Name: Analisi dellafflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Impara a misurare l'afflusso di calcio nelle cellule T primarie murine mediante citometria a flusso a spettro completo. Questo metodo consente l'analisi simultanea del fenotipo superficiale senza isolamento preventivo delle sottopopolazioni.

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R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Molte grazie ai nostri colleghi di Cytek per le continue discussioni sull'analisi citometrica spettrale completa sul software Aurora e SpectroFlo. Le figure sono state create con BioRender.com.

<ol><li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation%3A+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li>
<li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+calcium+mobilization+study+%28flow+cytometry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).</li>
<li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).</li>
<li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+%28ITK%29+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+%28RLK%29+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li>
<li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).</li>
<li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase%2C+Itk%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neurosciene%22%5BJournal%5D)">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).</li>
<li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022).</li>
<li>SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022).</li>
<li>FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022).</li>
<li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+points+in+early+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li>
<li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression%2C+but+triggers+cytokine-related+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Questo protocollo descrive un saggio ottimizzato progettato per misurare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie caricate con colorante indicatore raziometrico Indo-1 titolato utilizzando la citometria a flusso a spettro completo 7,8. Il vantaggio di eseguire saggi di flusso di calcio utilizzando la citometria a flusso a spettro completo è la capacità di multiplexare la colorazione dei marcatori cellulari superficiali in combinazione con la valutaz...

L'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T (TCR) è una misura utile dell'attivazione delle cellule T e viene spesso utilizzato per determinare se una popolazione di cellule T ha risposte compromesse nelle fasi prossimali della via di segnalazione TCR1. Le misurazioni dell'afflusso di calcio vengono generalmente eseguite pre-marcando le cellule T con uno o un paio di coloranti indicatori di calcio fluorescenti e quindi esaminando i segnali fluorescenti utilizzando la citometria a flusso in tempo reale dopo la reticolazione TCR 2,3,4. Indo-1, un colorante di calcio metrico proporzionale, è eccitato dal laser UV con emissioni di picco a due diverse lunghezze d'onda dipendenti dal legame del calcio5 ed è un colorante indicatore comunemente usato per l'analisi citometrica a flusso delle risposte del calcio nei linfociti vivi. Poiché il profilo di emissione di Indo-1 è piuttosto ampio, può essere difficile combinare la valutazione di Indo-1 con l'analisi simultanea di più marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso passa-banda. Questa limitazione limita l'utilizzo dell'analisi citometrica a flusso delle risposte del calcio a popolazioni pre-purificate di cellule T o a popolazioni identificate da un insieme limitato di molecole di superficie cellulare.
Per affrontare i limiti della misurazione delle risposte del calcio su popolazioni eterogenee di linfociti primari utilizzando la citometria a flusso passa-banda, è stato sviluppato un protocollo per misurare la fluorescenza Indo-1 utilizzando la citometria a flusso a spettro completo. Questo metodo consente di multiplexare Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare, sfruttando le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo. Il vantaggio di utilizzare la citometria a flusso a spettro completo rispetto alla citometria a flusso convenzionale è la sua capacità di distinguere i segnali fluorescenti da coloranti altamente sovrapposti, aumentando così il numero di marcatori di superficie che possono essere valutati simultaneamente in ciascun campione. La citometria a flusso convenzionale utilizza filtri passa-banda ed è limitata a un fluorocromo per sistema rivelatore6. La citometria a flusso a spettro completo raccoglie segnali attraverso l'intero spettro del fluorocromo utilizzando 64 rivelatori su un sistema di citometria a flusso spettrale a cinque laser 7,8. Inoltre, la citometria a flusso a spettro completo sfrutta i rivelatori APD (Avalanche Photo Diode) che hanno una maggiore sensibilità rispetto ai rivelatori a tubo fotomoltiplicatore presenti sui citometri a flusso convenzionali8. Di conseguenza, questo approccio è ideale per le popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule mononucleate del sangue periferico o le sospensioni di cellule di organi linfoidi secondari murini, in quanto elimina la necessità di isolare specifiche popolazioni di cellule T prima della marcatura del colorante di calcio. Invece, i profili di espressione dei marcatori della superficie cellulare e il gating della citometria a flusso dopo la raccolta dei dati possono essere utilizzati per valutare le risposte al calcio in ciascuna popolazione di interesse. Come mostrato in questo rapporto, Indo-1 può essere facilmente combinato con otto anticorpi coniugati con fluorocromo, risultando in un totale di 10 firme spettrali uniche. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato a miscele di cellule provenienti da linee di topo congenitamente distinte, consentendo l'analisi simultanea delle risposte del calcio nelle cellule T wild-type rispetto a quelle di una linea di topo mirata al gene.

<table><tbody><tr><td>Piastre trattate con TC a 12 pozzetti</td><td>Cell Treat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conico</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mL con tappo</td></tr><tr><td>Provette di flusso in polistirene da 5 mL</td><td>Siringa Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>5mL</td><td>Siringa BD</td><td>309646</td><td>viene utilizzato solo sheith viene scartato</td></tr><tr><td>Filtro 70uM</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC lisi tampone</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Fluorimetro spettrale</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr>Bath<td>Beads</td><td>coleparmer</td><td>Articolo # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d Tetramero APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>Tonbo</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore cellulare</td> Strumenti di dissezione <td>scientifica</td><td></td><td></td>formale</tr><tr><td>pinza</td><td>McKesson</td><td>#487593</td><td>Pinze per tessuti McKesson Adson 4-3/4 pollici di lunghezza Acciaio inossidabile non sterile Impugnatura per pollice non bloccante 1 x 2 denti</td></tr> Strumenti di <tr><td>dissezione Forbici</td><td>McKesson</td> <td># 970135</td><td>Forbici operative McKesson Argent&trade; 4-1 / 2 pollici Acciaio inossidabile di grado chirurgico Manico ad anello Punta affilata diritta / Punta affilata</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclond</td><td>SH30071.03</td><td>lotto AE29165301</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Indo1-AM Ester Dye</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>Colorante di caricamento del calcio&nbsp;</td></tr><tr><td>ionomicina</td><td>Millipore</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Ghost 540</td><td>Tonbo</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 1,7mL</td><td>Light Labs</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina/L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688</td><td></td></tr><tr><td>Purificato Anti-Topo CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2)</td><td>Tonbo</td><td>70-0161-M001</td><td>FC Block</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>1875093</td><td>&nbsp;+ fenolo rosso</td></tr><tr><td>RPMI fenolo libero</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td>&nbsp;-fenolo rosso</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra612</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; PerCP Cy5.5</td><td>ebioscience</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&gamma;/&delta; Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr>Confezione <td></td> di<td>reagenti Vi-Cell Blu</td><td>N. prodotto: C06019</td><td>Include Tripan</td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Brand Bagno</td><td></td><td></td> secco</tr></tbody></table>

analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule t nelle cellule t murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

L'afflusso di calcio in risposta alla stimolazione del recettore delle cellule T è una misura comune della segnalazione delle cellule T. Sono stati sviluppati diversi coloranti indicatori di calcio per valutare la segnalazione del calcio mediante citometria a flusso passa-banda. Questo protocollo è progettato per misurare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie utilizzando la citometria a flusso a spettro completo. Gli splenociti totali sono marcati con il colorante indicatore raziometrico del calcio Indo-1, insieme a un pannello di anticorpi coniugati con fluorocromo alle molecole della superficie cellulare. Sfruttando le capacità della citometria a flusso a spettro completo, si fornisce una piattaforma per l'utilizzo di una vasta gamma di colorazioni della superficie cellulare in combinazione con Indo-1. Le cellule vengono quindi analizzate in tempo reale a 37 °C prima e dopo l'aggiunta di un anticorpo anti-CD3 per stimolare il recettore delle cellule T. Dopo aver mescolato i segnali spettrali, viene calcolato il rapporto tra Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio e può essere visualizzato nel tempo per ogni popolazione gated di splenociti. Questa tecnica può consentire l'analisi simultanea delle risposte del calcio in più popolazioni cellulari.

Il flusso di lavoro sperimentale per valutare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie utilizzando un colorante raziometrico Indo-1 con colorazioni superficiali multiplexing è mostrato in Figura 1. Dopo aver raccolto e processato gli splenociti di topo in una sospensione a singola cellula, le cellule vengono colorate con un estere Indo-1 AM e colorate con anticorpi legati al fluorocromo. Una volta completato il carico del colorante e la colorazione degli anticorpi, i campioni d...

L'afflusso di calcio, una misura della segnalazione delle cellule T, è un modo efficace per analizzare le risposte alla stimolazione del recettore delle cellule T. Questo protocollo per il multiplexing di Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare sfrutta le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo.

Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Il protocollo consente ai ricercatori di misurare simultaneamente la risposta al calcio nelle cellule T primarie insieme alla valutazione del loro sottogruppo e fenotipo di superficie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che evita la necessità di isolare specifici sottoinsiemi di cellule prima di esaminare le loro risposte al calcio. Per iniziare, preparare una soluzione madre di un microgrammo per microlitro di Indo-1 AM aggiungendo 50 microlitri di DMSO in una fiala contenente 50 microgrammi di Indo-1 AM. Diluire la soluzione madre in un volume appropriato di cRPMI e una concentrazione di sei microgrammi per millilitro.Posizionare il mezzo a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi utilizzare questo mezzo per diluire una sospensione cellulare precedentemente preparata con un rapporto uno-a-uno per ottenere da cinque a 6 milioni di cellule per millilitro. Successivamente, a una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto per condizione sperimentale.Preparare un singolo campione di controllo colorato per Indo-1 privo di calcio aggiungendo EGTA alle celle caricate con colorante Indo-1. Preparare un pozzo per il controllo biologico negativo senza fluorofori o colorante Indo-1. Preparare un controllo positivo Indo-1 aggiungendo ionomicina ad una concentrazione di 50 micromoli alla sospensione cellulare caricata di colorante al citometro a flusso.Inoltre, preparare un pozzo per i controlli a singola colorazione per ulteriori popolazioni cellulari utilizzando fluorofori coniugati con anticorpi. Quindi aggiungere due microgrammi di anticorpo bloccante del recettore FC per milione di cellule e incubare la piastra per 45 minuti con picchiettamento ogni 15 minuti per risospendere le cellule. Dopo l'incubazione, mescolare e rimuovere l'intero volume di cellule dalla piastra e aggiungerlo a tubi di microcentrifuga da 1,7 millilitri.Centrifugare e decantare il surnatante. Una volta lavate le celle con un millilitro di cRPMI preriscaldato, pellettare nuovamente e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in un millilitro di cRPMI e incubare ogni tubo, lasciando la parte superiore del tubo leggermente aperta per lo scambio di gas, consentendo la completa deesterificazione degli esteri AM intracellulari.Quindi, preparare un master mix di tutti gli anticorpi coniugati al fluorocromo definiti dall'utente e aggiungerlo alle cellule a riposo per un millilitro del volume cellulare. Dopo il riposo, pellet le celle e lavare il pellet riassumendo in un millilitro di cRPMI raffreddato a quattro gradi Celsius. Ripetere questo passaggio e posizionare i tubi sul ghiaccio.Risospendere i singoli campioni in 500 microlitri di cRPMI privo di rosso fenolo utilizzando un tubo di flusso in polistirene da cinque millilitri con un tappo. Per mantenere la temperatura utilizzando l'analisi del flusso di calcio, preparare un bagno di perline aggiungendo perline da bagno a un piccolo bagno d'acqua e riscaldarlo fino a 37 gradi Celsius. Tagliare con cura un tubo cronaca da 50 millilitri a metà e scartare la parte superiore del tubo.Riempire tre quarti del tubo rimanente con perline da bagno e lasciarlo raggiungere i 37 gradi Celsius nel bagno di perline. Posizionare il bagno di perline vicino a un citometro a flusso, insieme a un rack di polistirolo per posizionare il tubo. Prima dell'analisi sul citometro a flusso, riscaldare i tubi individualmente a 37 gradi Celsius per sette minuti.Accedere al software del citometro a flusso e fare clic sulla scheda Libreria. Quindi selezionare i tag fluorescenti per aggiungere Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio. Quindi selezionare il laser UV sotto i gruppi di tag fluorescenti e fare clic su Aggiungi per aggiungere un nome di tag fluorescente.Scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione laser, quindi fare clic su Salva. Continuare con la configurazione sperimentale. Fare clic sulla scheda Acquisizione, Apri/Crea un nuovo esperimento e aggiungere i tag fluorescenti desiderati all'esperimento.Creare un gruppo di riferimento e un nuovo gruppo di esempio per l'esperimento ed etichettare entrambi i gruppi. Nella scheda Acquisizioni, impostare gli eventi in modo che vengano registrati al massimo a 10 milioni, arrestando il volume al volume massimo di 3000 microlitri e il tempo di arresto al massimo su 36.000 secondi. Acquisire controlli a colorazione singola per anticorpi coniugati definiti dall'utente inclusi nel pannello multicolore e per colorante funzionale Indo-1.Aggiungere 50 micromoli di ionomicina al controllo positivo e al vortice Indo-1 legato al calcio. Aggiungere il tubo di flusso alla scheda di iniezione del campione e fare clic su Registra. Quindi aggiungere il controllo negativo Indo-1 privo di calcio al citometro a flusso e fare clic su Registra.Svuotare i controlli a macchia singola facendo clic sul pulsante Unmix. Una volta completata la miscelazione, creare grafici sequenziali utilizzando il foglio di lavoro non miscelato, ad esempio SSC-A rispetto a FSC-A, per rimuovere i detriti dal campione e SSC-A rispetto a SSC-H per rimuovere doppietti. Quindi crea porte facendo clic su Plot.Aggiungi un grafico al foglio di lavoro e fai doppio clic all'interno del cancello per creare una popolazione gated a valle. Continuare fino a quando tutte le popolazioni di interesse sono contabilizzate. Quindi, riscaldare i campioni di controllo a 37 gradi Celsius per l'analisi sequenziale.Impostare il software di citometria a flusso ed eseguire DI in acqua ghiacciata per due o tre minuti per garantire la stabilità fluidica del citometro a flusso. Impostare grafici sequenziali nel foglio di lavoro non misto creando porte utilizzando i pulsanti del rettangolo poligonale o del cancello dell'ellisse per includere la popolazione di interesse. Fate doppio clic all'interno del gate e modificate i parametri degli assi y e x impostandoli su SSC-A anziché SSC-H.Completate la definizione dei parametri dell'asse facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'asse. Creare un grafico con SSC-A rispetto al segnale di colorante di vitalità. Cancellare le cellule vive che sono negative per la colorazione del colorante amminico.Le celle vive negative per la colorazione dei morti vivi si raggrupperanno al segno zero sia sull'asse y che sull'asse x. Fare doppio clic sul grafico interno per creare un nuovo grafico contenente solo linfociti vivi a singola cellula. Modificare l'asse Y in Indo-1 rispetto al tempo sull'asse x per visualizzare l'afflusso di calcio.Quindi posizionare il campione biologico riscaldato nel SIT della macchina. Esegui i campioni a 2.500-3000 eventi al secondo su una portata media per visualizzare l'afflusso di calcio in un numero limitato di popolazioni cellulari. Aggiungere il tubo successivo al bagno di perline nel controllo dell'acquisizione.Premere Record per registrare i dati iniziali per 30 secondi per ottenere un livello basale di segnalazione del calcio nel campione. Quindi fare clic su Stop e rimuovere il tubo dalla porta di iniezione del campione. Aggiungere 30 microgrammi di anti-CD3 non coniugato direttamente nella provetta per avviare l'afflusso di calcio.Riposizionare rapidamente il tubo sulla porta di iniezione del campione e premere Record nel software. Registra i dati per sette minuti, osservando il tempo trascorso sotto i controlli di acquisizione nel software. Quindi premere Stop nel software.Aggiungere un microgrammo per millilitro di ionomicina e registrare per 30 secondi per ottenere il massimo segnale di calcio nelle cellule di interesse. Passare all'esempio successivo e ripetere il flusso di lavoro fino a quando non sono stati raccolti tutti i campioni. Salva l'esperimento e fai clic sul file zip di esportazione.I file non misti vengono caricati su un software di analisi citometrica a flusso esterno. Un segnale stabile e coerente in un grafico di tempo rispetto alla dispersione laterale indicava stabilità fluidica. La popolazione di linfociti è stata controllata seguita dalla discriminazione dei singoletti su un appezzamento di altezza di dispersione laterale rispetto all'area.I singoletti sono stati valutati per la vitalità. Quindi è stato applicato il gating sulla popolazione CD19-negativa. Questi sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando anticorpi contro CD4 e CD8 visualizzando la fluorescenza Indo-1 legata al calcio rispetto al tempo.Nelle singole popolazioni cellulari, il grafico di Indo-1 legato al calcio rispetto al tempo ha mostrato una linea di base prima della stimolazione. Una risposta di picco quando i livelli di calcio intracellulare sono diminuiti e la risposta al calcio ha suscitato l'aggiunta di ionomicina. Prima dell'aggiunta di anticorpi anti-CD3, è stato rilevato un debole segnale Indo-1 legato al calcio.Durante la risposta di picco, le cellule hanno mostrato un forte segnale Indo-1 legato al calcio e un ridotto Indo-1 privo di calcio. A cinque minuti dal picco, la fluorescenza Indo-1 è quasi tornata al basale. Dopo l'aggiunta di ionomicina, è stato visualizzato un robusto segnale di Indo-1 legato al calcio, che indica un adeguato carico di colorante delle cellule.L'analisi delle popolazioni rare è stata eseguita tracciando l'Indo-1 legato al calcio rispetto all'Indo-1 privo di calcio dopo aver individuato ciascuna popolazione di interesse. E analizzando la risposta del calcio durante l'intero corso temporale per ciascun sottoinsieme. Il flusso di calcio utilizzando la profilazione a spettro completo può portare ad un'analisi citometrica a flusso ad alto parametro in una varietà di sottogruppi immunitari.L'analisi ad alta dimensionalità per il clustering imparziale di sottoinsiemi di cellule T può essere utilizzata in combinazione con citometria a flusso ad alto parametro per analisi avanzate. Questa tecnica è sviluppata per l'analisi di più sottogruppi immunitari in combinazione tra loro in un campione di massa.

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Monitoraggio dell'attivazione delle cellule B con liposomi antigenici mediante un test del flusso di calcio

Questo video analizza l'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T. Gli anticorpi anti-CD3 attivano le vie di segnalazione delle cellule T, portando ad un aumento degli ioni calcio intracellulari che si legano con il colorante Indo-1. Nella citometria a flusso, uno spostamento dello spettro dallo stato privo di calcio allo stato legato al calcio è correlato all'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T.

Valutazione dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T utilizzando un colorante indicatore di calcio

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Questo documento descrive un metodo per misurare alloreattività in una popolazione mista di cellule T usando un flusso di imaging citometria.

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l'analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l'antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l'acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all'interno di un periodo di tempo relativamente breve.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

Fornire sensibilità unicellulare, citometria a flusso in tempo reale è in grado di quantificare le funzioni del ricevitore multimodale di culture vivono. Utilizzando cellule progenitrici neurali adulte, la funzione del recettore P2X7 è stata valutata tramite afflusso del calcio rilevato dal colorante indicatore di calcio, la formazione dei pori transmembrana dall'assorbimento di bromuro di etidio e fagocitosi utilizzando granuli di lattice fluorescente.

In tempo reale Live-cella flusso Cytometry per indagare l'afflusso del calcio, la formazione del poro e fagocitosi dai recettori P2X7 in cellule progenitrici neurali adulto

Qui presentiamo il protocollo per la ricostituzione graduale di cellule sintetiche che presentano antigene utilizzando Bead-Supported Lipid Bilayers e il loro uso per interrogare l'output sinaptico dalle cellule T attivate.

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Qui, forniamo un protocollo completo per risolvere i segnali locali iniziali di Ca2+ , noti come microdomini Ca2+ , in cellule T primarie murine e umane utilizzando la microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è una risorsa preziosa per i ricercatori che esaminano le vie di segnalazione del Ca2+ all'interno delle cellule immunitarie e per svelare ulteriormente la loro funzione.

Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Impara a misurare l'afflusso di calcio nelle cellule T primarie murine mediante citometria a flusso a spettro completo. Questo metodo consente l'analisi simultanea del fenotipo superficiale senza isolamento preventivo delle sottopopolazioni.

Analisi dellafflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo (Video) | JoVE Journal

Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

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