Name: Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Impara il metodo di isolamento delle cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine utilizzando il sistema reporter Hoxb5. Questo protocollo consente di studiare i meccanismi di rinnovamento cellulare e l'eterogeneità del compartimento HSC.

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Riconosciamo con gratitudine Hiroshi Kiyonari per la cura degli animali e per aver fornito topi riceventi a RIKEN BDR, così come Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi per la gestione del laboratorio presso l'Università di Kobe. Gli autori apprezzano molto anche il continuo supporto per questo lavoro. Masanori Miyanishi è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, dalla Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, dalla Life Science Foundation of Japan, dalla Takeda Science Foundation, dalla Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders e da AMED-PRIME, AMED con il numero di sovvenzione JP18gm6110020. Taro Sakamaki è supportato dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI JP21K20669 e JP22K16334 ed è stato supportato da il programma JSPS Core-to-Core e il programma RIKEN Junior Research Associate. Katsuyuki Nishi è stato supportato da JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Precondizionamento dei topi riceventi
<ol><li>Preparare topi congeniti maschi C57BL / 6 di età compresa tra 8 e 10 settimane come topi riceventi. Il numero di topi riceventi dipende dal protocollo sperimentale. In genere prepariamo 10-20 topi per ogni condizione.<ol><li>Nutrire i topi con acqua sterilizzata integrata con enrofloxacina (170 mg / L). Poiché i topi riceventi irradiati sono altamente suscettibili alle infezioni, mantenere le gabbie il più pulite possibile. NOTA: L'integrazione con antibiotici inizia 24 ore prima dell'irradiazione e continua per 3 settimane dopo il trapianto per evitare infezioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Irraggiamento totale del corpo<ol><li>L'irradiazione totale del corpo distrugge le cellule del midollo osseo ricevente per garantire l'attecchimento delle cellule donatrici. Trasferire i topi riceventi in una gabbia di irradiazione. Irradiare letalmente i topi riceventi con una singola dose di 8,7 Gy a 12-16 ore prima del trapianto. NOTA: La dose e il tempo di radiazione possono variare a seconda dell'apparecchiatura. La dose letale di radiazioni deve essere confermata con l'irradiatore del ricercatore e il ceppo murino.</li>
		<li>Riportarli nelle loro gabbie dopo l'irradiazione totale del corpo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Raccolta delle cellule del midollo osseo del donatore
<ol><li>Preparare un topo Hoxb5-tri-mCherry maschio di 12 settimane e eutanasia il topo mediante esposizione a CO2 seguita da dislocazione cervicale o utilizzando metodi approvati dal comitato etico animale locale. NOTA: il volume del reagente per mouse è descritto nei seguenti passaggi.</li>
	<li>In condizioni sterili, rimuovere la pelle ed esporre le ossa (femore, tibia, bacino, omero). Taglia i muscoli principali e prendi le ossa (femore, tibia, bacino, omero) dal topo. Metterli in piatti di coltura cellulare sterile con PBS ghiacciato privo di Ca 2+ e Mg2+.</li>
	<li>Tagliare i muscoli e i tessuti fibrosi dalle ossa usando pinzette, piccole forbici e salviette per prevenire la contaminazione. Fare attenzione a non rompere le ossa durante questo passaggio. Scartare eventuali ossa rotte per mantenere la sterilità.</li>
	<li>Sterilizzare un mortaio e un pestello con etanolo al 70% (EtOH) e lasciarli asciugare completamente. Equilibrare con tampone colorante cellulare (PBS privo di Ca 2+ e Mg2+ integrato con FBS inattivato dal calore al 2%, 2 mM EDTA, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina).</li>
	<li>Metti le ossa nella malta e aggiungi 3 ml di tampone colorante cellulare. Schiacciare le ossa aperte con il pestello. Disaggregare i grumi cellulari mediante pipettaggio delicato e trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 μm in un tubo da 50 ml.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.5 fino a quando la soluzione diventa chiara. Di solito, tre volte sono sufficienti.</li>
</ol>3. Separazione delle celle c-kit+ mediante ordinamento magnetico
<ol><li>Colorazione anticorpale per la selezione magnetica<ol><li>Centrifugare i campioni a 400 x g e 4 °C per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone colorante cellulare. Aggiungere 10 μL di IgG di ratto (5 mg/ml) per ridurre il legame anticorpale non specifico e pipettare delicatamente su e giù usando una pipetta P1.000. Incubare su ghiaccio per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo c-Kit (clone 2B8) ad una concentrazione di 4 μg/ml e mescolare con una pipetta P1.000. Incubare su ghiaccio per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 5 ml di tampone colorante cellulare e mescolare bene. Centrifugare i campioni a 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone colorante cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 35 μL di microsfere anti-APC per arricchire le celle c-Kit+ e mescolare con una pipetta P1.000. Incubare su ghiaccio per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 4-5 ml di tampone colorante cellulare. Centrifugare i campioni a 400 x g e 4 °C per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone colorante cellulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Ordinamento magnetico delle celle c-Kit+<ol><li>Seguire le istruzioni del produttore per ordinare le celle. In breve, innescare una colonna di selezione magnetica con 3 ml di tampone di colorazione cellulare. Filtrare il campione (1 ml) attraverso un filtro cellulare da 40 μm e caricare il campione sulla colonna di selezione magnetica.</li>
		<li>Lavare aggiungendo tre volte 3 ml di tampone colorante cellulare. Aggiungere il buffer di colorazione delle celle solo quando il serbatoio della colonna è vuoto.</li>
		<li>Posizionare la colonna di selezione magnetica sopra un tubo ghiacciato da 15 ml e aggiungere 5 ml di tampone colorante cellulare. Lavare le celle spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Mantenere il flusso sul ghiaccio. NOTA: In caso di perdita accidentale del campione, manteniamo il flusso fino alla fine dell'esperimento.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Colorazione delle cellule staminali ematopoietiche
<ol><li>Centrifugare il campione preparato al punto 3.2.3 a 400 x g e 4 °C per 5 minuti. Aspira il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo CD34 (clone RAM34) ad una concentrazione di 50 μg/mL al pellet e incubare su ghiaccio per 60 minuti. NOTA: Si raccomanda la preparazione delle cellule di supporto durante la prima ora di incubazione con CD34 per ridurre il tempo di elaborazione.</li>
	<li>Preparare la miscela principale di anticorpi secondo la Tabella 1. Aggiungere 100 μL della miscela madre al campione e incubare su ghiaccio per 30 minuti. L'anticorpo per l'antigene CD34 (clone; RAM34) richiede 90 minuti per una colorazione sufficiente.</li>
	<li>Aggiungere 4-5 ml di tampone colorante cellulare. Centrifugare il campione a 400 x g e 4 °C per 5 min. Aspira il surnatante. Aggiungere streptavidina-BUV737 ad una concentrazione di 3 μg/mL al pellet e incubare su ghiaccio per 30 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 4-5 ml di tampone colorante cellulare. Centrifugare il campione a 400 x g e 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 400 μL di tampone colorante cellulare. Conservare il campione in ghiaccio.</li>
</ol>5. Supporto alla preparazione cellulare
<ol><li>Preparare un topo congenito CD45.1+ CD45.2+ di 12 settimane; Idealmente, questo dovrebbe avere la stessa età del topo donatore. Eutanasia del topo mediante esposizione a CO2 seguita da dislocazione cervicale o utilizzando metodi approvati dal comitato etico animale locale. NOTA: Nell'esempio fornito, i topi congeniti CD45.1+ CD45.2+ sono stati allevati internamente incrociando B6. Topi congeniti CD45.1 con topi C57BL/6J16.</li>
	<li>In condizioni sterili, prendere sia i femori che le tibie e metterli in piatti di coltura cellulare sterili con PBS ghiacciato privo di Ca 2 + e Mg2 +. Tagliare i muscoli e i tessuti fibrosi dalle ossa usando pinzette e piccole forbici.</li>
	<li>Tagliare entrambe le estremità delle ossa con forbici affilate e sterili. Utilizzare un ago da 23 G e una siringa da 5 ml riempita con tampone di sospensione cellulare ghiacciato (PBS privo di Ca 2+ e Mg2+ integrato con FBS inattivato dal calore al 2%, penicillina 100 U / mL e streptomicina 100 μg / ml) per lavare il midollo osseo in un piatto di coltura cellulare sterile con tampone di sospensione cellulare. Disaggregare i grumi cellulari mediante pipettaggio delicato.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm utilizzando una pipetta P1.000. Contare il numero di cellule della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro e preparare una sospensione di cellule del midollo osseo contenente 1 x 106 cellule / ml.</li>
	<li>Trasferire 200 μL della sospensione di cellule del midollo osseo (2 x 105 cellule) su una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti. Conservare in ghiaccio fino all'uso. NOTA: Le piastre a fondo arrotondato sono consigliate per una facile raccolta delle celle.</li>
</ol>6. Hoxb5pos o Hoxb5neg pHSC ordinamento
<ol><li>Configurazione del gating<ol><li>Trasferire 400 μL del campione preparato nella fase 4.5 in una provetta di polistirene a fondo tondo con un tappo a scatto con filtro cellulare da 35 μm. Preparare il reagente colorante a cellule morte e aggiungerlo al campione prima dell'analisi secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Accendere un citometro a flusso e avviare il software di analisi secondo le istruzioni del produttore. Quindi, premere Carica e acquisire i dati. NOTA: Si consiglia un citometro a flusso dotato di cinque laser e un ugello da 70 μm per migliorare la purezza delle celle selezionate.</li>
		<li>Dopo aver escluso doppietti, cellule morte e cellule positive al lignaggio, gate la frazione Lineage−c-Kit+Sca-1+. Quindi, elimina la frazione Flk2+. Quindi, gate Hoxb5pos o Hoxb5neg pHSCs nella frazione CD150+CD34−/low (Figura 2). Eseguire la compensazione per la sovrapposizione spettrale nel primo esperimento. NOTA: Si prevede che le cellule Hoxb5 positive rappresentino il 20%-25% della frazione Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/bassaFlk2−.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos o Hoxb5neg pHSC sorting<ol><li>Preparare un tubo legante a basso contenuto proteico da 1,5 ml con 600 μL di PBS privo di Ca 2+ e Mg2+ integrato con FBS inattivato dal calore al 10%.</li>
		<li>Impostare il tubo legante a basso contenuto proteico da 1,5 mL su un dispositivo di raccolta di smistamento e ordinare le pHSC Hoxb5pos o Hoxb5neg nella provetta da 1,5 mL utilizzando la strategia di gating impostata nel passaggio 6.1.3. Nel primo ordinamento, utilizzate la resa della modalità di precisione di ordinamento.</li>
		<li>Impostare la piastra a 96 pozzetti con le celle di supporto preparate al punto 5.5 sullo stadio dell'unità di deposizione automatica delle celle (ACDU). Impostare il tubo legante a basso contenuto proteico da 1,5 mL preparato al punto 6.2.2 sulla porta di carico di un citometro a flusso.</li>
		<li>Ordinare le pHSC Hoxb5pos o Hoxb5neg in una piastra a 96 pozzetti con le celle di supporto utilizzando la strategia di gating impostata nel passaggio 6.1.3. Ordina 10 hoxb5pos o Hoxb5neg pHSC per testare le loro capacità di auto-rinnovamento. NOTA: si consiglia la doppia selezione per migliorare la purezza. Nel secondo ordinamento, utilizzare la purezza come modalità di precisione di ordinamento consigliata.</li>
		<li>Tipicamente, 500-1.000 pHSC Hoxb5pos e 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSC vengono raccolti dopo la doppia selezione. Procedere con le procedure di trapianto il più presto possibile dopo la selezione HSC per migliorare la vitalità cellulare (idealmente entro 1-2 ore).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Trapianto
<ol><li>Posizionare sul ghiaccio la piastra a 96 pozzetti selezionata HSC preparata al punto 6.2.4. Maneggiare la piastra a 96 pozzetti selezionata HSC in condizioni sterili, idealmente in una cappa cellulare.</li>
	<li>Anestetizzare un topo ricevente con isoflurano al 2% in una camera di induzione per anestesia gassosa. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, rimuoverlo e posizionarlo su un fianco. Per garantire un'anestesia sufficiente, confermare nessun movimento in risposta a uno stimolo nocivo.</li>
	<li>Dopo la conferma della corretta anestesia, eseguire un'iniezione retroorbitale il prima possibile per evitare che il topo riprenda conoscenza. L'iniezione retroorbitale richiede meno di 30 s. NOTA: Poiché il tempo di iniezione è breve, terminiamo la procedura senza applicare unguento oftalmico negli occhi. Tuttavia, se la procedura richiede più tempo, si consiglia l'uso di unguento oftalmico.</li>
	<li>Pipettare delicatamente le celle nella piastra a 96 pozzetti selezionata HSC per mescolarle. Raccogliere le cellule donatrici nella piastra di selezione utilizzando una siringa da insulina da 30 G e iniettarle nel plesso venoso retroorbitale dei topi riceventi. Il volume iniettabile raccomandato è ≤200 μL.</li>
	<li>Osserva fino a quando i topi sono coscienti e si muovono in una gabbia pulita. Riportarli nelle loro gabbie dopo aver confermato il loro recupero.</li>
</ol>8. Analisi del sangue periferico
<ol><li>Raccogliere 50 μL di sangue periferico dalla vena caudale e risospenderlo con 100 μL di PBS privo di Ca 2+ e Mg2+ con 2 mM EDTA. Trasferire tutti i campioni in una piastra da 96 pozzetti. Centrifugare a 400 x g e 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante .</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare sul ghiaccio per 3 minuti. Centrifugare i campioni a 400 x g e 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone colorante cellulare. Centrifugare i campioni a 400 x g e 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Preparare la miscela principale di anticorpi secondo la Tabella 2. Aggiungere 50 μL di master mix anticorpale e incubare su ghiaccio per 30 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di tampone colorante cellulare. Centrifugare i campioni a 400 x g e 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone colorante cellulare. Centrifugare i campioni a 400 x g e 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere in 200 μL di tampone colorante cellulare e aggiungere il reagente colorante delle cellule morte prima dell'analisi secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Analizzare il chimerismo del sangue periferico utilizzando un citometro a flusso come descritto in precedenza16. Raccogliere il sangue a 4 settimane, 8 settimane, 12 settimane e 16 settimane dopo il trapianto per seguire la ricostituzione multi-linea. I grafici rappresentativi della citometria a flusso sono forniti nella Figura 3.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
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<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%3A+Subtypes%2C+not+unpredictable+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li>
<li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+heterogeneity%3A+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li>
<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse associati a questo studio.

Tradizionalmente, le HSC definite dai marcatori di superficie cellulare sono state preparate per studiare le funzioni delle HSC, come la capacità di auto-rinnovamento e la multi-potenza 19,20,21. Tuttavia, la frazione HSC immunofenotipicamente definita (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contiene due popolazioni HSC discrete: LT-HSCs e ST-HSCs <su...

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che possiedono capacità di auto-rinnovamento e multipotenza, risiedono all'apice della gerarchia ematopoietica 1,2. Nel 1988, Weissman e colleghi hanno dimostrato per la prima volta che l'isolamento delle HSC di topo potrebbe essere ottenuto utilizzando la citometria a flusso3. Successivamente, una frazione definita da una combinazione di marcatori di superficie cellulare, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, è stata riportata per contenere tutte le HSC nei topi 4,5,6,7,8.
Le HSCs immunofenotipicamente definite (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (di seguito, pHSCs) sono state precedentemente considerate funzionalmente omogenee. Tuttavia, recenti analisi monocellulari hanno rivelato che le pHSC mostrano ancora eterogeneità rispetto alla loro capacità di auto-rinnovamento9,10 e multipotenza11,12. In particolare, nella frazione pHSC sembrano esistere due popolazioni per quanto riguarda la loro capacità di auto-rinnovamento: le cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs), che hanno una capacità di auto-rinnovamento continuo, e le cellule staminali ematopoietiche a breve termine (ST-HSCs), che hanno capacità transitorie di auto-rinnovamento 9,10.
Ad oggi, i meccanismi molecolari della capacità di auto-rinnovamento che distinguono LT-HSCs e ST-HSCs rimangono poco conosciuti. È fondamentale isolare entrambe le popolazioni cellulari in base alle loro capacità di auto-rinnovamento e scoprire i meccanismi molecolari sottostanti. Sono stati inoltre introdotti diversi sistemi di segnalazione per purificare LT-HSC13,14,15; tuttavia, la purezza LT-HSC definita da ciascun sistema reporter è variabile e la purificazione LT-HSC esclusiva non è stata raggiunta fino ad oggi.
Pertanto, lo sviluppo di un sistema di isolamento per LT-HSC e ST-HSC accelererà la ricerca sulla capacità di auto-rinnovamento nella frazione pHSC. Nell'isolamento di LT-HSCs e ST-HSCs, uno studio che utilizza uno screening multi-step e imparziale ha identificato un singolo gene, Hoxb5, che è eterogeneamente espresso nella frazione pHSC16. Inoltre, l'analisi del midollo osseo dei topi reporter Hoxb5 ha rivelato che circa il 20% -25% della frazione pHSC è costituita da cellule Hoxb5 pos. Un test competitivo di trapianto utilizzando le pHSC Hoxb5 pos e le pHSC Hoxb5 neg ha rivelato che solo le pHSC Hoxb5pos possiedono una capacità di auto-rinnovamento a lungo termine, mentre le pHSC Hoxb5neg perdono la loro capacità di auto-rinnovamento entro un breve periodo, indicando che Hoxb5 identifica LT-HSC nella frazione pHSC16. 
Qui, dimostriamo un protocollo passo-passo per isolare LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Inoltre, presentiamo un saggio di trapianto competitivo per valutare la capacità di auto-rinnovamento delle pHSC Hoxb5pos/neg (Figura 1). Questo sistema di reporter Hoxb5 ci consente di isolare prospetticamente LT-HSC e ST-HSC e contribuisce alla comprensione delle caratteristiche specifiche di LT-HSC.

<table><tbody><tr><td>Striscia da 0,2 mL da 8 provette, tappo a cupola</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina 30G</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 & micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scatto</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante di vitalità a 7 AAD</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratore con trappola pallone</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotina (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. Topi congenici CD45.1</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II sistema di ordini speciali&nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampone colorante brillante</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotina (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -Biotina (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2 topi congenici</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Allevati nel nostro laboratorio</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotina (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotina (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da centrifuga 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) senza Ca e Mg, liquido&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versione 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Best theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mTopi ciliegia (sfondo C57BL/6J)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Allevato nel nostro laboratorio</td></tr><tr><td>IgG da siero di ratto, grado tecnico, >=80% (SDS-PAGE), soluzione acquosa tamponata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra per coltura tissutale (per cella di adesione) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MidiMACS</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Gabbie per torte di topi</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata multiuso</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina Soluzione Mista</td><td>nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Malta in Porcellana &phi; 120 mm con pestello</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Provetta LoBind per proteine 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi in acciaio inossidabile</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Resrain Resrain for Mice standard</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotina (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml Siringa Luer-Slip concentrica</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Ago ipodermico 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

La capacità di auto-rinnovamento e il potenziale di differenziazione multi-lineage sono generalmente considerati come le caratteristiche distintive delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Tuttavia, numerosi studi hanno suggerito che esiste eterogeneità funzionale nel compartimento HSC. Recenti analisi a singola cellula hanno riportato cloni HSC con diversi destini cellulari all'interno del compartimento HSC, che sono indicati come cloni HSC distorti. I meccanismi alla base di risultati eterogenei o scarsamente riproducibili sono poco compresi, soprattutto per quanto riguarda la durata dell'auto-rinnovamento quando le frazioni HSC purificate vengono trapiantate mediante immunocolorazione convenzionale. Pertanto, stabilire un metodo di isolamento riproducibile per le HSC a lungo termine (LT-HSC) e le HSC a breve termine (ST-HSC), definite dalla durata del loro auto-rinnovamento, è fondamentale per superare questo problema. Utilizzando uno screening imparziale multi-step, abbiamo identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di LT-HSC nel sistema ematopoietico del topo. Sulla base di questa scoperta, abbiamo stabilito una linea di topi reporter Hoxb5 e isolato con successo LT-HSC e ST-HSC. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Questo metodo di isolamento aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di auto-rinnovamento e le basi biologiche di tale eterogeneità nel compartimento HSC.

In precedenza, la capacità di auto-rinnovamento è stata misurata utilizzando saggi di trapianto competitivi, in cui si ritiene che le HSC del donatore mantengano la loro capacità di auto-rinnovamento solo se si osservano cellule donatrici multi-laudio nel sangue periferico ricevente17. Inoltre, diversi rapporti definiscono le LT-HSC come cellule che continuano a produrre cellule del sangue periferico diversi mesi dopo il secondo trapianto di midollo osseo10,18<su...

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

Il metodo di isolamento delle cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine o HSC aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di rinnovamento cellulare e le basi biologiche dell'eterogeneità nel compartimento HSC. È stato identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di HSC a lungo termine. Sulla base di ciò, è stata creata una linea di topi Hoxb5-reporter e le HSC a lungo termine e a breve termine sono state isolate con successo.Per iniziare la raccolta delle cellule del midollo osseo del donatore, sterilizzare un mortaio e un pestello con etanolo al 70% e lasciarli asciugare completamente. Equilibrare quelli con tampone colorante cellulare composto da integratori contenenti PBS privi di calcio e magnesio. Mettere le ossa isolate dal topo maschio donatore Hoxb5-tri-mCherry nel mortaio e aggiungere tre millilitri del tampone colorante cellulare.Spazzolare le ossa aperte con il pestello, quindi disaggregare i grumi cellulari mediante pipettaggio delicato e trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un tubo da 50 millilitri. Ripetere il processo con tampone colorante cellulare fresco fino a quando la soluzione diventa limpida. Di solito, ripetere tre volte è sufficiente per ottenere una soluzione chiara.Dopo aver isolato i femori e le tibie dal topo congenito CD45.1.2, tagliare entrambe le estremità delle ossa con forbici sterili affilate. Utilizzando un ago da 23 gauge dotato di una siringa da cinque millilitri riempita con tampone di sospensione cellulare ghiacciato, lavare il midollo osseo in un piatto di coltura cellulare sterile contenente tampone di sospensione cellulare. Disaggregare i grumi di cellule mediante pipettaggio delicato, quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron utilizzando una pipetta P1000.Per la configurazione del gating, preparare il campione seguendo le istruzioni fornite nel testo e trasferirne 400 microlitri in una provetta in polistirene a fondo rotondo con un tappo a scatto a filtro cellulare da 35 micron. Preparare e aggiungere al campione un reagente che filtra le cellule morte prima dell'analisi, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi, accendere il citometro a flusso e avviare il software di analisi seguendo le istruzioni del produttore.Quindi, premere Carica per iniziare ad acquisire i dati. Dopo aver escluso doppietti, cellule morte e cellule ligname-positive, gate la frazione lineage-negativa, c-kit-positiva, Sca-1-positiva. Quindi, elimina la frazione positiva di Flk2.Quindi gate Hoxb5-positivo o Hoxb5-negativo pHSCs nella frazione CD150-positiva, CD34-negativa o bassa. Quindi, preparare un tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millimetri con 600 microlitri di PBS privo di calcio e magnesio, integrato con FBS inattivato dal calore al 10%. Per eseguire la selezione pHSC Hoxb5-positiva o Hoxb5-negativa, impostare il tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millilitri preparato su un dispositivo di raccolta di ordinamento e ordinare le pHSC Hoxb5-positive o Hoxb5-negative nella provetta utilizzando la strategia di gating precedentemente menzionata.Nel primo ordinamento, utilizzate la resa della modalità di precisione di ordinamento. Impostare la piastra a 96 pozzetti con le celle di supporto precedentemente preparate sullo stadio dell'unità di deposizione automatica delle celle. Quindi, impostare il tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millilitri sulla porta di carico del citometro a flusso.Ordinare le pHSC Hoxb5-positive o Hoxb5-negative nella piastra a 96 pozzetti con le celle di supporto utilizzando la strategia di gating precedentemente menzionata. Ordinare 10 pHSC Hoxb5-positive o Hoxb5-negative per testare le loro capacità di auto-rinnovamento. I grafici di citometria a flusso dell'analisi del midollo osseo dei topi donatori Hoxb5-tri-mCherry hanno rivelato che circa il 20-25% delle cellule nella frazione pHSC definita da lineage-negativo, c-kit-positivo, Sca-1-positivo, CD150-positivo, CD34-negativo o basso, Flk2-negativo erano Hoxb5-positivi.Di seguito sono riportati i grafici rappresentativi della citometria a flusso dell'analisi del sangue periferico dei topi riceventi. Inoltre, l'analisi del sangue periferico dei topi riceventi dopo trapianto primario ha rivelato che, sebbene le pHSC Hoxb5-positive e Hoxb5-negative presentassero chimerismo donatore simile quattro settimane dopo il trapianto, l'ematopoiesi continua è stata osservata solo nei riceventi di Hoxb5-positivi. Le HSC Hoxb5-negative hanno iniziato a perdere la capacità di produrre cellule ematopoietiche otto settimane dopo il trapianto.Nell'analisi del trapianto secondario, solo i riceventi di pHSC Hoxb5-positivi hanno presentato una robusta emopoiesi. Al contrario, le cellule donatrici sono state difficilmente osservate nei topi riceventi di Hoxb5-negativi alla pHSC, suggerendo che le pHSC Hoxb5-negative hanno perso la capacità di auto-rinnovamento entro 16 settimane dal trapianto primario. Questo protocollo di solito richiede da nove a 12 ore, quindi è importante mantenere il campione a quattro gradi Celsius durante le procedure il più possibile per mantenere la vitalità cellulare.

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Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare (CD34+ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

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Impara il metodo di isolamento delle cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine utilizzando il sistema reporter Hoxb5. Questo protocollo consente di studiare i meccanismi di rinnovamento cellulare e l'eterogeneità del compartimento HSC.

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

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