Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

La citotossicità cellulare anticorpo-dipendente, o ADCC in breve, può essere mediata da cellule natural killer, che chiamiamo cellule NK, granulociti e macrofagi. Queste sono le cellule effettrici di ADCC. Se un anticorpo come trastuzumab, che prende di mira il recettore del fattore di crescita epidermico, HER2, si lega alle cellule tumorali, allora queste cellule effettrici usano i loro recettori FcyR per legare la regione FC costante degli anticorpi.

L'anticorpo collega le cellule tumorali e le cellule effettrici portatrici del recettore FcyR, innescando il rilascio dei loro granuli citotossici. Questo porta all'apoptosi delle cellule tumorali. L'ADCC può essere efficace contro i tumori che non rispondono agli effetti antiproliferativi di trastuzumab.

Per impostare il sistema ADCC, abbiamo bisogno di co-incubare le cellule di carcinoma mammario JIMT-1 anti-HER2 positive con la linea cellulare NK-92 in presenza dell'anticorpo anti-HER2 trastuzumab. La linea cellulare JIMT-1 che utilizziamo per il test esprime stabilmente la proteina fluorescente verde. Innanzitutto, codificare la piastra di vagliatura ad alto contenuto a 96 pozzetti con il mezzo JIMT.

Pipettare 50 microlitri di mezzo in ciascun pozzetto della piastra. Posizionare la piastra in un incubatore a CO2 per un'ora. Il rivestimento è fondamentale per il fissaggio delle celle JIMT-1 alla superficie di vetro della piastra.

Durante la fase di rivestimento, tripsinizzare le cellule JIMT-1. Lavare le cellule con due millilitri di PBS sterile. Quindi, aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA al pallone.

Rimettere il pallone in un incubatore a CO2 per 10 minuti. Dopo l'incubazione, toccare il pallone per verificare se le cellule JIMT-1 si sono staccate. Interrompere la digestione con due millilitri di mezzi JIMT-1 e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri.

Quindi, contare le cellule JIMT-1 con tripano blu in una camera di fusione blu. Regolare il numero di celle su 133.000 cellule per ml. Aspirare il mezzo di rivestimento, quindi aggiungere 75 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto.

Consentire alle cellule di attaccarsi durante un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2. Il giorno successivo, aspirare il terreno e aggiungere 50 microlitri di terreno JIMT-1 fresco ai pozzetti e trasferire la piastra al laboratorio di screening ad alta produttività. Il robot viene utilizzato per trasferire i composti di prova sulle micropiastre di screening ad alto contenuto.

Con il braccio robotico, il robot afferra l'unità utensile a perno, che è calibrata per trasferire 25 nanolitri. Trasferire un totale di 100 nanolitri di composti in esame dalla piastra della libreria composta alla piastra di analisi in quattro fasi. Assicurarsi che la concentrazione finale dei composti in esame sia di 20 micromolari.

Tra ogni passaggio, in primo luogo, lavare lo strumento perno in 50% DMSO e poi in 70% etanolo. Incubare la piastra per un'ora in un incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius. Colture di cellule NK in matraccio di coltura tissutale T25.

Mentre il trattamento farmacologico delle cellule JIMT-1 è in corso, raccogliere le cellule NK da un pallone T25 a una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Contare le cellule NK-92 con tripano blu in una camera di conteggio blu. Regolare il numero di cella a 400.000 cellule per ml.

Centrifugare il volume della sospensione di cellule NK che contiene 400.000 cellule per ml a 150 g per tre minuti a temperatura ambiente. Preparare il mezzo ADCC aggiungendo 20 microgrammi per ml di trastuzumab anticorpo anti-HER2 al mezzo JIMT-1. Pipettare 20.000 cellule NK in mezzo ADCC da 50 microlitri alle cellule GFP JIMT-1 target.

Il volume finale è di 100 microlitri e la concentrazione finale di trastuzumab è di 10 microgrammi per ml. Posizionare la piastra di analisi nell'apparecchiatura di analisi ad alto contenuto, che ha un incubatore incorporato impostato a 37 gradi Celsius. Le lastre sono riprodotte in due punti temporali.

In primo luogo, acquisiamo immagini immediatamente dopo l'aggiunta delle cellule effettrici alle cellule bersaglio e la seconda serie di immagini viene presa tre ore dopo l'aggiunta di cellule NK. Innanzitutto, seleziona il tipo di micropiastra. Utilizzare piastre vaglianti ad alto contenuto a 96 pozzetti.

Selezionare per scegliere la messa a fuoco perché il test viene eseguito in piastre con un obiettivo 10x in modalità non confocale. Scegli il binning due per raddoppiare il rapporto segnale-rumore. Selezionare i canali appropriati, il tempo di esposizione, la potenza del laser, il piano di messa a fuoco e la lunghezza d'onda.

Prendi le immagini in campo chiaro a 650-760 nanometri e rileva le celle JIMT-1 trasdotte da EGFP con eccitazione di 488 nanometri e lunghezza d'onda di emissione di 500-550 nanometri. Prima di iniziare la misurazione, scattare immagini campione con la funzione snapshot per verificare le impostazioni corrette. Infine, impostare il numero di campi e il numero di punti temporali per l'imaging.

Scegli, ad esempio, nove campi e due punti temporali. Per analizzare l'efficienza dell'ADCC, contare le cellule JIMT-1 vitali nel pozzo ADCC di controllo. Utilizzare il modulo celle fini per rilevare le regioni dell'immagine che corrispondono alle celle.

Rileva ogni cellula come una regione dell'immagine che ha un'intensità di fluorescenza più elevata rispetto all'ambiente circostante. Selezionare le celle utilizzando l'algoritmo M incorporato con 80 micrometri come diametro. Impostate l'impostazione della sensibilità di divisione, che suddivide un oggetto di grandi dimensioni in oggetti più piccoli, sul valore 0,5.

Imposta a zero la soglia comune, che è il livello più basso di intensità dei pixel. Escludere il rilevamento dell'area di fondo con alta intensità di fluorescenza EGFP in due fasi. Innanzitutto, applicare la funzione di calcolo delle proprietà di intensità per determinare l'intensità di fluorescenza EGFP nella regione delle celle precedentemente selezionata.

Successivamente, impostare una soglia di intensità minima e massima utilizzando l'opzione seleziona popolazione, in modo da ottenere il numero di cellule bersaglio GFP JIMT-1 vitali alla fine dell'ADCC. Calcolare l'efficienza dell'ADCC dividendo il numero di celle rilevato dopo tre ore per il numero di cella rilevato al tempo zero. Vorremmo dimostrare l'applicazione pratica del nostro metodo con risultati rappresentativi.

Abbiamo allestito una piastra di prova con 16 mescole estratte a caso dagli scaffali. Abbiamo anche incluso tre composti, colchicina, vincristina e podofillotossina con effetto inibitorio ADCC atteso. DMSO è stato utilizzato come controllo negativo.

Ogni farmaco è stato utilizzato in quattro ripetizioni sulla piastra. La figura mostra il risultato della schermata di test. Nel gruppo meno NK, è stata testata la tossicità dei farmaci sulle cellule JIMT-1.

Nel gruppo più NK, sono state aggiunte cellule NK e trastuzumab, che hanno causato circa il 50% di citotossicità. L'atteso effetto inibitore dell'ADCC dei tre composti in esame potrebbe essere rilevato con il test. Abbiamo creato un sistema di analisi di co-coltura che modella l'interazione clinicamente rilevante tra cellule di cancro al seno, cellule NK e l'anticorpo monoclonale terapeutico trastuzumab.

Il test si basa sulla microscopia automatizzata combinata con l'analisi delle immagini ed è adatto per lo screening di librerie di composti chimici per identificare farmaci modificanti l'ADCC. La procedura può potenzialmente essere utilizzata per identificare molecole adiuvanti che potenziano una risposta antitumorale o per identificare sostanze chimiche con un effetto avverso.