Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall'ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.

Il fluido extracellulare ippocampale e la folla mediante la tecnica di microdialisi cerebrale contribuiscono a monitorare la micro malattia specifica delle malattie nervose centrali. La microdialisi cerebrale tecnica raggiunge l'inquisizione dinamica e continua del fluido cerebrale interstiziale in specifiche regioni cerebrali di ratti non anestetizzati. Inizia fissando il ratto anestetizzato su un localizzatore cerebrale stereotassico e pulisci l'area chirurgica rasata con un tampone di iodio povidone ed etanolo tre volte prima dell'operazione.

Quindi eseguire un'incisione facciale cranica di 1,5 centimetri nel mezzo con forbici chirurgiche e rimuovere il periostio usando forbici chirurgiche e pinze oftalmiche. Considerando il bregma come posizione basale, usando un trapano cranico perforare l'endocranio per perforare un'apertura di due millimetri nella regione CA1 dell'ippocampo. Ora fissa la stilette del catetere sulla pinza di un localizzatore cerebrale stereotassico e regola la posizione dell'involucro di microdialisi nelle posizioni ventrale anteroposteriore, mediolaterale e dorsale.

Regolare la valvola dorsoventrale del localizzatore stereo cerebrale e impiantare l'involucro di microdialisi nella regione CA1 a una profondità di 3,5 millimetri. Forare altre tre aperture con un diametro di due millimetri in modo tale che le tre aperture formino un triangolo in cui l'apertura della sonda è posizionata centralmente. L'impianto si avvita nelle aperture ad una profondità di un millimetro e fissa il catetere della sonda con cemento dentale.

Quindi utilizzare una sutura chirurgica 4-O per chiudere la pelle. Collegare la microsiringa della pompa di microdialisi con il dispositivo ACSF a attività sveglia e il raccoglitore di campioni criogenici secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, per scaricare l'aria nella tubazione, impostare la pompa di microdialisi ad una velocità di un microlitro al minuto.

Quindi collegare la tubazione e la sonda di microdialisi cerebrale e azionare la pompa di microdialisi ad una velocità di un microlitro al minuto per iniettare ACSF nella sonda fino a quando la superficie della sonda è leggermente umida. Immergere la sonda in una soluzione di iniezione di eparina sodica per un uso successivo. Per raccogliere l'HECF dal ratto sveglio, inserire la sonda di microdialisi cerebrale nel catetere della sonda e posizionare il ratto in una camera con imbottitura per garantire che i ratti siano liberi di muoversi.

Accendere il controller girevole multicanale per evitare di intrecciare le tubazioni di microdialisi durante il libero movimento del ratto. Quindi accendere la pompa della microsiringa e pompare l'ACSF ad una velocità di un microlitro al minuto. Dopo un equilibrio di 60 minuti del sistema di raccolta HECF in microdialisi, raccogliere HECF periodicamente.

Dopo la terminazione del campionamento, estrarre la sonda di microdialisi cerebrale dal catetere della sonda. Immergere la sonda in acqua deionizzata e lavare con acqua deionizzata per 12 ore per rimuovere le deposizioni di sale incagliate dalla tubazione e dalla sonda. Rimuovere la sonda e inserirla in una soluzione di tripsina allo 0,05% a quattro gradi Celsius.

Il fluido extracellulare ippocampale acquisito dalla tecnica di microdialisi cerebrale è simile all'acqua, incolore e trasparente alla frequenza di campionamento impostata. Le procedure più importanti sono l'impianto della microdialisi con cura nella regione CA1 e l'inserimento della sonda nel catetere pop. La tecnica della microdialisi semplice consente di assistere il cambiamento dinamico dei marcatori di malattia in specifiche regioni del cervello, la sostanza dell'efficacia del farmaco e il catabolismo tissutale dei componenti del farmaco.