Autofluorescenza per valutare la fisiologia delle alghe rosse
17 febbraio 2023
Il presente protocollo descrive l'imaging autofluorescenza passo-passo e la valutazione dei cambiamenti ficobiliproteici nelle alghe rosse sulla base dell'analisi spettrale. Questo è un metodo privo di etichette e non distruttivo per valutare l'adattamento cellulare ad habitat estremi, quando è disponibile solo materiale scarso e le cellule crescono lentamente, o per niente, in condizioni di laboratorio.
Questo protocollo microscopico confocale permetterà l'interpretazione del comportamento ecologico e degli adattamenti delle microalghe da ambienti estremi con crescita lenta in laboratorio utilizzando l'autofluorescenza dei loro pigmenti. Questa tecnica non è invasiva e riduce al minimo gli artefatti in quanto non vengono utilizzati composti chimici. Conoscere le prestazioni dei pigmenti degli autotrofi e la corrispondente crescita permetterà la progettazione dei metodi di controllo che è il più grande interesse per le grotte turistiche e i monumenti architettonici.
Iniziare a preparare l'inoculo di Chroothece mobilis trasferendolo dalla coltura di agar al mezzo di acqua di mare o al mezzo liquido SWES. Mantenere tutte le colture per due settimane con un periodo di foto scure da 16 a 8 a 20 gradi Celsius sotto una bassa intensità di luce bianca e senza agitare fino ad ottenere la densità cellulare desiderata. Utilizzare un millilitro della coltura di fase esponenziale con cinque volte 10 alla terza cella per millilitro di densità cellulare da inoculare in una piastra a 24 pozzetti per diversi esperimenti.
Per riprodurre l'effetto di luce monocromatica, utilizzare il filtro verde che consente alla luce verde di passare da 470 a 570 nanometri con un picco alla lunghezza d'onda di 506 nanometri e alla luce rossa regolata utilizzando un filtro tra 590 e 720 nanometri e picchi a 678 nanometri. Esporre le colture cellulari a questa luce per due settimane. Accendere tutti i componenti del microscopio a scansione laser confocale invertito, incluso il laser.
Montare le celle nel mezzo di crescita SWES da ciascun pozzetto sperimentale della piastra a 24 pozzetti su un piatto di vetro da 35 millimetri per l'imaging. Scegli l'obiettivo ad immersione numerica 63X o 1,30 o NA glicerolo e posiziona il glicerolo sull'obiettivo. Quindi, posizionare la piastra del pozzetto sul palco del microscopio assicurandosi che il campione non si muova durante l'acquisizione dell'immagine.
Centrare il campione nel percorso della luce e concentrarsi sul centro della cella selezionando il piano con la più alta intensità di fluorescenza. Una volta fatto, apri il software di acquisizione delle immagini e scegli XY lambda dall'elenco a discesa nella modalità di acquisizione. Selezionare la linea di eccitazione del laser 561 nanometri, otto bit di gamma dinamica e 1024 per 1024 pixel.
Raccogli gli spettri di emissione di fluorescenza nella larghezza di banda di 10 nanometri e la dimensione del passo lambda di quattro nanometri nell'intervallo da 570 a 760 nanometri. Impostare il foro stenopeico su un'unità d'aria ed eseguire l'acquisizione della scansione lambda. Dopo aver ripetuto questo processo in diversi campi visivi e nelle diverse condizioni di luci rosse e verdi, salvare tutti i dati.
Una volta acquisita la scansione lambda, fare clic sulla finestra di quantificazione nella parte superiore del software per valutare gli spettri di emissione di fluorescenza raccolti. Vai alla finestra aperta del progetto e seleziona un file lambda XY. Selezionare l'analisi del profilo impilato nel software di imaging e definire una regione di interesse di quattro micrometri quadrati al centro di una cella per analizzare l'intensità media della fluorescenza.
Esporta i dati e il CSV prima di ripetere il processo con celle diverse in condizioni diverse. Successivamente, aprire i file CSV per selezionare i diversi picchi di emissione di fluorescenza di tutte le regioni di interesse misurate selezionando i dati di massima fluorescenza di ficoeritrina ficocianina, C.phycocyanin, allophycocyanin e clorofilla A rispettivamente nel file CSV. Una volta fatto, creare una nuova tabella con tutti i valori massimi di fluorescenza ottenuti da ciascun picco di ficobiliproteine e clorofilla e tracciare i dati su un grafico.
Sono state osservate differenze significative nell'intensità media della fluorescenza. L'intensità media di fluorescenza della ficoeritrina ficocianobilina è diminuita significativamente quando le cellule sono state esposte a luce verde monocromatica. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenza nella luce rossa rispetto al controllo.
La luce verde ha avuto l'effetto opposto sull'alloficocianina e sulla clorofilla A in cui l'intensità media della fluorescenza è aumentata significativamente a causa dell'adattamento dei complessi di antenne a causa dell'aumento della quantità o della migliore connettività dei complessi di antenne, tra gli altri. La luce rossa ha prodotto un aumento non significativo della fluorescenza dell'alloficocianina e della clorofilla. Per studiare l'effetto delle diverse condizioni di crescita sulle cellule in coltura, è fondamentale eseguire le misurazioni esattamente con le stesse impostazioni del microscopio.
E' possibile analizzare altri parametri ambientali rilevanti per la coltura di organismi di autofluorescenza, nonché il segnale di fluorescenza all'interno dello spettro visibile. Questa tecnica è un approccio molto potente per studiare organismi viventi con diversi pigmenti di autofluorescenza.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo non distruttivo per valutare i cambiamenti delle ficobiliproteine nelle alghe rosse utilizzando l'imaging autofluorescenza. È particolarmente utile per studiare gli adattamenti cellulari in ambienti estremi dove i metodi di coltura tradizionali sono difficili.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ecologia
Contesto
- Le microalghe spesso abitano ambienti estremi.
- I metodi di crescita in laboratorio tradizionali potrebbero non essere efficaci.
- L'imaging autofluorescenza fornisce un'analisi senza etichette.
- Questa tecnica minimizza gli artefatti evitando composti chimici.
Obiettivo dello studio
- Analizzare il comportamento ecologico delle microalghe.
- Comprendere gli adattamenti agli habitat estremi.
- Sviluppare metodi per monitorare le prestazioni degli autotrofi.
Metodi utilizzati
- Preparazione dell'inoculo da coltura su agar a mezzo marino.
- Mantenimento delle colture in condizioni specifiche di luce e temperatura.
- Utilizzo della microscopia confocale per l'imaging.
- Valutazione dell'autofluorescenza dei pigmenti per l'analisi.
Risultati principali
- Imaging riuscito delle ficobiliproteine nelle alghe rosse.
- Intuition sulle adattazioni ecologiche delle microalghe.
- Dimostrata l'efficacia delle tecniche non invasive.
- Potenziali applicazioni nel monitoraggio di ambienti come le grotte turistiche.
Conclusioni
- L'imaging autofluorescenza è uno strumento prezioso per studiare le microalghe.
- Questo metodo può aiutare a comprendere le dinamiche ecologiche.
- Apri nuove strade per ulteriori ricerche in ambienti estremi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Autofluorescence imaging of red algae pigments enables non-invasive, quantitative assessment of photosynthetic adaptation under variable light conditions, supporting early-stage discovery in photosynthetic organism research. This approach is particularly valuable for evaluating physiological responses in slow-growing or extreme-environment strains, where traditional culturing is impractical. The method enhances predictive confidence in selecting and optimizing model systems for biopharma R&D pipelines focused on photosynthetic biology and pigment-based functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of pigment adaptation mechanisms at the cellular level.
- Supports functional validation of photosynthetic targets under controlled light conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying pigment responses to environmental variables.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible fluorescence readouts for assay development.
- Allows preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
- Enables quantitative comparison of pigment responses across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pigment adaptation data with environmental relevance for translational model selection.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in photosynthetic research.
- Reduces risk in advancing slow-growing or extreme-environment strains for further study.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for photosynthetic organism research, enabling robust hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Quantifies pigment adaptation to light, clarifying photosynthetic pathway responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides emission spectra and intensity data for statistical comparison of experimental variables.
- Translational Research: Informs model selection for studies in environmentally relevant or extreme conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, non-destructive platform for pigment-based physiological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pigment function and adaptation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for advancing photosynthetic models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of slow-growing or extreme-environment strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and spectral analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of microscope settings for cross-condition comparability.
- May require adaptation for different pigment profiles or organism types.
- Limited to organisms with detectable autofluorescent pigments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Sample Preparation for Reproducing Monochromatic Light Effect
1:50
Autofluorescence Imaging
3:16
Parameters to Evaluate Chroothece’s Physiology
4:21
Results: Autofluorescence Imaging and Evaluation of Phycobiliprotein Changes in Red Algae Based on Spectral Analysis
5:08
Conclusion
