Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi
21 ottobre 2022
Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall'ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.
Il fluido extracellulare ippocampale e la folla mediante la tecnica di microdialisi cerebrale contribuiscono a monitorare la micro malattia specifica delle malattie nervose centrali. La microdialisi cerebrale tecnica raggiunge l'inquisizione dinamica e continua del fluido cerebrale interstiziale in specifiche regioni cerebrali di ratti non anestetizzati. Inizia fissando il ratto anestetizzato su un localizzatore cerebrale stereotassico e pulisci l'area chirurgica rasata con un tampone di iodio povidone ed etanolo tre volte prima dell'operazione.
Quindi eseguire un'incisione facciale cranica di 1,5 centimetri nel mezzo con forbici chirurgiche e rimuovere il periostio usando forbici chirurgiche e pinze oftalmiche. Considerando il bregma come posizione basale, usando un trapano cranico perforare l'endocranio per perforare un'apertura di due millimetri nella regione CA1 dell'ippocampo. Ora fissa la stilette del catetere sulla pinza di un localizzatore cerebrale stereotassico e regola la posizione dell'involucro di microdialisi nelle posizioni ventrale anteroposteriore, mediolaterale e dorsale.
Regolare la valvola dorsoventrale del localizzatore stereo cerebrale e impiantare l'involucro di microdialisi nella regione CA1 a una profondità di 3,5 millimetri. Forare altre tre aperture con un diametro di due millimetri in modo tale che le tre aperture formino un triangolo in cui l'apertura della sonda è posizionata centralmente. L'impianto si avvita nelle aperture ad una profondità di un millimetro e fissa il catetere della sonda con cemento dentale.
Quindi utilizzare una sutura chirurgica 4-O per chiudere la pelle. Collegare la microsiringa della pompa di microdialisi con il dispositivo ACSF a attività sveglia e il raccoglitore di campioni criogenici secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, per scaricare l'aria nella tubazione, impostare la pompa di microdialisi ad una velocità di un microlitro al minuto.
Quindi collegare la tubazione e la sonda di microdialisi cerebrale e azionare la pompa di microdialisi ad una velocità di un microlitro al minuto per iniettare ACSF nella sonda fino a quando la superficie della sonda è leggermente umida. Immergere la sonda in una soluzione di iniezione di eparina sodica per un uso successivo. Per raccogliere l'HECF dal ratto sveglio, inserire la sonda di microdialisi cerebrale nel catetere della sonda e posizionare il ratto in una camera con imbottitura per garantire che i ratti siano liberi di muoversi.
Accendere il controller girevole multicanale per evitare di intrecciare le tubazioni di microdialisi durante il libero movimento del ratto. Quindi accendere la pompa della microsiringa e pompare l'ACSF ad una velocità di un microlitro al minuto. Dopo un equilibrio di 60 minuti del sistema di raccolta HECF in microdialisi, raccogliere HECF periodicamente.
Dopo la terminazione del campionamento, estrarre la sonda di microdialisi cerebrale dal catetere della sonda. Immergere la sonda in acqua deionizzata e lavare con acqua deionizzata per 12 ore per rimuovere le deposizioni di sale incagliate dalla tubazione e dalla sonda. Rimuovere la sonda e inserirla in una soluzione di tripsina allo 0,05% a quattro gradi Celsius.
Il fluido extracellulare ippocampale acquisito dalla tecnica di microdialisi cerebrale è simile all'acqua, incolore e trasparente alla frequenza di campionamento impostata. Le procedure più importanti sono l'impianto della microdialisi con cura nella regione CA1 e l'inserimento della sonda nel catetere pop. La tecnica della microdialisi semplice consente di assistere il cambiamento dinamico dei marcatori di malattia in specifiche regioni del cervello, la sostanza dell'efficacia del farmaco e il catabolismo tissutale dei componenti del farmaco.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per il campionamento dinamico in tempo reale del liquido extracellulare ippocampale (HECF) da ratti svegli, mediante una tecnica di microdialisi cerebrale. Il processo consente ai ricercatori di monitorare marcatori specifici per malattia nelle patologie del sistema nervoso centrale, ottenendo campionamenti continui da regioni cerebrali specifiche senza anestetizzare gli animali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Malattie neurodegenerative
- Tecniche di microdialisi
Sfondo
- Comprendere la dinamica dei fluidi extracellulari è fondamentale per lo studio dei meccanismi neuronali e della plasticità.
- I metodi attuali prevedono generalmente tecniche invasive che possono influenzare il contesto biologico.
- La microdialisi consente il prelievo di fluido interstiziale mentre il soggetto è sveglio, fornendo dati più pertinenti.
- Questo protocollo soddisfa la necessità di un monitoraggio continuo della composizione del fluido cerebrale in modelli viventi.
Scopo dello studio
- Migliorare il monitoraggio dei marcatori della malattia nell'ippocampo implementando un approccio di campionamento non invasivo.
- Fornire un quadro metodologico dettagliato per consentire ai ricercatori di replicare la procedura.
- Stabilire un sistema affidabile per osservare gli effetti dei farmaci e i cambiamenti metabolici nel tempo.
Metodi Utilizzati
- Lo studio utilizza un sistema di microdialisi impiantato nella regione CA1 dell'ippocampo.
- Ratti svegli e non anestetizzati fungono da modello biologico per il campionamento dell'HECF.
- La tecnica di microdialisi misura il fluido a una velocità di un microlitro al minuto.
- I passaggi critici includono l'impianto preciso del catetere, l'equilibrazione e intervalli regolari di campionamento.
- La pulizia della sonda di microdialisi dopo il campionamento viene effettuata per garantire l'integrità dei dati.
Risultati principali
- L'HECF raccolto è limpido e incolore, consentendo l'analisi dei marcatori della malattia.
- Una metodologia approfondita permette esperimenti sui cambiamenti dinamici degli ambienti neuronali.
- Le informazioni ottenute con questo metodo possono contribuire alla valutazione dell'efficacia dei farmaci e alla comprensione del catabolismo tissutale.
Conclusioni
- Questo studio dimostra il potenziale della microdialisi nel migliorare la comprensione della dinamica dei fluidi cerebrali e dei processi patologici.
- La capacità di monitoraggio continuo consente la valutazione di modifiche in tempo reale nell'azione dei farmaci e negli stati metabolici.
- Queste informazioni sono fondamentali per potenziare le strategie di intervento nelle malattie neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La raccolta dinamica in tempo reale del liquido extracellulare ippocampale (HECF) in ratti coscienti permette il monitoraggio diretto dei cambiamenti neurochimici rilevanti per l'evoluzione delle malattie del sistema nervoso centrale e per l'efficacia dei farmaci. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nelle neuroscienze traslazionali fornendo dati quantitativi sui biomarcatori risolti nel tempo, provenienti da regioni cerebrali rilevanti per la patologia. L'approccio supporta la fase iniziale della scoperta e la riduzione del rischio meccanicistico nei portafogli di neuroterapie mirate ai percorsi ippocampali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della dinamica neurochimica alla base dei meccanismi delle malattie del sistema nervoso centrale in vivo.
- Supporta la validazione funzionale degli bersagli quantificando gli effetti di farmaci e metaboliti nell'ippocampo.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico mediante la misurazione diretta di marcatori extracellulari rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un campionamento quantitativo validato del fluido extracellulare cerebrale per l'analisi di composti successivi.
- Permette la raccolta riproducibile e standardizzata di dati neurochimici in modelli animali svegli.
- Supporta lo sviluppo di saggi per la valutazione delle risposte farmacodinamiche a composti attivi sul sistema nervoso centrale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la misurazione dei biomarcatori preclinici a endpoint rilevanti per la malattia nelle neuroscienze traslazionali.
- Consente una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica monitorando in vivo gli effetti dinamici dei farmaci.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, fondate su letture neurochimiche in tempo reale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di microdialisi si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un'analisi quantitativa in tempo reale del liquido extracellulare ippocampale in ratti coscienti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi per i bersagli del sistema nervoso centrale monitorando le variazioni dinamiche dei biomarcatori.
- Screening: Fornisce dati neurochimici pronti per i saggi e riproducibili per la valutazione dei composti.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi per confrontare gli effetti dei farmaci e gli stati patologici in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega studi preclinici e studi traslazionali allineando la misurazione dei biomarcatori con gli endpoint clinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per i flussi di lavoro nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale e nella validazione dei biomarcatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Standardizza il campionamento neurochimico e migliora la riproducibilità tra gli studi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo e l'efficienza del capitale fornendo dati biomolecolari utilizzabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati a terapie neurologiche in base al rischio, basandosi su evidenze dinamiche in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica e impianto di sonde per microdialisi.
- Necessita di strumentazione specializzata per il campionamento mediante microdialisi e per l'analisi quantitativa.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le velocità di campionamento e i protocolli analitici.
- L'adattamento a diverse regioni cerebrali o modelli di malattia potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- Il campionamento è limitato ad analiti con massa inferiore a 20 kDa a causa delle specifiche di cutoff della sonda.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
