IV, bypassando così il lungo periodo di latenza tumorale nei topi GEM e consentendo la creazione di coorti ampie e riproducibili per studi preclinici. Le caratteristiche altamente proliferative, invasive e vascolari del modello TRP GEM per GBM sono ricapitolate nei tumori ortotopici e i marcatori istopatologici riflettono i sottogruppi di GBM umano. La crescita del tumore è monitorata da scansioni MRI seriali. A causa della natura invasiva dei tumori intracranici nei modelli immunocompetenti, seguire attentamente la procedura di iniezione qui descritta è essenziale per prevenire la crescita del tumore extracranico.

I topi iniettati con cellule tumorali cerebrali devono essere monitorati quotidianamente per segni di crescita tumorale come convulsioni, atassia o perdita di peso. La crescita del tumore cerebrale può anche essere monitorata mediante risonanza magnetica a intervalli regolari. Le scansioni MRI settimanali consentono la visualizzazione dell'aumento del carico tumorale all'interno del cervello e le misurazioni del volume del tumore (Figura 1C). In particolare, i tumori TRP mostrano una crescit...

Qui, descriviamo un modello murino ortotopico preclinico per GBM, stabilito mediante iniezione intracranica di cellule derivate da tumori modello murino geneticamente modificati. Questo modello mostra le caratteristiche della malattia del GBM umano. Per gli studi traslazionali, il tumore cerebrale del topo viene monitorato mediante risonanza magnetica in vivo e istopatologia.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Descriviamo la tecnica ottimale per l'iniezione intracranica di cellule di glioblastoma derivate da GEM in un cervello di topo immunocompetente con conseguenti tumori che ricapitolano le caratteristiche chiave del glioblastoma umano. Questa tecnica per l'iniezione ortotopica di cellule TRP derivate da GEM produce risultati altamente riproducibili, scalabili e coerenti per i tumori che hanno origine nella corteccia, pur mantenendo l'invasività dei tumori GEM. I tumori cerebrali del glioblastoma di topo mostrano una crescita aggressiva e invadono il parenchima cerebrale circostante.Pertanto, può essere utilizzato per valutare le terapie che possono sopprimere l'infiltrazione e la migrazione del tumore nei pazienti. Questo protocollo può essere personalizzato per altri modelli di tumore cerebrale, virus, terapie o adattato per l'iniezione in diverse regioni del cervello con le regolazioni delle coordinate stereotassiche. A dimostrare la procedura sarà Devon Atkinson, un ricercatore associato del mio laboratorio.Per iniziare, posizionare le protezioni superficiali sotto l'apparato stereotassico e sul piano di lavoro. Collegare il tubo in vinile dalla macchina per anestesia all'in-port della piattaforma di anestesia gassosa dell'apparato stereotassico e un altro tubo al suo out-port. Collegare il display digitale a una fonte di alimentazione e all'apparecchio.Quindi, collegare la micropompa al braccio manipolatore dell'apparecchio dopo aver collegato il controller della micropompa alla fonte di alimentazione. Impostare la micropompa su 5,6 nanolitri al secondo. Collegare il termoforo del mouse al regolatore di temperatura e a una fonte di alimentazione.Caricare una siringa di precisione calibro 30 con una miscela di cellule di metilcellulosa metilica evitando bolle. Dopo aver inserito lo stantuffo, collegare l'ago e premere lo stantuffo fino a quando la miscela di cellule caricata cade attraverso l'ago. Pulire l'ago con un tampone per la preparazione di alcol al 70%.Una volta che la siringa di precisione è collegata alla micropompa, ruotare il braccio del manipolatore lontano dal palco prima di posizionare il mouse per evitare lo spostamento dell'ago della siringa. Trasferire il mouse anestetizzato sullo strumento stereotassico e fissarlo al cono del naso posizionando i denti superiori sul supporto del cono nasale. Dopo aver stretto il cono del naso con una manopola, pizzicare un dito del piede per controllare i riflessi per garantire una corretta anestesia.Quindi inserire le barre auricolari e stringere la manopola per fissare la testa. Applicare unguento oculare per lubrificare gli occhi in condizioni anestetizzate. Iniettare buprenorfina SR analgesico per via sottocutanea e posizionare una sonda topo rettale per monitorare la temperatura interna.Sterilizzare il campo chirurgico utilizzando cerchi verso l'esterno, alternando uno scrub chirurgico e l'etanolo tre volte. Tirare la pelle tesa con una pinza e utilizzare una lama di bisturi per fare un'incisione lunga circa 1 centimetro tra gli occhi. Per l'iniezione cellulare, riportare il braccio manipolatore con la siringa collegata al mouse.Dopo aver serrato le manopole, spostare la siringa usando le manopole X e Y sul piano orizzontale e montarla sopra il bregma. Abbassare l'ago, utilizzando la manopola Z, per confermare la posizione del bregma e impostare la console di lettura digitale su zero. Quindi spostare l'ago nella posizione desiderata, come descritto nel manoscritto, utilizzando le manopole X e Y e la corrispondente lettura digitale, e utilizzare la manopola Z per spostare l'ago sulla superficie del cranio.Forare un buco nel cranio usando una siringa da 1 millilitro con un ago calibro 25 attaccato. Ruotare con attenzione il braccio del manipolatore verso il lato, posizionando la smussatura dell'ago verso la siringa di precisione calibro 30. Una volta che il braccio manipolatore con l'ago della siringa di precisione caricato è posizionato sopra il foro, allineare la punta dell'ago con il foro e utilizzare la manopola Z per abbassare l'ago nella dura del cervello.Dopo aver impostato la console di lettura digitale a zero, abbassare l'ago di 1 millimetro con la manopola Z e attendere un minuto. Una volta raggiunta la profondità di 2 millimetri, arrestare la micropompa e assicurarsi che la pompa si fermi quando sono stati iniettati 2 microlitri di sospensione cellulare. Per rimuovere l'ago dal cranio, sollevarlo di un millimetro e attendere un minuto.Per la chiusura della ferita, utilizzando l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone, prendere un pezzo di cera ossea e modellarlo in un cono. Dopo aver inserito la cera nell'apertura del cranio, spingerla nel foro. Utilizzare la pinza sterilizzata a perline per sciogliere la cera rimanente sul cranio.Una volta che diventa liscio, aggiungere due gocce di soluzione anestetica bupivacaina nell'incisione e tirare i bordi della pelle insieme, usando una pinza. Dopo aver tirato la pelle tesa, usando una o due clip per ferite, chiudere la pelle, posizionare il topo in una gabbia di recupero pulita su una piastra riscaldante in un'area priva di correnti d'aria e osservare attentamente il topo. Le scansioni MRI settimanali hanno mostrato un aumento del carico tumorale all'interno del cervello e misurazioni del volume del tumore.La misurazione del volume tumorale MRI ha rivelato una mancanza di soppressione della crescita tumorale anche dopo il trattamento con radiazioni e la sopravvivenza dei topi trattati non è aumentata. I tumori GBM nei modelli singeneici sembravano essere cresciuti in modo aggressivo e violare il cranio dall'endpoint terminale. Se si osserva una crescita extracranica all'imaging dopo l'impianto cellulare, ciò indica una perdita di cellule durante il processo di iniezione e si deve prestare maggiore attenzione durante il ritiro dell'ago per iniezione.L'istopatologia dei tumori ortotopici TRP GBM ha confermato la presenza di astrocitoma di grado 4, compresa la ricapitolazione delle caratteristiche distintive nei tumori come la pseudopalizzata e la necrosi. Essere precisi quando si imposta il punto zero al bregma per garantire la corretta iniezione cellulare. Abbassare e alzare l'ago nel cervello deve essere lento per prevenire traumi e riflusso.Dopo l'iniezione di cellule tumorali, le scansioni MRI settimanali possono essere utilizzate per determinare le dimensioni del tumore al basale prima di iniziare il trattamento e per visualizzare il cambiamento del carico tumorale all'interno del cervello.

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Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere l'utilizzo di un modello di glioblastoma ortotopico per gli studi di chemio-radioterapia. Questo articolo passare attraverso l'elaborazione delle cellule, l'impianto, e la radioterapia del mouse utilizzando un modello intracranica.

La radioterapia combinata in un modello di tumore ortotopico cervello di topo

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I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Qui descriviamo un protocollo efficiente e versatile per indurre, monitorare e analizzare nuovi glioblastomi (GBM) utilizzando DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonatali. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche isto-patologiche del GBM umano.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

GL261 le cellule di glioma forniscono un utile modello animale immunocompetente di glioblastoma. Gli obiettivi di questo protocollo sono dimostrare tecniche adeguate per il monitoraggio della crescita tumorale intracranica utilizzando l'imaging in bioluminescenza in vivo e verificare l'utilità delle cellule GL261 modificate con luciferasi per lo studio dell'immunologia tumorale e degli approcci immunoterapeutici per il trattamento del glioblastoma.

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

L'obiettivo di questo protocollo è fornire ai ricercatori una tecnica altamente riproducibile per le impianti intracraniche.

Impianto intracranico stereotassico di linee cellulari xenoinnestate derivate dal paziente con glioblastoma nei topi

Presentiamo un modello di migrazione del glioblastoma 3D utilizzando gliomasfere magnetiche derivate dal paziente generate da tumori appena diagnosticati e ricorrenti. Questa piattaforma consente la visualizzazione delle dinamiche migratorie specifiche del paziente e la valutazione dell'efficacia terapeutica. Il saggio può essere multiplexato dopo la migrazione per valutare la localizzazione e i modelli di espressione delle proteine.

Test riproducibile di migrazione del glioblastoma 3D con localizzazione sferoide mediata da nanoparticelle magnetiche in condizioni ipossiche

Impara a creare modelli ortotopici di glioblastoma mediante iniezione intracranica di cellule GEM in topi immunocompetenti. Questo metodo riproduce le caratteristiche invasive del tumore umano per valutare nuove terapie.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

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