Name: Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara a controllare la frazione di particelle in scaffold MAP microporosi per colture cellulari 3D. Questo metodo standardizza le proprietà dei materiali e migliora la riproducibilità nell'ingegneria tissutale.

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Gli autori desiderano ringraziare il National Institutes of Health, il National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) e il National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Questo lavoro è stato eseguito in parte presso la Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membro del North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), che è supportato dalla National Science Foundation (numero di premio ECCS-2025064) come parte della National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Gli autori desiderano ringraziare l'ex post-doc del laboratorio Dr. Lucas Schirmer e Ethan Nicklow per la loro assistenza nella generazione del dispositivo stampato in 3D per esperimenti di coltura cellulare.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA e TS hanno depositato un brevetto provvisorio su questa tecnologia.

È stato dimostrato che la produzione microfluidica di microgel HA-NB genera microgel con una gamma più ristretta di distribuzione dimensionale rispetto alla produzione di lotti di emulsione 3,9. I microgel descritti in questo protocollo sono stati formulati utilizzando un reticolante con scissione MMP (AC-GGRDGPQGIWGQDRCG-NH2) per supportare la degradazione del materiale. Tuttavia, i microgel HA-NB possono anche essere reticolati utilizzando un linker ...

Gli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP) sono una sottoclasse di materiali granulari in cui i blocchi di costruzione del microgel (μgel) sono interconnessi per formare un'impalcatura porosa e di massa. Con la microarchitettura unica di questi scaffold granulari, la porosità innata generata dallo spazio vuoto tra microgel sferici interconnessi supporta l'infiltrazione e la migrazione accelerata delle cellule1. Gli elementi costitutivi in microgel degli scaffold MAP possono essere fabbricati da polimeri sia sintetici che naturali con modifiche chimiche2. I metodi qui descritti evidenziano specificamente l'uso di microgel costituiti da una spina dorsale di acido ialuronico (HA) modificata con maniglie funzionali di norbornene (NB). L'impugnatura funzionale NB sul polimero HA supporta le reazioni di chimica dei clic per formare microgel e collegarli insieme per generare scaffold MAP 3,4. Sono stati impiegati numerosi schemi per collegare insieme i microgel (cioè la ricottura), come l'enzima1, laluce 5,6 e le reazioni di chimica a scatto 3,7 senza additivo. La chimica dei clic senza additivi è descritta in questo lavoro, usando la coniugazione Diels-Alder della domanda inversa di elettroni tetrazina-norbornene per interconnettere i microgel HA-NB.
Per fabbricare scaffold MAP, gli utenti generano prima i mattoni del microgel utilizzando emulsioni inverse in sistemi batch o all'interno di dispositivi microfluidici, nonché con spruzzatura elettroidrodinamica, litografia o frammentazione meccanica2. La produzione di microgel sferici HA-NB è stata ben descritta e precedentemente riportata utilizzando sia l'emulsione batch2 che le tecniche di generazione di goccioline microfluidiche 8,9,10,11. In questo lavoro, microgel sferici HA-NB sono stati generati su una piattaforma microfluidica focalizzata sul flusso per dimensioni e forma controllate, come precedentemente descritto 8,9,10. Dopo la purificazione, i microgel esistono in sospensione acquosa e devono essere concentrati per indurre uno stato di inceppamento. Quando sono bloccati, i microgel presentano proprietà di assottigliamento del taglio, che consentono loro di funzionare come materiali iniettabili che riempiono lo spazio1. Un metodo per indurre uno stato inceppato è quello di asciugare i microgel tramite liofilizzazione o liofilizzazione, quindi successivamente reidratare il prodotto essiccato in un volume controllato12. In alternativa, il tampone in eccesso può essere rimosso dal liquame di microgel tramite centrifugazione su un filtro o con rimozione manuale del tampone dal pellet di microgel mediante aspirazione o utilizzando un materiale assorbente. Tuttavia, l'uso della centrifugazione per asciugare i microgel può generare una gamma altamente variabile di frazioni di particelle e frazioni vuote quando si effettuano scaffold granulari12. Sono state descritte tecniche per la liofilizzazione dei microgel utilizzando il 70% di IPA per microgel di polietilenglicole (PEG)13, oli fluorurati per microgel di gelatina metacriloile (GelMa) 14 e etanolo al 70% per microgel HA12. Questo protocollo evidenzia i metodi per la liofilizzazione dei microgel sferici HA utilizzando il 70% di etanolo, un reagente di laboratorio standard, per mantenere le proprietà originali del microgel durante il processo di essiccazione. I microgel di HA liofilizzati possono essere pesati e reidratati a percentuali di peso definite dall'utente per controllare le frazioni finali di particelle negli scaffold MAP12.
La fase finale nella formazione dello scaffold MAP si basa sulla ricottura dei microgel per creare un'impalcatura massiccia e porosa1. Utilizzando componenti nativi della matrice extracellulare e impiegando schemi di ricottura bio-ortogonale, gli scaffold MAP fungono da piattaforma biocompatibile sia per la coltura cellulare in vitro che per la riparazione tissutale in vivo 3. Attraverso questi approcci, gli scaffold MAP possono essere fabbricati da blocchi di costruzione HA-NB con frazioni di particelle definite dall'utente per il loro impiego in applicazioni di ingegneria tissutale12. Il seguente protocollo descrive la produzione microfluidica di microgel HA-NB seguita da liofilizzazione e reidratazione per il controllo della frazione di particelle negli scaffold MAP. Infine, i passaggi per la ricottura dei microgel sono descritti utilizzando la chimica bio-ortogonale per esperimenti di coltura cellulare 3D in vitro .

<table><tbody><tr><td>1 mL siringa Luer-Lok sterile, monouso, policarbonato</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL siringa Luer-Lok sterile, monouso, policarbonato</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimmide</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>Per la sintesi di tetrazina marcata con fluorescenza</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Per la colorazione di campioni di colture cellulari</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia con stantuffo, 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia, 4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato, 23 G 0,5", non sterile, con tappo</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sottovuoto per flaconi, 0,22 &; m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>Per tampone di lavaggio in microgel</td></tr><tr><td>Gruppi capillare-pistone per pipette a spostamento positivo, 1000 &; L volume max.</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>Gruppi pistone capillare per pipette a spostamento positivo, 25 &; L volume max.</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>Gruppi pistone capillare per pipette a spostamento positivo, 250 &; L volume massimo</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess Camera di conteggio delle cellule</td><td>Vetrini Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contatore di cellule automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>cloroformio, grado ACS, bottiglia di vetro</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td> Per la sintesi di una pistola al plasma Corona <td>con tetrazina marcata in fluorescenza</td></tr><tr><td>, generatore ad alta frequenza BD-10A</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>Fiale CryoTube, polipropilene, filettatura interna con tappo a vite</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>cellule mesenchimali di topo D1</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Esempio di linea cellulare per la coltura in gel MAP</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Per la colorazione di campioni di colture cellulari Ossido di</td></tr><tr><td>deuterio, 99,9 atomi% D Sigma-Aldrich</td><td></td><td>151882</td><td>Per spettroscopia NMR</td></tr><tr><td>Tubi per dialisi, membrana in cellulosa rigenerata, 12-14 kDa Cut-off del peso molecolare Spectra</td><td>/Por</td><td>132703</td><td>Per la purificazione di HA-NB e HA-Tet</td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>Per la sintesi di tetrazina marcata con fluorescenza</td></tr><tr><td>Dimetilformammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>Per la sintesi di tetrazina marcata con fluorescenza</td></tr> 4<tr><td>-(4,6-dimetossi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinium chloride (DMTMM)&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>Per modificare l'acido ialuronico</td></tr><tr><td>ditiotreitolo (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>Linker ditiolo non degradabile (sostituto del peptide scissibile MMP)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ad alto contenuto di glucosio, con 4500 mg/L di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>per D1 per coltura cellulare</td></tr><tr><td>EMS Paraformaldeide, granulare</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>Per la produzione di PFA al 4%</td></tr><tr><td>di etanolo assoluto (200 proof)</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Per colture cellulari D1</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Emacitometro con vetro di copertura</td><td>Daigger Scientific</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronato di sodio, peso molecolare medio 79 kDa, prodotto nei batteri Streptococcus zooepidemicus, grado farmaceutico, contaminazione microbica < 100 CFU/g, endotossine batteriche < Per</td> la sintesi di HA-Tet è stato utilizzato un peso molecolare medio di 0,050 UI/mg <td>Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDa, ma questi metodi potrebbero essere adattati per altri pesi molecolari.</td></tr><tr><td>Pacchetto software IMARIS Essentials</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A Software</td> per <td>l'analisi delle immagini per microscopia</td></tr><tr><td>Pompa per infusione, doppia siringa</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Supporto da laboratorio con morsetto da laboratorio di supporto</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>Litio fenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfinato</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzante</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus è stato interrotto, ma per questo protocollo potrebbero essere utilizzati altri liofilizzatori da console di laboratorio.</td></tr><tr><td>Metiltetrazina-PEG4-maleimmide</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>Per la sintesi di tetrazina marcata con fluorescenza</td></tr><tr><td>2-(4-Morpholino)etano Acido solfonico (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Per la modifica</td></tr><tr><td>del vetro di copertura HA Micro, 24 x 60 mm N. 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo microfluidico SU8 master wafer</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Design personalizzato realizzato internamente in camera bianca o olio minerale esternalizzato</td></tr><tr><td>,</td> pesante <td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP-cleavable ditiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norbornene-2-metilammina</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>Per sintesi HA-NB</td></tr><tr><td>Nastro da imballaggio</td><td>Scotch</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(tiolo)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>Per la sintesi di tetrazina marcata con fluorescenza</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, 10.000 unità/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td>Per colture cellulari D1</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, polistirene, monouso, Diametro x H=150 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Per il lavaggio di HMP</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trattamento del vetro idrorepellente RainX</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>Soluzione sintetica per il trattamento di dispositivi microfluidici</td></tr><tr><td>Peptide RGD (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Elastici</td><td>Graffe</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>Per dialisi</td></tr><tr><td>Span 80 per sintesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomero siliconico Microscopia</td><td>elettronica Scienza</td><td>4019862</td><td>elastomero polidimetilsilossano (PDMS) per la realizzazione di dispositivi microfluidici e dispositivi per la coltura dei tessuti</td></tr><tr><td>Filtro per siringa, Whatman Uniflo, 0,2 &mu; m PES, diametro 13 mm</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio digitale LCD Tetraview</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazina-ammina HCl sale</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>Per la sintesi di HA-Tet</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>Per la sintesi di tetrazina marcata con fluorescenza</td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-200-056</td><td>Per il sollevamento di cellule aderenti al seme in gel MAP</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 Tubo medico non DEHP, calibro dell'ago = 23, spessore della parete = 0,020 pollici, diametro interno = 0,020, esterno diametro = 0,060 in</td><td>controller del</td> sistema di polimerizzazione UV Thomas Scientific <td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>, LX500 LED&nbsp;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>Testa di polimerizzazione UV, spot LED UV</td><td>OmniCure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di luce UV, essiccatore sottovuoto tracciabile</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto serie Z Coltello multiuso</td><td>di precisione Elmer's</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3d

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

I microgel sono gli elementi costitutivi degli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP), che fungono da piattaforma sia per la coltura cellulare in vitro che per la riparazione dei tessuti in vivo . In questi scaffold granulari, la porosità innata generata dallo spazio vuoto tra i microgel consente l'infiltrazione e la migrazione cellulare. Il controllo della frazione di vuoto e della frazione di particelle è fondamentale per la progettazione dello scaffold MAP, poiché la porosità è un segnale bioattivo per le cellule. I microgel sferici possono essere generati su un dispositivo microfluidico per dimensioni e forma controllate e successivamente liofilizzati utilizzando metodi che impediscono la fratturazione della rete polimerica. Dopo la reidratazione, i microgel liofilizzati portano a frazioni di particelle controllate negli scaffold MAP. L'implementazione di questi metodi per la liofilizzazione dei microgel ha portato a studi riproducibili che mostrano l'effetto della frazione particellare sulla diffusione delle macromolecole e sulla diffusione cellulare. Il seguente protocollo coprirà la fabbricazione, la liofilizzazione e la reidratazione di microgel per il controllo della frazione di particelle negli scaffold MAP, nonché la ricottura dei microgel attraverso la reticolazione bio-ortogonale per la coltura cellulare 3D in vitro.

Lo scopo di questo protocollo è dimostrare la preparazione di scaffold di particelle ricotto microporose (MAP) con uno schema di reticolazione bio-ortogonale e frazioni di particelle controllate per la coltura cellulare 3D. In primo luogo, l'HA è stato modificato con gruppi pendenti norbornene da utilizzare sia nella formazione di microgel che nell'interconnessione per formare scaffold MAP. Utilizzando questi metodi, circa il 31% delle unità ripetute HA sono state modificate con successo con una maniglia funzionale norbo...

Ridurre al minimo la variabilità della frazione di particelle all'interno di scaffold granulari facilita la sperimentazione riproducibile. Questo lavoro descrive i metodi per generare scaffold granulari con frazioni di particelle controllate per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro .

Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

I materiali granulari, come gli scaffold MAP, sono materiali iniettabili porosi costituiti da particelle di idrogel di dimensioni micro interconnesse. Il controllo della frazione di particelle è fondamentale per le proprietà dei materiali e le risposte cellulari. Le frazioni di particelle variabili negli scaffold MAP determinano una serie di proprietà dello scaffold e risposte delle celle, ma questa tecnica consente agli utenti di definire la frazione finale di particelle negli scaffold MAP che creano.Gli scaffold MAP possono essere utilizzati per promuovere la riparazione e la rigenerazione di ferite complesse, nonché per somministrare farmaci. La frazione di particelle, ad esempio, influenza la velocità e il grado di infiltrazione e rigenerazione cellulare. Questo metodo può essere applicato a tutte le classi di idrogel granulari.Ora che possiamo realizzare scaffold MAP con frazioni di particelle controllate dall'utente, possiamo studiare in modo riproducibile la bioattività di questi materiali e studiare risposte cellulari uniche, come il confinamento. L'impostazione della generazione di microgel microfluidici richiede tempo e pazienza mentre si imparano le tecniche. È meglio avere più dispositivi preparati e pronti nel caso in cui si verifichino problemi con la configurazione.Inizia con la produzione microfluidica di acido ialuronico, o HA, e Norbornene, o NB, microgel. Prima di asciugare i microgel, pesare un tubo con tappo a vite crio-sicuro. Quindi, in una cappa sterile, trasferire i microgel lavati e purificati in un tubo con tappo a vite criogenico utilizzando una pipetta a spostamento positivo.Aggiungere il 70% di etanolo ai microgel purificati e mescolare bene. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 5.000 g. Aspirare il surnatante e aggiungere il 70% di etanolo.Mescolare bene e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare brevemente per assicurarsi che i microgel siano sul fondo del tubo. Aggiungere azoto liquido a un contenitore criogenico e posizionare il tubo di microgel per congelare il flash.Dopo cinque o 10 minuti, rimuovere il tubo di microgel con una pinza. Rimuovere rapidamente il cappuccio e coprire il tubo con tessuto di laboratorio. Fissare il tessuto con un elastico e trasferirlo in un contenitore di liofilizzazione o in una camera.Caricare il campione sul liofilizzatore seguendo le istruzioni del produttore e liofilizzare a 0,066 Torr e meno 63 gradi Celsius. Pesare i microgel liofilizzati dal tubo prima di conservarli a temperatura ambiente. Mescolare polidimetilsilossano o base di elastomero PDMS con l'agente di polimerizzazione con un rapporto di 10 a uno in massa.Versare la miscela PDMS in una grande capsula di Petri di plastica e degassare nell'essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle sono scomparse. Una volta che tutte le bolle sono scomparse, posizionare con attenzione lo stampo stampato in 3D nel PDMS per ridurre al minimo la formazione di nuove bolle. Mettere in forno a 60 gradi Celsius per due ore per polimerizzare il PDMS.Dopo la polimerizzazione, utilizzare un coltello o una lama di rasoio per tracciare delicatamente il perimetro del dispositivo di coltura e rimuovere con cura lo stampo. Utilizzare un pugno bioptico di quattro millimetri per rimuovere qualsiasi PDMS dal fondo dei pozzetti. Tagliare i dispositivi per adattarli a una vetrina.Utilizzare del nastro adesivo per rimuovere la polvere dal lato inferiore del dispositivo di coltura. Posizionare il vetrino di copertura in vetro pulito e il dispositivo di coltura su una piastra calda a 135 gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere l'umidità. In una cappa aspirante, utilizzare una pistola al plasma corona in alto sul vetrino di copertura e sul lato inferiore del dispositivo per 30 secondi.Quindi incollare rapidamente le superfici trattate. Applicare delicatamente una pressione per garantire una buona tenuta tra il dispositivo di coltura e la slitta di copertura in vetro. Posizionare il dispositivo in un forno a 60 gradi Celsius durante la notte per fissare il legame.Il giorno seguente, autoclavare il dispositivo per sterilizzare prima dell'uso in vitro. Quindi, preparare la particella ricotto microporosa, o componenti dello scaffold MAP, in base alla frazione di particelle desiderata per la coltura cellulare negli scaffold MAP. Pesare microgel liofilizzati per determinare la massa dei microgel.Quindi ricostituire i microgel nell'84% del volume MAP finale dei mezzi cellulari in base alla percentuale di peso MAP scelta. Lasciare gonfiare i microgel per 20 minuti. Sciogliere l'acido ialuronico, o HA-tetrazina, e i supporti cellulari nel 16% del volume finale di MAP.Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza desiderata, sollevare e contare le cellule. Trasferire 10.000 cellule per microlitro MAP in un nuovo tubo. Centrifugare le cellule e aspirare il surnatante dal pellet senza aspirare le cellule.Aggiungere microgel e reticolante al pellet utilizzando una pipetta di spostamento. Mescolare bene e seminare 10 microlitri per pozzetto. Pipettare con un movimento circolare per distribuire uniformemente la miscela nel pozzetto.Lasciare ricottura dei microgel a 37 gradi Celsius per 25 minuti prima di aggiungere mezzi cellulari per riempire i pozzetti. Mantenere le culture 3D a 37 gradi Celsius e modificare i supporti in base alle esigenze. Per evitare di aspirare l'impalcatura, stabilizzare la punta della pipetta lungo la cresta del pozzetto superiore.Nei punti temporali desiderati, fissare i campioni sostituendo il mezzo con 50 microlitri di paraformaldeide al 4% per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i campioni tre volte con 50 microlitri di PBS, o tampone preferito, e procedere per l'immunofluorescenza o la colorazione a fluorescenza utilizzando 50 microlitri per pozzetto del volume di lavoro. È stato dimostrato che i dispositivi microfluidici con una regione di focalizzazione del flusso producono microgel HA-NB di 50 o 100 micron di diametro.Il mezzo per la liofilizzazione dei microgel è stato ottimizzato per ridurre al minimo la formazione di criogel utilizzando il 70% di etanolo. Tuttavia, altri mezzi, come l'alcol isopropilico, l'acqua e l'acetonitrile possono essere utilizzati in modo intercambiabile per facilitare la formazione di criogel. Per facilitare l'interconnessione bio-ortogonale dei microgel HA-NB è stato sintetizzato un cross-linker lineare HA-tetrazina.La spettroscopia NMR protonica mostra una modifica riuscita dell'11% delle unità ripetute HA con un gruppo pendente tetrazina. Il prodotto microgel liofilizzato essiccato è stato reidratato con volumi speciali e ricotto per ottenere diverse formulazioni percentuali di peso di microgel in scaffold MAP. Queste percentuali di peso di microgel negli scaffold MAP corrispondevano a frazioni di particelle uniche.La coltura cellulare negli scaffold MAP è mostrata qui. Le cellule in coltura 3D negli scaffold MAP sono state fissate il quinto giorno, colorate e visualizzate su un microscopio confocale. Le singole fette Z mostrano differenze nella crescita cellulare e scaffold che comprendono diversi MAP percentuali di peso.Selezionare il terreno di liofilizzazione in modo appropriato a seconda che si desideri criogel o meno. Non saltare le fasi di incubazione, in modo che i microgel abbiano tempo sufficiente per gonfiarsi nei media. Tecniche standard come microscopia, citometria a flusso, sequenziamento dell'RNA e altro possono essere utilizzate per valutare le risposte cellulari all'interno di questi materiali granulari con porosità definite.

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Bioingegneria

Vi presentiamo due processi per la microfabbricazione di chip polimerici porosi tridimensionali coltivazione delle cellule. Il primo è goffratura a caldo combinato con un solvente processo di saldatura vapore. La seconda utilizza un processo recentemente sviluppato microthermoforming combinata con la tecnologia agli ioni di pista che porta ad una significativa semplificazione di fabbricazione.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel possono essere incorporati in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate. Le impalcature self-reporting prodotti possono essere utilizzati per il monitoraggio in situ delle condizioni microambientali mentre coltura di cellule sul patibolo. Questo è vantaggioso in quanto il costrutto cellulare 3D può essere monitorato in tempo reale senza disturbare l'esperimento.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Questo articolo descrive una serie di configurazioni per la semina di cellule staminali mesenchimali umane su materiali, in questo caso filati elettrofilati, che non coprono la base delle piastre standard dei pozzetti di coltura al fine di massimizzare e quantificare il numero di cellule che si attaccano inizialmente rispetto alla densità di semina nota.

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

I progressi nelle tecnologie dei biomateriali consentono lo sviluppo di costrutti tridimensionali di tipo multicellulare. Abbiamo sviluppato protocolli di elettrofilatura per produrre tre scaffold individuali per coltivare le principali cellule strutturali delle vie aeree per fornire un modello 3D in vitro della parete dei bronchioli delle vie aeree.

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

Presentiamo una procedura per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere una formazione di reticolo ripetibile. Un dispositivo cubico contenente due diversi idrogeli è impiegato per realizzare multi-direzionale imaging per la formazione del reticolo di tessuto.

Controllo del Cluster iniziale delle cellule 3D in un ibrido Gel cubo dispositivo per reticolo ripetibile formazioni

Le barre di microgel con gruppi reattivi complementari sono prodotte tramite microfluidica con la capacità di interlegarsi in soluzione acquosa. I microgel anisometrici si inceppano e si interconnettono in costrutti stabili con pori più grandi rispetto ai sistemi basati su sferiche. Microgel modificati con GRGDS-PC formano costrutti 3D macroporosi che possono essere utilizzati per la coltura cellulare.

Scaffold 3D macroporosi interconnessi da barre di microgel

Questo protocollo descrive una serie di metodi per sintetizzare i mattoni del microgel per lo scaffold di particelle ricotto microporoso, che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni di medicina rigenerativa.

Sintesi microfluidica di blocchi costitutivi in microgel per scaffold di particelle ricotto microporose

Questi i dettagli del lavoro per la preparazione di fibrina scaffold 3D per la coltura e differenziazione delle cellule staminali plutipotent. Tali ponteggi può essere usata per selezionare gli effetti di vari composti biologici sul comportamento cellule staminali nonché modificata per contenere sistemi di drug delivery.

Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è usato per visualizzare le immagini appaiate di micro particelle seminate nei flussi di sangue, che sono cross-correlato per dare un profilo di velocità accurato. Shear rate, velocità massima, forma del profilo di velocità e portata, ognuno dei quali ha applicazioni cliniche, possono essere derivati ​​da queste misurazioni.

Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue

Impara a controllare la frazione di particelle in scaffold MAP microporosi per colture cellulari 3D. Questo metodo standardizza le proprietà dei materiali e migliora la riproducibilità nell'ingegneria tissutale.

Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D

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