Name: Estrazione dinamica continua del sangue dal cuore di ratto tramite tecnica di microdialisi non invasiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Scopri la raccolta dinamica non invasiva del sangue dal cuore di ratto tramite microdialisi. Questa tecnica consente il monitoraggio in tempo reale dei biomarcatori per lo studio delle malattie cardiovascolari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82104533), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della provincia del Sichuan (2021YJ0175) e dal progetto chiave di ricerca e sviluppo del Piano provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2022YFS0438). Nel frattempo, gli autori desiderano ringraziare Yuncheng Hong, ingegnere senior delle apparecchiature presso TRI-ANGELS D & H TRADING PTE. LTD. (Singapore city, Singapore), per la fornitura di servizi tecnici per le tecniche di microdialisi.

Il protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato amministrativo dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (numero di registrazione: 2021-11). I ratti maschi specifici di Sprague Dawley (SD) privi di agenti patogeni (8-10 settimane, 260-300 g) sono stati allevati in gabbie di ventilazione indipendenti, mantenendo l'ambiente di laboratorio a 22 °C e al 65% di umidità relativa, e sono stati utilizzati per il presente studio. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Tutti i ratti erano abituati all'alimentazione adattiva per 1 settimana con acqua e dieta gratuite durante il periodo.
1. Preparazione sperimentale
<ol><li>Assemblare l'apparecchiatura coinvolta nella microdialisi del prelievo di sangue (vedere Tabella dei materiali), come mostrato nella Figura 1.</li>
	<li>Preparare la soluzione di destrosio citrato anticoagulante (ACD), contenente 3,50 mmol/L di citrato, 7,50 mmol/L di citrato di sodio e 13,60 mmol/L di glucosio, come liquido di perfusione per la raccolta del sangue in microdialisi (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Prima dell'uso, filtrare gli ACD con un'unità di filtrazione a membrana da 0,22 μm e rimuovere le bolle ad ultrasuoni. Mantenere gli ACD a 37 °C per ridurre la stimolazione per i ratti SD.</li>
</ol>2. Ispezione della pervietà del sistema di tubazioni di microdialisi
<ol><li>Collegare l'ingresso della sonda dell'unità di dialisi con l'ago della siringa, l'adattatore per tubi e il tubo fep (vedere Tabella dei materiali). NOTA: L'estremità blu della sonda di microdialisi è per l'afflusso di fluido e l'estremità trasparente è per il deflusso del fluido.</li>
	<li>Controllare la pervietà del sistema di tubazioni in microdialisi perfondendo ACD18 nel sistema di tubazioni ad una velocità di 2 μL/min. NOTA: Se gli ACD fluiscono dal sito di raccolta dei campioni, il sistema di microdialisi senza ostacoli può essere utilizzato per un'ulteriore raccolta di sangue cardiaco. In caso contrario, la sonda del sangue deve essere controllata per verificare la presenza di perdite rotte o se il giunto tubo-tubo è stato sigillato.</li>
</ol>3. Impianto della sonda di microdialisi
<ol><li>Anestetizzare i ratti con isoflurano al 2% in una miscela aria-ossigeno di 0,6 L/min, fissare i ratti completamente incoscienti sul tavolo operatorio e mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando un mantenitore della temperatura animale (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Rimuovere la pelliccia dal collo con un rasoio elettrico e disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di betadine e alcol al 70%. Iniettare bupivacaina (1,5 mg/kg) nel ratto. Esporre la vena giugulare destra mediante dissezione smussata dei tessuti molli e della fascia perivascolare attraverso un'incisione di 1,5 cm lungo la linea mediana del collo. NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici e gli strumenti utilizzati nell'esperimento devono essere sterilizzati in anticipo mediante autoclave. Utilizzare guanti sterili e teli chirurgici. L'intera operazione sperimentale deve essere eseguita in un ambiente sterile. Seguire le linee guida locali sull'uso degli animali per l'anestesia e il regime di analgesia.</li>
	<li>Fai un nodo staccabile usando una sutura chirurgica 4-0 nella vena giugulare destra all'estremità distale del cuore per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno e fai un'incisione di 1,5 cm nella vena giugulare destra vicino al cuore.</li>
	<li>Inserire uno stiletto per catetere a forma di ago (lunghezza 25 mm, diametro 0,7 mm, vedere Tabella dei materiali) nella vena giugulare destra verso l'estremità prossimale del cuore di ratto, inserire la sonda di microdialisi del sangue (lunghezza totale della sonda 24 mm, lunghezza della membrana 10 mm) in un catetere e impiantare la sonda con una pinza oftalmica lungo l'incisione obliqua dello stiletto del catetere19.</li>
	<li>Rimuovere lo stiletto del catetere guidato e immergere completamente la membrana semipermeabile della sonda (lunghezza della membrana 10 mm, diametro della membrana 0,5 mm) nella vena giugulare destra. Sbroglia il nodo staccabile all'estremità distale del cuore per ripristinare il flusso sanguigno nella vena giugulare destra.</li>
	<li>Legare la sonda con la vena giugulare destra utilizzando suture chirurgiche 4-0 e infilare sottocutaneamente il tubo coda della sonda attraverso la parte posteriore del collo. Vedere la Figura 2 per le fasi specifiche di impianto della sonda. NOTA: Il cut-off molecolare della sonda di microdialisi del sangue utilizzata in questo studio è di >20 kD. I campioni di sangue raccolti contengono sostanze con un peso molecolare inferiore a 20 kD.</li>
</ol>4. Campionamento in microdialisi
<ol><li>Una settimana dopo l'impianto della sonda di microdialisi, i ratti che si stanno riprendendo da un trauma chirurgico vengono sottoposti a campionamento di microdialisi. Posizionare il ratto sveglio in un serbatoio a movimento libero (vedere Tabella dei materiali) e collegare la sonda al sistema di microdialisi. Equilibrare la membrana di dialisi della sonda irrigando ACD con una velocità di 2 μL/min per 1 ora.</li>
	<li>Raccogliere campioni di sangue in microdialisi ad una velocità di flusso di 2 μL/min e conservarli temporaneamente in un contenitore frazionato a 4 °C. NOTA: I campioni di sangue ottenuti potrebbero essere testati direttamente centrifugando a 20.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Oppure potrebbe essere conservato a -80 °C per i test successivi. Quando si raccolgono campioni, è sempre importante osservare se la sonda prolasso e / o fuoriesce.</li>
</ol>5. Operazione post-campionamento
<ol><li>Anestetizzare i ratti SD con isoflurano al 2% in una miscela aria-ossigeno a 0,6 L/min.</li>
	<li>Sezionare per riconfermare che la sonda è nella vena giugulare destra. Rimuovere la sonda di microdialisi dalla vena giugulare destra e metterla in acqua ultrapura.</li>
	<li>Infine, eutanasia i ratti per inalazione di isoflurano al 5%.</li>
	<li>Collegare la sonda alla tubazione e risciacquare per una notte a una velocità di 2 μL/min con acqua ultrapura per lavare completamente il sale residuo nel tubo e nella sonda.</li>
	<li>Rimuovere la sonda e immergerla in acqua ultrapura. Conservare a 4 °C per evitare che la membrana di dialisi della sonda si contragga. NOTA: Se il volume del liquido di dialisi è incoerente con il volume del liquido di perfusione, la sonda può essere bloccata dal sangue coagulato. La sonda può essere posizionata nella soluzione proteica pancreatica fino a quando la sostanza visibile si sfalda dalla punta della membrana della sonda.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le CVD sono una malattia cronica comune nelle cliniche con incidenza gradualmente crescente in Cina, e l'età di esordio tende ad essere più giovane, causando la preoccupazione e il panico della maggior parte dei pazienti20,21. Essendo la principale causa di morte nel mondo, le malattie cardiovascolari possono indurre infarto cerebrale e altre malattie ad alta mortalità, minacciando seriamente la vita sana dei pazienti22. CVD, tra cui cardi...

Con l'accelerazione del ritmo di vita e l'aumento della pressione psicologica, le malattie cardiovascolari (CVD) tendono a verificarsi nelle persone giovani, di mezza età e anziane 1,2. La morbilità e la mortalità delle CVD sono elevate, con le caratteristiche di insorgenza acuta, rapida progressione e un lungo decorso della malattia, che influiscono seriamente sulla sicurezza dei pazienti3. L'insorgenza di CVD può essere strettamente correlata ai cambiamenti in alcuni componenti del sangue, come colesterolo, lipidi sierici, glicemia, enzimi miocardici e protein chinasi K 4,5,6. La situazione rilevante del paziente può essere gestita più rapidamente analizzando gli elementi di esame del sangue di routine. Quindi, la qualità dei campioni di sangue determina l'accuratezza dei risultati del test. Tuttavia, i metodi convenzionali per la raccolta del sangue presentano alcuni inevitabili inconvenienti, che influiscono seriamente sui risultati sperimentali, come l'ampia area traumatizzata, il piccolo volume di raccolta del sangue, gli elevati requisiti per gli operatori, l'incapacità di riflettere i cambiamenti del farmaco in tempo reale, il pretrattamento ingombrante del campione di sangue, il grande consumo di animali da esperimento e il mancato rispetto dei requisiti etici degli animali 7,8,9 . Con i continui progressi della tecnologia medica, anche la qualità della raccolta del sangue ha avanzato requisiti più elevati. Pertanto, è urgente sviluppare una nuova tecnologia di prelievo del sangue per superare le carenze di cui sopra.
La microdialisi è una tecnica di campionamento in vivo basata sui principi della dialisi10. In condizioni di non equilibrio, i composti da misurare sono diffusi e perfusi dal tessuto lungo il gradiente di concentrazione nella sonda di microdialisi incorporata nel tessuto nel dializzato, che viene continuamente rimosso insieme al dializzato, raggiungendo lo scopo di campionamento dal tessuto vivente11,12. Rispetto ai metodi di campionamento tradizionali, la tecnica di microdialisi presenta splendidi vantaggi nei seguenti aspetti13,14,15: monitoraggio continuo in tempo reale delle variazioni dei vari composti nel sangue; il campionamento non richiede noiose operazioni preliminari e può rappresentare realmente la concentrazione del composto bersaglio nel sito di campionamento; le sonde possono essere impiantate in diverse parti del corpo per studiare l'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo, l'escrezione e la tossicità dei composti bersaglio; il campione acquisito non contiene macromolecole biologiche (>20 kD). Pertanto, i campioni di sangue di qualità superiore garantiscono una migliore interpretazione delle CVD e del meccanismo trattato dalla medicina etnica.
I sistemi di campionamento per microdialisi sono generalmente costituiti da pompe di microiniezione, tubi di collegamento, vasche di movimentazione prive di animali, sonde di microdialisi e collettori di campioni16. Come parte più critica del dispositivo del sistema di microdialisi, le comuni sonde di microdialisi comprendono sonde concentriche, sonde flessibili, sonde lineari e sonda shunt17. Tra queste, le sonde flessibili sono sonde morbide e non metalliche, utilizzate principalmente per raccogliere campioni da vasi sanguigni e tessuti periferici come cuore, muscoli, pelle e grasso di animali svegli e liberamente in movimento o anestetizzati13. A contatto con vasi sanguigni o tessuti, la sonda può essere piegata in modo flessibile, evitando così danni irreversibili alla sonda o al sito di campionamento. Con il continuo sviluppo della tecnologia delle sonde, anche l'applicazione della tecnologia di microdialisi in vari campi si sta approfondendo. In questo articolo, il sangue del cuore di ratto è stato acquisito dinamicamente e continuamente dalla tecnologia di microdialisi non invasiva attraverso la sonda flessibile progettata per la raccolta del sangue.

<table><tbody><tr><td>Sistema per anestesia animale</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Mantenitore di temperatura animale</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Sonda per microdialisi del sangue</td><td>  Catetere per microdialisi CMA AB</td><td>T55347</td><td></td></tr><tr><td></td><td> CMA Microdialisi AB</td><td>T55347</td><td></td></tr><tr><td>Citrato</td><td>Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>CP-5200</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Fep</td><td>  CMA Microdialisi AB</td><td>3409501</td><td></td></tr><tr><td>Vasca a movimento libero per animali</td><td> CMA Microdialisi AB</td><td>CMA120</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>F21020-16</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>FS221</td><td></td></tr><tr><td>Microdialisi tubo di raccolta</td><td>  CMA Microdialysis AB</td><td>7431100</td><td></td></tr><tr><td>Collettore per microdialisi</td><td>  CMA Microdialisi AB</td><td>CMA4004</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per microdialisi in vitro</td><td> CMA Microdialisi AB</td><td>CMA130</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per microiniezione per microdialisi</td><td>  CMA Microdialisi AB</td><td>788130</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per microdialisi (1,0 ml)</td><td>  CMA Microdialysis AB</td><td>8309020</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per tubi per microdialisi</td><td>  CMA Microdialisi AB</td><td>3409500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtrante microporosa</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td></td><td></td>R0DB36622</tr><tr><td>Suture chirurgiche non assorbibili</td><td>Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd</td><td>S19004</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo operatorio</td><td>Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>30153</td><td></td></tr><tr><td>Pinze oftalmiche</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>1613859</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley  (SD) ratti</td><td>Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd</td><td>SYXK(<img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/64531/64531eq01.jpg" style="margine: auto; ">)2019-049</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>S14014-15</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd</td><td>BY-103</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>  CMA Microdialisi AB</td><td>T55347</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd</td><td>KMH1-240W8101</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione dinamica continua del sangue dal cuore di ratto tramite tecnica di microdialisi non invasiva

Dynamic Continuous Blood Extraction from Rat Heart via Noninvasive Microdialysis Technique

L'analisi dinamica dei componenti del sangue è di grande importanza per comprendere le malattie cardiovascolari e le loro malattie correlate, come l'infarto miocardico, l'aritmia, l'aterosclerosi, l'edema polmonare cardiogeno, l'embolia polmonare e l'embolia cerebrale. Allo stesso tempo, è urgente superare la tecnica di campionamento continuo del sangue cardiaco nei ratti vivi per valutare l'efficacia della terapia di medicina etnica distintiva. In questo studio, una sonda di microdialisi del sangue è stata impiantata nella vena giugulare destra dei ratti in una procedura chirurgica precisa e non invasiva. I campioni di sangue cardiaco sono stati quindi raccolti a una velocità compresa tra 2,87 nL / min e 2,98 ml / min collegandosi a un sistema di raccolta di campioni di microdialisi online. Ancora più importante, i campioni di sangue acquisiti possono essere temporaneamente conservati in contenitori di microdialisi a 4 °C. Il programma di raccolta continua del sangue online basato sulla microdialisi dal cuore di ratto ha notevolmente garantito la qualità dei campioni di sangue, facendo progredire e rinvigorire la razionalità scientifica della ricerca sulle malattie cardiovascolari sistemiche e valutando la terapia etnomedica dal punto di vista dell'ematologia.

Il presente protocollo ha permesso di ottenere il sangue cardiaco da ratti coscienti secondo i parametri di campionamento impostati nell'apparecchiatura di microdialisi. I campioni di sangue normali devono essere rosso vivo, mentre gli animali con ipossia, potenziali coaguli di sangue o malattie anemiche possono avere viola scuro o rosso scuro. I campioni ottenuti attraverso la tecnica di microdialisi del sangue sono incolori, chiari e trasparenti, che possono essere utilizzati per analizzare i marcatori sierici di diver...

Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per la raccolta dinamica e in tempo reale del sangue del cuore di ratto utilizzando la tecnica della microdialisi.

Estrazione dinamica continua del sangue dal cuore di ratto tramite tecnica di microdialisi non invasiva

Dynamic analysis of blood components is of great importance in understanding cardiovascular diseases and their related diseases, such as myocardial ...

La nostra tecnica di raccolta dinamica continua del sangue da un cuore di ratto è molto importante per analizzare i componenti del sangue, contribuendo alla comprensione delle malattie cardiovascolari e delle loro malattie correlate. Rispetto ai metodi di campionamento tradizionali, questa tecnica presenta i vantaggi di essere in vivo, in tempo reale, dinamica e non invasiva, senza micromolecole biologiche e pre-processo di campionamento del titolo per un test esterno. Questa tecnica non è applicabile solo alle malattie cardiovascolari, ma dovrebbe anche funzionare per la diagnosi e il trattamento delle malattie rilevando biomarcatori del sangue combinati con cromatografia liquida ad alta fase e spettrometria di massa.Questo metodo può essere utilizzato per studiare malattie cardiovascolari come infarto miocardico, apnea e aterosclerosi. Inoltre, si applica anche all'edema polmonare cardiogeno e all'embolia polmonare e cerebrale. Dopo aver eseguito la preparazione sperimentale, collegare l'ingresso della sonda dell'unità di dialisi con l'ago della siringa, l'adattatore del tubo e il tubo FEP.Controllare la pervietà del sistema di tubazioni di microdialisi perfondendo la soluzione d

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Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere il liquido interstiziale cardiaco dal cuore isolato del ratto perfuso. Per separare fisicamente il transudato interstiziale dal perfusato effluente venoso coronarico, il cuore perfuso di Langendorff viene invertito e il liquido intradito (transversato) formato sulla superficie cardiaca viene raccolto usando un tappo morbido in lattice.

Il modello invertito del cuore per la raccolta di transudati interstiziali dal cuore isolato del ratto

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Qui, descriviamo una configurazione per la registrazione simultanea di elettrocardiografia e pressione sanguigna intra-arteriosa (BP) in ratti sperimentali, che possono essere fatto con attrezzatura standard in strutture per animali e possono essere applicati a fisiologiche o farmacologiche studi per studiare i meccanismi patogeni o terapeutici nella medicina cardiovascolare.

Elettrocardiografia simultanea registrazione e invasiva sangue pressione misura in ratti

Questo articolo presenta un metodo efficiente per eseguire l'ischemia miocardiale e la successiva riperfusione cronica nei ratti utilizzando un approccio minimamente invasivo. Inoltre, la funzione emodinamica ventricolare sinistra dei ratti è valutata con ecocardiografia e metodi isolati del cuore di lavoro.

Metodo semi-minimo invasivo per indurre l'infarto miocardico nei ratti e la valutazione della funzione cardiaca da parte di un sistema cardiaco funzionante isolato

Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

Il presente protocollo descrive la cannulazione aortica e la perfusione retrograda del cuore murino neonatale ex-vivo .  Una strategia per due persone, utilizzando un microscopio di dissezione e un ago smussato di piccolo calibro, consente una cannulazione affidabile. La quantificazione della tensione contrattile longitudinale si ottiene utilizzando un trasduttore di forza collegato all'apice del ventricolo sinistro.

Tecnica modificata per l'uso di cuori murini neonatali nella preparazione di Langendorff

Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall'ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.

Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

Il protocollo mostra ripetute raccolte di liquido cerebrospinale e sangue da ratti epilettici eseguite in parallelo con il monitoraggio continuo del video-elettroencefalogramma (EEG). Questi sono fondamentali per esplorare i possibili collegamenti tra i cambiamenti in varie molecole del fluido corporeo e l'attività convulsiva.

Campionamento del liquido cerebrospinale e del sangue dalla vena caudale laterale nei ratti durante le registrazioni EEG

Questo protocollo descrive un metodo per misurare la pressione e il volume ventricolare sinistro utilizzando la tecnica della conduttanza pressione-volume. Questo metodo consente un monitoraggio continuo in tempo reale degli effetti dei farmaci sul cuore.

Rilevamento in tempo reale degli effetti dell'acido ferulico sul ventricolo sinistro del ratto utilizzando un catetere di conducibilità pressione-volume

Questo protocollo delinea la fabbricazione avanzata di materiali e metodi di cuore di ratto ex vivo per la biointerfaccia bidirezionale ottica ed elettrica, consentendo una stimolazione cardiaca precisa, la registrazione e la modellazione dell'infarto per la ricerca bioelettronica.

Interfacce elettriche e optoelettroniche bidirezionali in cuori di ratto sani e ischemici ex vivo

Scopri la raccolta dinamica non invasiva del sangue dal cuore di ratto tramite microdialisi. Questa tecnica consente il monitoraggio in tempo reale dei biomarcatori per lo studio delle malattie cardiovascolari.

Estrazione dinamica continua del sangue dal cuore di ratto tramite tecnica di microdialisi non invasiva

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