Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Il metodo di isolamento delle cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine o HSC aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di rinnovamento cellulare e le basi biologiche dell'eterogeneità nel compartimento HSC. È stato identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di HSC a lungo termine. Sulla base di ciò, è stata creata una linea di topi Hoxb5-reporter e le HSC a lungo termine e a breve termine sono state isolate con successo.

Per iniziare la raccolta delle cellule del midollo osseo del donatore, sterilizzare un mortaio e un pestello con etanolo al 70% e lasciarli asciugare completamente. Equilibrare quelli con tampone colorante cellulare composto da integratori contenenti PBS privi di calcio e magnesio. Mettere le ossa isolate dal topo maschio donatore Hoxb5-tri-mCherry nel mortaio e aggiungere tre millilitri del tampone colorante cellulare.

Spazzolare le ossa aperte con il pestello, quindi disaggregare i grumi cellulari mediante pipettaggio delicato e trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un tubo da 50 millilitri. Ripetere il processo con tampone colorante cellulare fresco fino a quando la soluzione diventa limpida. Di solito, ripetere tre volte è sufficiente per ottenere una soluzione chiara.

Dopo aver isolato i femori e le tibie dal topo congenito CD45.1.2, tagliare entrambe le estremità delle ossa con forbici sterili affilate. Utilizzando un ago da 23 gauge dotato di una siringa da cinque millilitri riempita con tampone di sospensione cellulare ghiacciato, lavare il midollo osseo in un piatto di coltura cellulare sterile contenente tampone di sospensione cellulare. Disaggregare i grumi di cellule mediante pipettaggio delicato, quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron utilizzando una pipetta P1000.

Per la configurazione del gating, preparare il campione seguendo le istruzioni fornite nel testo e trasferirne 400 microlitri in una provetta in polistirene a fondo rotondo con un tappo a scatto a filtro cellulare da 35 micron. Preparare e aggiungere al campione un reagente che filtra le cellule morte prima dell'analisi, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi, accendere il citometro a flusso e avviare il software di analisi seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi, premere Carica per iniziare ad acquisire i dati. Dopo aver escluso doppietti, cellule morte e cellule ligname-positive, gate la frazione lineage-negativa, c-kit-positiva, Sca-1-positiva. Quindi, elimina la frazione positiva di Flk2.

Quindi gate Hoxb5-positivo o Hoxb5-negativo pHSCs nella frazione CD150-positiva, CD34-negativa o bassa. Quindi, preparare un tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millimetri con 600 microlitri di PBS privo di calcio e magnesio, integrato con FBS inattivato dal calore al 10%. Per eseguire la selezione pHSC Hoxb5-positiva o Hoxb5-negativa, impostare il tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millilitri preparato su un dispositivo di raccolta di ordinamento e ordinare le pHSC Hoxb5-positive o Hoxb5-negative nella provetta utilizzando la strategia di gating precedentemente menzionata.

Nel primo ordinamento, utilizzate la resa della modalità di precisione di ordinamento. Impostare la piastra a 96 pozzetti con le celle di supporto precedentemente preparate sullo stadio dell'unità di deposizione automatica delle celle. Quindi, impostare il tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millilitri sulla porta di carico del citometro a flusso.

Ordinare le pHSC Hoxb5-positive o Hoxb5-negative nella piastra a 96 pozzetti con le celle di supporto utilizzando la strategia di gating precedentemente menzionata. Ordinare 10 pHSC Hoxb5-positive o Hoxb5-negative per testare le loro capacità di auto-rinnovamento. I grafici di citometria a flusso dell'analisi del midollo osseo dei topi donatori Hoxb5-tri-mCherry hanno rivelato che circa il 20-25% delle cellule nella frazione pHSC definita da lineage-negativo, c-kit-positivo, Sca-1-positivo, CD150-positivo, CD34-negativo o basso, Flk2-negativo erano Hoxb5-positivi.

Di seguito sono riportati i grafici rappresentativi della citometria a flusso dell'analisi del sangue periferico dei topi riceventi. Inoltre, l'analisi del sangue periferico dei topi riceventi dopo trapianto primario ha rivelato che, sebbene le pHSC Hoxb5-positive e Hoxb5-negative presentassero chimerismo donatore simile quattro settimane dopo il trapianto, l'ematopoiesi continua è stata osservata solo nei riceventi di Hoxb5-positivi. Le HSC Hoxb5-negative hanno iniziato a perdere la capacità di produrre cellule ematopoietiche otto settimane dopo il trapianto.

Nell'analisi del trapianto secondario, solo i riceventi di pHSC Hoxb5-positivi hanno presentato una robusta emopoiesi. Al contrario, le cellule donatrici sono state difficilmente osservate nei topi riceventi di Hoxb5-negativi alla pHSC, suggerendo che le pHSC Hoxb5-negative hanno perso la capacità di auto-rinnovamento entro 16 settimane dal trapianto primario. Questo protocollo di solito richiede da nove a 12 ore, quindi è importante mantenere il campione a quattro gradi Celsius durante le procedure il più possibile per mantenere la vitalità cellulare.