Name: Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Scopri un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato per arricchire piccole vescicole extracellulari dal tessuto del cancro del fegato. Questa tecnica semplice e conveniente migliora la purezza delle vescicole isolate rispetto ai metodi classici.

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Gli autori ringraziano il First Affiliated Hospital della Gannan Medical University per aver sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82260422).

Il tessuto del cancro del fegato umano è stato raccolto da pazienti con diagnosi di malignità epatica presso il primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Tutti i pazienti hanno firmato un modulo di consenso informato e la raccolta di campioni di tessuto umano è stata approvata dal comitato etico del primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione
<ol><li>Posizionare lo shaker decolorante di trasferimento nell'incubatore e impostare la temperatura a 37 °C. Vedere la Figura 1 per tutte le altre attrezzature necessarie.</li>
	<li>Pulire il bisturi e la pinza spruzzandoli con alcool al 75%.</li>
	<li>Preparare la soluzione digestiva misurando 6 mg di collagenasi D (4 mg/ml) e 24 μL di DNasi Ι (80 U/mL) e aggiungendoli a 1,5 mL di terreno basico RPMI-1640. Mescolare per inversione delicata fino a completa dissoluzione degli additivi.</li>
	<li>In anticipo, inumidire i filtri cellulari da 70 μm e 0,22 μm con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Posizionare una capsula di coltura cellulare sterile da 100 mm sulla ghiacciaia per contenere i tessuti del fegato dopo lo scongelamento.</li>
	<li>Entro 15 minuti dopo l'isolamento del tessuto del carcinoma epatocellulare, sciacquare il sangue sulla superficie del blocco tissutale con PBS, trasferire il tessuto in un tubo congelato sterile e conservarlo a -80 ° C fino all'esperimento per non più di 2 settimane.</li>
</ol>2. Dissociazione tissutale
<ol><li>Rimuovere il campione di tessuto dal congelatore a -80 °C e introdurre circa 400 mg di tessuto tagliato in frammenti di 2 mm x 2 mm x 2 mm nella capsula di coltura cellulare da 10 cm sulla ghiacciaia.</li>
	<li>Spostare il tessuto in una piastra a 6 pozzetti con 1,5 ml della soluzione digestiva; quindi, posizionare la piastra sullo shaker decolorante transfert (20 rpm/min) per incubare per 20 minuti a 37 °C per la completa dissociazione del tessuto tumorale del fegato e il rilascio dei sEV.</li>
	<li>Rimuovere la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore e posizionarla sulla ghiacciaia. Aggiungere 80 μL di inibitore della fosfatasi e 200 μL di soluzione completa di inibitore della proteasi per interrompere la digestione.</li>
	<li>Trasferire la soluzione digestiva nel filtro cellulare da 70 μm e filtrarla lentamente per rimuovere eventuali detriti tissutali di grandi dimensioni. Raccogliere il filtrato e metterlo in una provetta da centrifuga da 2 ml.</li>
</ol>3. Ultracentrifugazione differenziale
NOTA: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 °C.
<ol><li>Centrifugare il filtrato a 500 × g per 10 minuti e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml. La maggior parte dei piccoli detriti tissutali può quindi essere rimossa.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante a 3.000 × g per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga fino a quando la punta della pipetta sta per toccare la sostanza bianca sulla superficie.</li>
	<li>Centrifugare il liquido rimanente a 3.000 × g per 3 minuti; Quindi, aspirare il surnatante per facilitare la raccolta delle vescicole. Per garantire la purezza dei sEV, assicurarsi che la sostanza bianca non sia aspirata.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante raccolto a 12.000 × g per 20 minuti e trasferire 900 μL del surnatante in una provetta da ultracentrifuga da 4,7 ml. Centrifugare il liquido rimanente a 12.000 × g per 3 minuti, quindi raccogliere e mescolare entrambi i surnatanti nella stessa provetta ultracentrifuga. Riempire completamente il tubo con PBS.</li>
	<li>Centrifugare i surnatanti a 100.000 × g per 60 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet riempiendo il tubo ultracentrifugo con PBS e centrifugando nuovamente a 100.000 × g per 60 minuti. Risospendere il pellet con 50 μL di PBS.</li>
	<li>Aspirare la sospensione sEV utilizzando una siringa sterile da 1 mL e filtrarla attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 600 μL e conservarlo a -80 °C per ulteriori analisi.</li>
</ol>4. Valutazione della qualità dell'arricchimento
<ol><li>Osservare la morfologia dei sEV al microscopio elettronico a trasmissione.<ol><li>Quindi, far cadere 10 μL del campione sEV su una rete di rame, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e pulirlo con acqua distillata sterile, utilizzando carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.</li>
		<li>Versare 10 μL di acetato di uranile al 2% sulla rete di rame per una colorazione negativa per 1 minuto. Utilizzare carta da filtro per assorbire il liquido sulla superficie della rete di rame e asciugarlo per 2 minuti sotto una lampada ad incandescenza.</li>
		<li>Osservare la maglia di rame al microscopio elettronico a trasmissione e l'immagine a 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare un citometro a flusso di nanoparticelle per determinare la distribuzione dimensionale e la purezza dei sEV.<ol><li>Prima di avviare la macchina, preparare provette contenenti 200 μL di controllo qualità, 200 μL di nanosfere di silice, 2 x 200 μL di acqua ultrapura, 2 x 200 μL di soluzione detergente e 200 μL di PBS. NOTA: Prima di testare i campioni sEV, è necessario effettuare un controllo di qualità sullo strumento e testare lo standard granulometrico (la distribuzione dimensionale deve essere calcolata utilizzando curve standard generate con diverse nanomicrosfere di diametri diversi [68-155 nm] nella stessa condizione di rivelazione). Le perle di QC e le nanosfere di silice sono state diluite 100 volte con acqua ultrapura in un volume totale di 200 μL.</li>
		<li>Controllare il volume della soluzione detergente (>10 ml) e notare la differenza tra i livelli del liquido della guaina e del liquido di scarto (20-30 cm).</li>
		<li>Spegnere l'alimentazione principale dello strumento; Dopo 20 s, accendere il computer e attendere i segnali acustici che indicano che lo strumento è collegato correttamente per eseguire il software.</li>
		<li>Fare clic su Start Up per accendere la fotocamera, il laser e la pompa dell'aria.</li>
		<li>Fare clic su Sheath Flow-Start Up e posizionare acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Dopo 4 minuti (conto alla rovescia dello strumento), fare clic su Sample-Boosting | Campionamento-Scarico.</li>
		<li>Dopo 30 secondi, posizionare il tubo grezzo sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample-Boosting | Campionamento-Scarico. Quindi, posizionare il tubo che contiene l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico e, contemporaneamente, fare clic su Sample-Boosting | Spurgo del flusso della guaina.</li>
		<li>Fare clic su Funzionamento manuale e posizionare il tubo di concentrazione delle particelle sulla piattaforma di carico. Quindi, fare clic su Sample-Boosting per 1 minuto e contemporaneamente selezionare il controllo di qualità 250 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf."</li>
		<li>Fare clic su Campionamento campione e accendere il rilevatore facendo clic su SPCM. NOTA: A questo punto, è possibile visualizzare la forma d'onda del segnale in tempo reale.</li>
		<li>Fare clic su Campionamento automatico e immettere 1.0 in Sampling SET per fissare la pressione a 1 KPa. Fare clic sulla barra degli strumenti e selezionare Segnale grande.</li>
		<li>Regolare la posizione orizzontale del laser e impostare il laser su 2 μm; quindi, fai clic su L o R per assicurarti che il segnale sia forte e uniforme.</li>
		<li>Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.</li>
		<li>Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e, dopo 1 minuto, fare clic su Sample-Unload. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.</li>
		<li>Posizionare il tubo standard di dimensioni delle particelle sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample-Boosting per 1 minuto.</li>
		<li>Selezionare il controllo di qualità 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" e fare clic su Campionamento campione. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.</li>
		<li>Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.</li>
		<li>Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e fare clic su Sample-Unload dopo 1 minuto. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.</li>
		<li>Posizionare il tubo PBS sulla piattaforma di carico; clicca su Sample-Boosting per 1 min.</li>
		<li>Selezionare il controllo di qualità 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" e fare clic su Campionamento campione. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.</li>
		<li>Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.</li>
		<li>Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e Sample-Unload dopo 1 minuto. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.</li>
		<li>Controllare le informazioni di esempio come descritto in precedenza nei passaggi 4.2.17-4.2.20; modificare il PBS (passaggio 4.2.17) nel campione sEV e analizzare i dati.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifica ulteriormente i sEV per western blot.<ol><li>Determinare le concentrazioni proteiche dei sEV e dei tessuti utilizzando il kit di quantificazione delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Calcolare il volume di carico dei sEV (ad esempio, per 5 μg di proteine per pozzetto) sulla base di questi risultati quantitativi. Aggiungere il buffer di carico in rapporto 1:4 e vortice la miscela.</li>
		<li>Dopo la denaturazione in un bagno metallico a 100 °C (termostato a secco) per 10 minuti, separare la proteina su un gel di poliacrilammide al 12% a 60 V per 80 minuti.</li>
		<li>Trasferire il gel su una membrana di difluoruro di polivinilidene da 0,22 μm a 220 mA per 2 ore utilizzando tampone di trasferimento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo).</li>
		<li>Bloccare la membrana con latte secco scremato al 5% in Tris-buffered saline Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente e incubare con anticorpi primari (anticorpo monoclonale di coniglio anti-umano CD9, anticorpo monoclonale di coniglio CD63 anti-umano, anticorpo monoclonale di coniglio anti-umano TSG101, monoclonale di topo anticorpo GM130 umano) per una notte a 4 °C. Diluire gli anticorpi primari nel 5% di latte scremato a 1:1.000.</li>
		<li>Dopo tre lavaggi con TBST, incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
		<li>Rilevare l'anticorpo legato all'HRP utilizzando il substrato di blotting ECL, quindi raccogliere e analizzare le immagini.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
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<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo ripetibile per estrarre i sEV dal tessuto del cancro del fegato. I sEV di alta qualità sono ottenuti mediante isolamento dei tessuti acuti, trattamento con enzimi digestivi, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione e purificazione della membrana filtrante da 0,22 μm. Per l'analisi a valle, è estremamente importante garantire l'elevata purezza dei sEV. Nel processo di centrifugazione differenziale, uno strato di sostanze bianche (composizione sconosciuta) apparirà sulla superfi...

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) hanno un diametro di circa 30-150 nm e sono secrete da varie cellule1. Possono comunicare con le cellule dei tessuti e regolare il microambiente locale o distante trasportando importanti molecole biologiche come lipidi, proteine, DNA e RNA a vari organi, tessuti, cellule e parti intracellulari. Pertanto, possono anche modificare il comportamento delle celle riceventi 2,3. L'isolamento e la purificazione di specifici sEV è un prerequisito essenziale per studiare il loro comportamento biologico durante lo sviluppo e il decorso della malattia. L'ultracentrifugazione differenziale, considerata il gold standard, è comunemente usata per separare i sEV dai tessuti in cui risiedono normalmente4. Detriti tissutali, detriti cellulari, grandi vescicole e corpi apoptotici possono essere rimossi con questa tecnica, lasciando solo i sEV.
È stato dimostrato che la collagenasi D e la DNasi I non influenzano le caratteristiche molecolari delle cellule o delle vescicole, con le proprietà di entrambi gli enzimi che contribuiscono al rilascio di vescicole nella matrice extracellulare 5. Questi enzimi sono stati utilizzati per estrarre sEVs dal tessuto melanoma metastatico umano, dal tessuto del cancro del colon e dal tessuto della mucosa del colon 5,6,7. Tuttavia, la concentrazione e il tempo di digestione della collagenasi D e della DNasi I in questi metodi differiscono, portando a conclusioni incoerenti. Per evitare la coprecipitazione di altri sottotipi di sEV, i ricercatori hanno rimosso vescicole extracellulari più grandi (0,1 μm o 0,2 μm di diametro) mediante filtrazione e/o centrifugazione differenziale8. A seconda del tessuto di origine, possono essere necessari diversi metodi di isolamento e purificazione 9,10.
Utilizzando il tradizionale metodo di ultracentrifugazione differenziale per estrarre i sEV dal tessuto epatico si ottiene uno strato di sostanza bianca sulla superficie del surnatante, senza alcun modo di determinarne le proprietà. In uno studio precedente11, questo strato di sostanza bianca è stato trovato per influenzare la purezza dei sEV. Sebbene il numero di particelle e la concentrazione proteica dei campioni isolati con il metodo tradizionale fossero superiori a quelli del metodo attuale, il coefficiente di variazione era elevato, probabilmente perché molti inquinanti possono portare a una scarsa ripetibilità dei risultati. Cioè, usando il detergente (cioè, rilevando la solubilità delle particelle in 1% Triton X-100), abbiamo scoperto che la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo era maggiore. Quindi, usiamo questo metodo per isolare e purificare i sEV derivati dal tessuto del cancro del colon-retto per la ricerca proteomica.
Attualmente, la ricerca sulle EV nel cancro del fegato si concentra principalmente sul siero, sul plasma e sul surnatante della coltura cellulare12,13,14. Tuttavia, le sEV derivate dal tessuto del cancro del fegato possono riflettere più accuratamente la patologia fisiologica e il microambiente circostante del cancro del fegato ed evitare efficacemente la degradazione e l'inquinamento di altri EV15,16. Con l'uso dell'ultracentrifugazione differenziale, questo metodo può arricchire la resa e ottenere sEV di alta qualità, fornendo una base importante per l'ulteriore studio del cancro del fegato. Questo metodo consente al tessuto del cancro del fegato di essere separato da una netta separazione e di essere dissociato dalla collagenasi D e DNasi I. Quindi, i detriti cellulari, le grandi vescicole e i corpi apoptotici vengono ulteriormente rimossi mediante filtrazione e ultracentrifugazione differenziale. Infine, i sEV vengono isolati e purificati per studi successivi.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Unità filtrante a membrana</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile da 1 mL</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2% Acetato di uranile Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 4,7 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di cutura cellulare a 6 pozzetti</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Becher</td><td>Tianjin Kangyiheng Strumento sperimentale Società di vendita</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 &; m Filtro cellulare</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Piatto per coltura cellulare</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Provetta da centrifuga</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>Kit di quantificazione delle proteine BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione detergente</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Rete di rame</td><td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Termostato a secco</td><td>Hangzhou allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti umano CD9 Anticorpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo accoppiato alla perossidasi di rafano di capra (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio accoppiato alla perossidasi di rafano di capra (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso di nanoparticelle</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della fosfatasi (PhosSTOP)</td><td>Soluzione</td><td></td> salina tamponata con fosfato Roche 4906845001 <td></td></tr><tr>(<td>PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in polivinilidene difluoruro</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC Beads</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mezzo di base</td><td>Industrie Biologiche&nbsp;</td><td></td><td></td>C11875500BT</tr><tr><td>bisturi</td><td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>nanosfere di silice</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-EXO</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore di decolorazione per trasferimento TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 Anticorpo</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Guangzhou Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate dal tessuto possono riflettere lo stato funzionale delle cellule sorgente e le caratteristiche dello spazio interstiziale del tessuto. L'arricchimento efficiente di questi veicoli elettrici è un prerequisito importante per lo studio della loro funzione biologica e una chiave per lo sviluppo di tecniche di rilevamento clinico e tecnologia di supporto terapeutico. È difficile isolare i sEV dal tessuto perché di solito sono fortemente contaminati. Questo studio fornisce un metodo per il rapido arricchimento di sEV di alta qualità dal tessuto del cancro del fegato. Il metodo prevede un processo in quattro fasi: l'incubazione di enzimi digestivi (collagenasi D e DNasi Ι) con tessuto, filtrazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Grazie all'ottimizzazione della fase di ultracentrifugazione differenziale e all'aggiunta di una fase di filtrazione, la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo è superiore a quella ottenuta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Fornisce un'importante metodologia e dati di supporto per lo studio dei sEV derivati dai tessuti.

Le sEV provenienti da tessuti di cancro del fegato umano hanno svolto un ruolo cruciale nella diagnosi, nel trattamento e nella prognosi dei pazienti con cancro al fegato. Questo metodo ha utilizzato strumenti di laboratorio comuni per isolare e purificare i sEV derivati dai tessuti del cancro del fegato; ciò può fornire un supporto metodologico per lo studio delle EV. La Figura 2 illustra il processo generale di arricchimento delle EV dai tessuti del cancro del fegato. Le sEV negli spazi in...

Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.

Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Questo metodo consente l'isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato con una purezza superiore a quella raggiunta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Questa tecnologia è semplice, conveniente e facile da usare, che può fornire supporto metodologico per lo studio di piccole vescicole extracellulari. Per iniziare, rimuovere il campione di tessuto dal congelatore a 80 gradi Celsius.Posizionare circa 400 milligrammi di tessuto in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri sulla ghiacciaia e tritare finemente il tessuto con un bisturi. Trasferire il tessuto in una piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri della soluzione digestiva. Quindi, posizionare la piastra sullo shaker di decolorazione del transfert e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti per la completa dissociazione del tessuto del cancro del fegato e il rilascio delle piccole vescicole extracellulari o sEV.Dopo l'incubazione, posizionare la piastra a sei pozzetti sulla ghiacciaia. Aggiungere 80 microlitri di inibitore della fosfatasi e 200 microlitri di soluzione completa di inibitore della proteasi per fermare la digestione. Quindi, trasferire la soluzione digestiva in un filtro cellulare da 70 micrometri posto su un tubo da centrifuga da due millilitri e filtrarlo lentamente per rimuovere eventuali detriti di tessuto di grandi dimensioni.Centrifugare il filtrato a 500 g per 10 minuti per rimuovere i piccoli detriti tissutali e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da due millilitri. Centrifugare il surnatante a 3.000 g per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga fino a quando la punta della pipetta sta per toccare i detriti bianchi sul fondo.Dopo aver ripetuto la centrifugazione del liquido rimanente, raggruppare il surnatante nel tubo senza disturbare i detriti. Centrifugare il surnatante raccolto a 12.000 g per 20 minuti e trasferire 900 microlitri di surnatante in una provetta ultracentrifuga da 4,7 millimetri. Ripetere la centrifugazione del liquido rimanente, quindi raccogliere e mescolare entrambi i surnatanti nello stesso tubo di ultracentrifuga.Riempire completamente il tubo con PBS. Centrifugare il surnatante a 100.000 g per 60 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet riempiendo il tubo ultracentrifuga con PBS.Dopo aver ripetuto la centrifugazione a 100.000 g per 60 minuti, risospendere il pellet con 50 microlitri di PBS. Aspirare la sospensione sEV utilizzando una siringa sterile da un millilitro e filtrarla attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri in una provetta da centrifuga da 600 microlitri. Conservare il filtrato a 80 gradi Celsius per ulteriori analisi.Utilizzare un citometro a flusso di nanoparticelle per determinare la distribuzione dimensionale e la purezza dei sEV. Controllare il volume della soluzione detergente. Quindi, notare la differenza tra i livelli della guaina e del liquido di scarto.Dopo 20 secondi dall'accensione dell'alimentatore principale dello strumento, accendere il computer. Attendere i segnali acustici che indicano che lo strumento è collegato correttamente per eseguire il software. Fare clic su Start Up per accendere la fotocamera, il laser e la pompa dell'aria.Quindi, fare clic su Sheath Flow e selezionare Start Up.Posizionare l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Dopo quattro minuti, fare clic su Campione e potenziamento, quindi selezionare Scarica nel campione. Dopo 30 secondi, posizionare il tubo bianco sulla piattaforma di carico.Fare clic su Campione, selezionare Boosting, quindi selezionare Scarica nel campione. Quindi, posizionare il tubo contenente l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Contemporaneamente, fai clic su Campione e Boosting, seguito da Sheath Flow e Purge.Fare clic su Operazione manuale e posizionare il tubo di concentrazione delle particelle sulla piattaforma di carico. Quindi, fare clic su Campione, selezionare Potenziamento per un minuto e contemporaneamente selezionare Controllo di qualità delle nanosfere di silice fluorescente standard a 250 nanometri in Informazioni campione. Selezionare Campionamento da campione e accendere il rilevatore facendo clic su SPCM.Quindi, fai clic su Campionamento automatico e inserisci 1.0 in Set di campionamento per fissare la pressione a un kilopascal. Fare clic sulla barra degli strumenti e selezionare Segnale grande. Regolare la posizione orizzontale del laser e impostare il laser su due micrometri.Quindi, fai clic continuamente su L e R per assicurarti che il segnale sia forte e uniforme. Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che passa automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in File NFA e fare clic su Campione per selezionare Scarica.Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico. Fare clic su Campione, selezionare Boosting e dopo un minuto fare clic su Campione e scarica. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.Posizionare il tubo standard di dimensioni delle particelle sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample Boosting per un minuto. Selezionare il controllo di qualità da 68 a 155 S16M-Exo in Informazioni campione e fare clic su Campione, quindi su Campionamento. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che passa automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Nfa e fare clic su Campione per selezionare Scarica. Dopo aver rimosso i residui con la soluzione detergente, posizionare il tubo PBS sulla piattaforma di carico ed eseguire i passaggi dimostrati per il tubo standard di granulometria.Quindi, pulire la punta capillare come dimostrato in precedenza e caricare il campione sEV per analizzare i dati descritti in precedenza per il tubo standard di dimensione delle particelle. I sEV purificati sono stati esaminati al microscopio elettronico a trasmissione, che ha rivelato la presenza di sEV con una morfologia a forma di coppa. È stata effettuata la citometria a flusso per i sEV.E la dimensione delle particelle variava da 40 a 200 nanometri, e la dimensione media delle particelle era di 89 nanometri. La purezza dei sEV arricchiti è risultata essere del 68,32%I marcatori proteici di sEV come CD63, CD9 e TSG101 sono stati rilevati dal western blot. GM130 è stato utilizzato come marcatore di controllo negativo dei sEV, che è stato trovato nelle cellule tissutali ma non nei sEV.È fondamentale eseguire le fasi della digestione enzimatica, dell'ultracentrifugazione differenziale e della filtrazione a membrana con la massima cura per garantire la purezza delle piccole vescicole extracellulari.

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Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

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